La drépanocytose est une maladie génétique caractérisée par la présence d’une hémoglobineanormale. Les travaux de cette thèse visaient à caractériser les fonctions micro-et macrovasculaires chezles enfants atteints de la drépanocytose SS et SC et ses conséquence sur la sévérité clinique. Nosrésultats, réalisées sur une cohorte pédiatrique antillaise, démontrent que les fonctions micro-etmacrovasculaires étaient altérées chez les enfants drépanocytaires homozygotes (SS) et chez les enfantsSC par rapport aux enfants non malades. Ainsi il semble que les patients drépanocytaires présentent, etce dès le plus jeune âge, une défaillance vasculaire marquée. Plusieurs facteurs semblent être impliqués :(1) l’activation endothéliale chronique, (2) la faible biodisponibilité en monoxyde d’azote causée parl’installation d’un état de stress oxydatif et nitrosatif chronique, (3) l’altération du système nerveuxautonome avec un risque vasoconstricteur (4) la défense anti-oxydante sur-sollicitée et (5) le faible niveaud’activité physique. En outre, nos résultats indiquent que la dysfonction vasculaire était plus sévère chezles enfants SS comparé aux enfants SC. Le faible taux d’hémolyse et le moindre stress oxydatif,pourraient expliquer la meilleure fonction vasculaire chez les enfants SC. Cette interaction entre stressoxydatif et hémolyse semble jouer un rôle clefs dans le cercle vicieux de la physiopathologiedrépanocytaire. Dans cette cohorte pédiatrique, le degré de dysfonction vasculaire ne semble pasmoduler la sévérité clinique. Cependant une dysfonction vasculaire plus développée a probablement desconséquences néfastes sur la sévérité clinique dans la drépanocytose. / Sickle cell disease is the most common genetic disease in the West Indies that affectshemoglobin. Because of considerable heterogeneity in clinical outcomes, its complex pathophysiology isstill not totally understood. For many decades it was widely assumed that blood disorders were the solecause of vaso-occlusion. More recently blood vessel dysfunction also seem to be involved. But it isunclear whether vascular function is affected similarly in children with sickle cell anaemia (SS) and childrenwith sickle haemoglobin C (SC) disease. This study with a cohort of Guadeloupean children demonstratedthat microvascular reactivity is impaired already in sickle cell SS and SC children compared to healthychildren. Divers biological and physiological analysis revealed that there are many interacting factors, all ofwhich may contribute to vasculopathy: (1) chronic endothelial stress due to elevated blood flow level, (2)reduced nitric oxide bioavailability due to chronic hemolysis and oxidative stress, (3) altered autonomicnervous system activity with increase risque in vasoconstrictor activity, (4) saturated antioxidant activityand (5) limited physical activity known to improve vascular function. In this children cohort, vascularimpairments were not associated to clinical severity. However vascular dysfunction seems to beexacerbated in SS. Mild haemolysis in SC, compared to SS, may limit oxidative and nitrosative stress andcould explain the better preserved microvascular function in this group. Learning more about the progressof vascular dysfunction in sickle cell disease seems to be essential. In advanced state it may possibleseriously worsen clinical severity.

Le monoxyde d'azote (NO) est formé à partir de L-arginine par la famille des NO synthases. La dysrégulation de la synthèse de cette molécule de signalisation cellulaire est impliquée dans le développement d'un grand nombre de pathologies. Les effets cellulaires du NO sont en partie dus à une inhibition des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale. Nous nous sommes intéressés aux effets du NO sur la régulation de l'oxydation phosphorylante et de le transition de perméabilité, deux processus mitochondriaux gouvernant la survie cellulaire. Nous avons ainsi démontré que l'inhibition de la cytochrome c oxydase (COX) par le NO était associée à une inhibition de la respiration et de la synthèse d'ATP. Cependant le NO augmente l'efficacité de l'oxydation phosphorylante (ATP/O) en diminuant le processus de « slipping ». Toutefois, notre travail a mis en exergue un effet du NO dépendant du substrat utilisé. En présence de NADH seul, le NO n'a pas l'effet bénéfique sur le rendement de l'oxydation phosphorylante, obtenu avec le FADH2 seul ou associé au NADH. L'étude de l'état d'oxydoréduction des cytochromes de la COX a révélé que dans les mitochondries énergisées avec du FADH2 seul ou en association avec le NADH, les cytochromes aa3 sont plus réduits qu'en présence de NADH seul. Nous pouvons suggérer que le « slipping » au niveau de la COX soit dépendant de l'état d'oxydoréduction de ses cytochromes. Le NO pourrait donc être un régulateur physiologique du processus d'oxydation phosphorylante. Nous avons également cherché à étayer l'hypothèse selon laquelle l'inhibition du complexe I aurait un effet anti-apoptotique en inhibant l'ouverture du PTP et la libération de cytochrome c. Le NO ayant un effet sur la chaîne respiratoire dans sa globalité, nous n'avons pu certifier que son effet activateur sur l'ouverture du pore soit dû à l'inhibition d'un complexe en particulier. Il semble que le phénomène de transition de perméabilité soit sensible à l'inhibition du complexe II. L'inhibition du complexe II par un inhibiteur comme le TTFA ou le malonate aurait un effet pro-apoptotique et ce malgré la présence d'inhibiteurs puissants du PTP comme la ciclosporine. Ces résultats suggèrent que le complexe II ferait partie des complexes protéiques régulateurs du PTP et que son inhibition soit dominante sur l'effet induit par l'inhibition du complexe I.

L'altération de la fonction endothéliale vasculaire est un phénomène précoce et central dans la pathogenèse de l'athérosclérose. Chez l'homme sain, un repas trop gras et trop sucré induit un ensemble de désordres vasculaires postprandiaux dont les voies de signalisation restent encore méconnues. Par ailleurs, si certains acides aminés participent à l'homéostasie vasculaire, aucune étude n'a examiné les effets d'une modulation de la nature des protéines d'un repas sur les fonctions endothéliales vasculaires. Afin de préciser l'implication des voies de signalisation du monoxyde d'azote (NO), molécule clé dans l'homéostasie vasculaire, et d'étudier les composantes de la réponse inflammatoire postprandiale, nous avons cherché à caractériser, chez le rat sain, les principaux paramètres de la dysfonction endothéliale induite par un repas riche en acides gras saturés et en saccharose. Nous avons ensuite examiné le potentiel des protéines de colza, naturellement riche en arginine et en cystéine, précurseurs respectifs du NO et du glutathion, à moduler la dysfonction endothéliale postprandiale. De ce travail de thèse s'est dégagé un solide modèle animal de dysfonction endothéliale postprandiale caractérisée par une diminution de la réactivité vasculaire NO-dépendante, une inflammation à bas bruit et du stress oxydant. Ces évènements postprandiaux délétères étaient associés à une diminution de la production corps-entier du NO et une activation de NF-κB au niveau du tissu adipeux viscéral. Enfin, nous avons montré que les protéines de colza, à des doses nutritionnelles, réduisait le stress oxydant, et prévenait complètement l'altération de la réactivité vasculaire NO-dépendante induits par l'ingestion d'un repas hyperlipidique. Cet effet protecteur des protéines de colza, nous invite à envisager, chez l'homme, la modulation de la nature des protéines d'un repas comme une véritable approche nutritionnelle de prévention du risque cardiovasculaire.

Reproduction de : Habilitation à diriger des recherches : Sciences naturelles : Lille 1 : 2005. / Synthèse des travaux en français. Articles en anglais non reproduits dans la version électronique. N° d'ordre (Lille 1) : 491. Curriculum vitae. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. p. 99-111. Liste des publications et des communications.

Les études entreprises depuis une douzaine d'années indiquent que le monoxyde d'azote (NO) est un médiateur physiologique impliqué dans de nombreux processus chez les plantes, incluant la germination, le développement des racines, la fermeture des stomates ou encore la réponse adaptative aux stress biotiques et abiotiques. Malgré cet important panel de fonctions, les mécanismes sous-jacents aux effets du NO ont été peu appréhendés et restent pour l'essentiel énigmatiques. Le travail présenté dans ce manuscrit s'inscrit dans cette problématique et a consisté en l'identification et la caractérisation de protéines cibles du NO chez le tabac dans le contexte de stress biotiques et abiotiques. Nous avons démontré que la cryptogéine, un éliciteur des réactions de défense, induit la S-nitrosylation rapide et transitoire de plusieurs protéines dans des suspensions cellulaires de tabac. Après purification, une douzaine de ces protéines ont été identifiées via une analyse par spectrométrie de masse. Celles-ci incluent notamment une protéine chaperonne de la famille des AAA-ATPase nommée CDC48 (Cell Division Cycle 48). Cette dernière a fait l'objet d'une étude structure/fonction approfondie afin d'appréhender l'impact de sa S-nitrosylation. Après avoir vérifié que la protéine recombinante était S-nitrosylable in vitro, nous avons démontré que ce processus n'affecte pas la structure secondaire de la protéine mais induit des modifications locales de sa structure tertiaire et une inhibition de son activité ATPasique. Le résidu cystéine 526, localisé dans le second domaine ATPasique de la protéine, a été identifié comme site probable de S-nitrosylation. Cette localisation stratégique pourrait expliquer l'effet inhibiteur du NO sur l'activité enzymatique de CDC48. La dernière partie de ce travail a été centrée sur l'analyse des mécanismes par lesquels le NO active la protéine kinase NtOSAK (Nicotiana tabacum stress activated protein kinase) chez le tabac. Nous avons démontré que NtOSAK forme un complexe constitutif avec la glycéraldéhyde 3 phosphate deshydrogénase (GAPDH). En réponse à un stress salin, le NO promeut l'activation de NtOSAK via la phosphorylation de deux résidus serine localisés dans la boucle d'activation de l'enzyme. De plus, il induit une S-nitrosylation rapide de la GAPDH, ce processus n'affectant pas la formation du complexe. Notre hypothèse est que ce complexe constituerait une plateforme de signalisation régulée par le NO et pouvant recruter les protéines cibles de NtOSAK lors de la réponse au stress salin.

Les émissions de monoxyde d'azote (NO) sont observables sur toutes les planètes telluriques entourées d'une atmosphère. Sur Vénus, ces émissions ont été identifiées en 1979. Elles sont classiquement observables dans l'ultraviolet, entre 180 et 300 nm, mais il est également possible de les détecter en infrarouge entre 1,2 et 1,3 μm. L'émission aéronomique du NO est due à un processus de recombinaison radiative se produisant du côté nuit de la planète. L'atmosphère de Vénus est composée essentiellement de CO2 et de N2 et côté jour, les radiations solaires cassent ces molécules et libèrent des atomes d'azote et d'oxygène. Dans la haute atmosphère, au-dessus de 100 km, les vents zonaux transportent ces atomes vers le côté nocturne où ils se recombinent pour former du NO et émettent alors un rayonnement ultraviolet. L'émission aéronomique du NO est ainsi un bon traceur de cette circulation sub-solaire/anti-solaire. La mission Venus Express, actuellement en orbite autour de Vénus, possède à son bord l'instrument SPICAV, un spectromètre capable d'observer les émissions de NO dans l'ultraviolet. Les travaux de cette thèse se basent sur les observations SPICAV réalisées en mode d'occultation stellaire. Ce jeu de données, sur lequel les émissions de NO apparaissent, permet d'agrandir la base de données sur cette émission aéronomique et permet une approche complémentaire des observations au limbe. Le travail a consisté à établir deux méthodes d'inversion de ces émissions de NO. La première méthode, appelée modèle direct, est une simulation de ce que nous devons observer avec SPICAV en occultation stellaire. La seconde méthode, nommée algorithme d'inversion, est une inversion matricielle des données. Chaque méthode aboutit aux caractéristiques de la couche de NO présente dans l'atmosphère de Vénus. Nos résultats permettent de mieux contraindre le contexte dynamique de l'atmosphère vénusienne, aux altitudes supérieures à 100 km.

Depuis plusieurs décennies, la médecine constate une augmentation des pathologies prolifératives, de surcharge lipidiques et neurodégénératives. Les maladies métaboliques sont les plus fréquentes, insulinorésistance, diabètes de type 2 ou encore obésités pathologiques. Il est évident que ces pathologies sont d'origine multifactorielle. Une cause environnementale est de plus en plus fréquemment évoquée, comme facteur causal ou comme facteur aggravant. Ces dernières décennies ont vu une inflation de d'utilisation des produits phytosanitaires dans des usages industriels ou agricoles. Ces xénobiotiques sont suspectés de favoriser les pathologies dites "environnementales". Il apparaît que même les doses faibles de ces produits induisent des effets métaboliques. Nous avons étudié l'effet de 2 organochlorés, le lindane et le chlordécone, sur la fonction mitochondrial et le métabolisme énergétique cellulaire. Cette étude a été menée sur des cellules HepG2, et des durées courtes avec des doses correspondant aux concentrations plasmatiques moyennes retrouvées dans les zones d'exposition. Ces molécules pesticides induisent un stress mitochondrial qui semble se résoudre sur une durée courte. Pourtant certaines perturbation des régulations métaboliques mitochondriales et du dialogue nucléo-mitochondrial perdurent sur des durées plus longues. Il en va ainsi de l'expression des facteurs régulateurs, anomalies favorisant des dysfonctionnements cellulaires pouvant être à l'origine de maladies "environnementales". Nous proposons que l'analyse de la fonction mitochondriale pourrait être une approche intéressante pour l'étude des effets toxiques des faibles doses de xénobiotiques.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La résistance à l' insuline du muscle squelettique se situe au niveau des étapes subséquentes à la liaison de l'hormone à son récepteur. L' origine de la résis'tance à l'insuline n est pas identifiée avec précision, bien que l'on sache qu'une association de plusieurs facteurs en soit responsable. Parmi ces facteurs de risque, nous avons identifié la synthase inductible du monoxyde d'azote (NO). Cette enzyme (iN OS) a la particularité de produire de fortes concentrations de NO e'n réponse à divers stimuli inflammatoires. Les études présentées dans cette thèse perniettent de mieux comprendre l' implication de cette enzyme dans la résistance à l' insuline ainsi que les mécanismes d'action via lesquels le NO inhibe 1 action de l' insuline. Dans la première étude, nous avons confirmé dans un modèle cellulaire de muscles la capacité de iNOS à causer un défaut du transport du glucose en réponse à l'insuline. Nous avons toutefois également observé que les adipocytes ne développaient pas ce défaut suite à l' induction de l'enzyme. Dans une seconde étude, nous avons cherché à comprendre le mécanisme par lequel la production de NO pouvait être reliée à la résistance à l' insuline. Nous avons montré que la génération d'un oxydant découlant de la synthèse de NO, le peroxynitrite (ONOO-), causait la nitration de tyrosine de la molécule IRS-l et ainsi interfère dans la cascade des étapes de signalisation de l' insuline. Dans une troisième étude, nous avons démontré que l'incubation de muscles in vitro causait des altérations dans la captation de glucose via l' induction de iNOS causée par le procédé d' incubation. Finalement, dans une quatrième étude, nous proposons un mécanisme d'inhibition de iNOS pouvant être mis à profit dans la recherche de cibles thérapeutiques contre la résistance à l' insuline. Nous avons démontré que l'activati.on de la kinase sensible à l'AMP (AMPK) réduisait l' induction de iNOS, tant au niveau cellulaire (myocytes, adipocytes et macrophages) que dans les muscles et le tissu adipeux de rats traités à la lipopolysaccharide (LPS). L' ensemble de nos études précise l'implication de iNOS dans la résistance à l' insuline associée à l'inflammation et oriente la recherche vers de nouvelles pistes et un certain nombre d'applications thérapeutiques.

La présence d’un récepteur de type RXR a récemment été rapporté chez la pensée de mer, Renilla koellikeri, de même que chez d’autres anthozoaires, et le NO semble jouer des différents rôles physiologiques, chez plusieurs cnidaires. L’acide rétinoïque (AR) et le monoxyde d’azote (NO) sont connus pour leur implication dans l’induction de la croissance des neurites chez les vertébrés ainsi que chez les invertébrés. Mais jusqu’à présent, aucun rôle de ces agents n’a encore été identifié chez ce phylum ancien des invertébrés. Dans le but de montrer que ces agents morphogénétiques ont un rôle dans le développement neuronal chez ces ancêtres des métazoaires bilatéraux, nous avons utilisé des cultures primaires de cellules du cnidaire anthozoaire Renilla koellikeri (pensée de mer), doté d’un système nerveux des plus primitif. Nous avons trouvé que les deux types d’acide rétinoïque, 9-cis et 11-trans, induisent une prolifération cellulaire dose-dépendante en fonction du temps dans les boîtes de pétri enduites de polylysine. Les cultures cellulaires exposées à l’acide rétinoïque dans les boîtes sans polylysine montrent une différenciation en des cellules épithéliales. D’autre part, le NO induit exclusivement une différenciation neuronale dans les boîtes enduites de polylysine. Aucun autre type de cellules subit un différenciation en présence de NO et la densité des cellules dédifférenciées a diminué. Les prolongements des neurones différenciés semblent s’enchevêtrer et former un réseau neuronal assez dense. L’ensemble de ces observations suggère que l’acide rétinoïque, contrairement à NO, est associé à l’activité mitotique, et que l’acide rétinoïque et le NO sont impliqués différemment dans la spécification cellulaire, respectivement épithéliale et neuronale, chez la pensée de mer. Le type d’action déclenchée, qu’il soit la mitogénèse ou la différenciation (épithéliale ou neuronale), varie alors selon l’état d’adhésion des cellules au substrat. Comme les données moléculaires et paléontologiques rapprochent les cnidaires, telle la pensée de mer, des ancêtres des eumétazoaires, nos résultats suggèrent que le rôle morphogénétique de l’acide rétinoïque et du NO est enraciné dans l’ancêtre commun de tous les métazoaires. / Retinoic acid receptors were recently reported in the sea pansy, Renilla koellikeri, and in other anthozoans, and NO seems to play various roles in several cnidarians. Retinoic acid (RA) and nitric oxide (NO) are known for their implication in inducing neurite outgrowth in both vertebrates and invertebrates. But so far, no role of these agents has been identified in this basal metazoan phylum. In order to show that these agents have a morphogenetic role in neuronal development in the ancestors of bilateral metazoan. We used primary cultures of cells from the cnidarian anthozoan Renilla koellikeri (sea pansy), with the most primary nervous system. We found that both 9-cis and 11-trans retinoic acid induced cell proliferation in dose- and time-dependant manners in petri dishes coated with polylysine. Cell cultures exposed to retinoic acid in dishes devoid of polylysine were observed to differentiate into epithelial cells. On the other hand, NO induced extensive neurite outgrowth in polylysine-coated culture dishes. No other celle type underwent differentiation in the presence of NO, and the density of dedifferentiated cells was reduced. The neurites of the differentiating neurons appeared to intertwine and form a loose nerve net. These observations suggest that retinoic acid, but not NO, has mitogenic activity, and that retinoic acid and NO are differentially involved in nerve cell specification in the sea pansy. The type of action, mitogenesis or cell differenciation (epithelial or neural), depends on the degree of cell adhesion to substrate. As both molecular and paleontological evidence place cnidarians such as the sea pansy closest to the eumetazoan ancestor, our results suggest that the morphogenetic role of retinoic acid and NO was rooted in the commun ancestor of all metazoans.