Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 118-127. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

L’obésité est une pathologie complexe d’origine multifactorielle qui constitue un facteur de risque indépendant de maladies métaboliques dont le diabète de type 2. L’inflammation chronique qui accompagne l’obésité semble d’ailleurs contribuer au développement de la résistance à l’insuline. Ainsi, il a été montré que l’induction de iNOS, enzyme importante lors des réponses immunitaires, dans les tissus et cellules cibles de l’insuline était impliquée dans la pathogenèse de la résistance à l’insuline associée à l’obésité. Les résultats présentés dans cet ouvrage permettent d’approfondir les connaissances concernant l’implication de cette enzyme dans les troubles métaboliques ainsi que d’identifier des cibles cellulaires potentielles pouvant servir à contrecarrer les effets délétères associés à celle-ci. Dans la première étude, nous avons observé que le resvératrol pouvait inhiber l’induction de iNOS et la production de NO dans le muscle et le tissu adipeux des souris traitées avec l’endotoxine LPS. Ces effets ont été reproduits dans des modèles in vitro. Nous avons pu également déterminer que l’inhibition de iNOS par le resvératrol impliquait l’activation de la voie de l’AMPK plutôt que celle de SIRT1 dans les cellules musculaires. Dans la deuxième étude, nous avons généré des souris MYOnos2-KO, HEPnos2-KO et ADPnos2-KO, modèles dans lesquels l’expression de iNOS est invalidée spécifiquement dans les myocytes striés, les hépatocytes et les adipocytes respectivement. Nous avons pu remarquer que l’invalidation de iNOS dans les myocytes, les hépatocytes et les adipocytes ne semble pas suffire à contrer les effets délétères d’une diète obésogène sur la sensibilité à l’insuline ou la tolérance au glucose. Par contre, l’invalidation de iNOS dans les adipocytes semble améliorer le métabolisme lipidique. Finalement, dans notre troisième étude, nous avons pu démontrer que iNOS pouvait être induite dans des cellules adipeuses d’origine humaine et que l’expression de cette enzyme, dans le tissu adipeux, corrélait négativement avec les niveaux d’adiponectine plasmatique chez les sujets de la cohorte étudiée. L’ensemble de nos études nous permet de proposer des cibles plus spécifiques visant l’inhibition de iNOS ainsi que de contribuer à la compréhension du rôle potentiel de cette protéine dans le développement des troubles métaboliques chez l’homme. / Obesity is a complex pathology, with a multifactorial origin, as well as an independent risk factor for metabolic diseases such as type 2 diabetes. It has been suggested that obesity-associated chronic inflammation contributes to the development of insulin resistance. It has been shown that iNOS, an important enzyme involved in immune responses, has been implicated in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance. Results presented here contribute to better understand the implication of this enzyme in metabolic disorders and thus identify potential cellular targets that might counteract deleterious effects associated with its induction. In the first study, resveratrol was shown to inhibit iNOS induction as well as NO production in muscle and adipose tissue of LPS-treated mice. These effects were recapitulated in vitro. We have also demonstrated that iNOS inhibition by resveratrol involves AMPK but not SIRT1 activation in muscle cells. In the second study, we generated MYO-nos2-KO, HEPnos2-KO and ADPnos2-KO mice, where iNOS expression was specifically invalidated in myocytes, hepatocytes and adipocytes respectively. We have observed that iNOS deletion in myocytes, hepatocytes and adipocytes was not sufficient to counteract obesogenic-diet deleterious effects on insulin sensitivity and glucose tolerance. However, iNOS specific deletion in adipocytes seems to improve lipid metabolism. In our third chapter, we have shown that iNOS could be induced in adipose cells of human origin and that its expression in adipose tissue, was negatively correlated with plasma adiponectin levels of the subjects of the study. Overall, our results allow us to propose more specific targets where iNOS inhibition might be beneficial. Likewise, the results presented here contribute to the understanding of the potential role of this protein in the development of human metabolic disorders.

L'oxyde nitrique (NO), un important messager biologique, est biosynthétisé par une hémoprotéine nommée Oxyde Nitrique Synthase (NOS). Il est produit par une réaction d'oxydation du groupement guanidino de la L-arginine en Nm -hydroxy-L-arginine, qui est ensuite elle-même oxydée en NO et en L-citrulline. Chez les mammifères, deux types de complexes oxygénés formés durant la catalyse par les NOS ont été identifiés: hème-oxy 1 (Bande de Soret centrée à 420 nm) et hème-oxy 2 (Bande de Soret centrée à 430 nm). On sait que hème-oxy 2 possède un caractère ferrique superoxyde (Fe -O2"), puisqu'il a déjà été caractérisé en spectroscopie de résonance Raman. Cependant, peu d'informations sont connues sur le complexe hème-oxy 1. Dans le but de caractériser la nature de complexe hème-oxy 1 ansi que certains intermédiaires impliqués dans le mécanisme de catalyse des NOS, ce dernier a été l'objet d'études en spectroscopie de résonance Raman.

La résistance à l'insuline est un désordre métabolique précoce dans le développement de l'obésité et du diabète de type 2. Plusieurs évidences suggèrent que la surproduction de monoxyde d'azote (NO) via l'induction de la synthase du monoxyde d'azote inductible (iNOS) dans les principaux organes cibles de l'insuline conduit à un état de résistance à l'insuline. De plus, des études récentes ont montré que l'invalidation génétique de iNOS chez des souris obèses prévient l'apparition de la résistance à l'insuline au niveau systémique et périphérique. Plusieurs agents thérapeutiques sont présentement disponibles en clinique pour traiter la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2, mais aucun d'entre eux ne cible spécifiquement la voie de iNOS et du NO. Dans notre première étude, nous avons trouvé que l'inhibition pharmacologique et sélective de iNOS avec le 1400W améliore l'action de l'insuline après seulement 4 jours de traitement chez des souris db/db génétiquement obèses et diabétiques. L'effet bénéfique du 1400W était associé avec la diminution de l'hyperglycémie à jeun et du stress nitrosatif déterminé par la diminution du niveau de 3-nitrotyrosine dans le muscle. Cependant, l'effet sensibilisateur du 1400W sur l'action de l'insuline était transitoire puisque aucun effet n'a pu être observé après 10 jours de traitement. Lors de notre deuxième étude, nous avons montré que l'invalidation génétique de iNOS chez des souris obèses augmente les effets métaboliques de la rosiglitazone, un agoniste des PPARy utilisé en clinique dans le traitement de la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2. Nous avons entre autres observé une efficacité supérieure de la rosiglitazone à améliorer la tolérance au glucose et à améliorer le défaut d'activation de la voie Akt par l'insuline dans le foie chez les souris iNOS-/- obèses. Ces effets étaient associés avec une augmentation du niveau plasmatique des gros complexes de l'adiponectine (HMW) ainsi que l'activation de la voie de l'AMPK dans les principaux tissus cibles de l'insuline. Finalement, dans notre troisième étude, nous avons démontré que le resvératrol, un composé naturel contenu dans le raisin, diminue l'induction de iNOS et du NO induite par les cytokines dans les cellules musculaires et les adipocytes en culture. Chez la souris, l'expression de iNOS induite par l'endotoxine LPS a été inhibée par le resvératrol dans le muscle et le tissu adipeux, ce qui était associé avec une diminution de l'accumulation des dérivés du NO dans ces tissus. Cependant, aucun effet du resvératrol sur l'expression de iNOS et la production de NO n'a pu être observé dans le foie des souris LPS. Ensemble, les résultats de nos études suggèrent que l'inhibition pharmacologique de iNOS représente une nouvelle stratégie prometteuse à développer dans la gestion du traitement de la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2.

Le tissu musculaire squelettique contribue considérablement au maintien de l’homéostasie du glucose chez l’humain. Que ce soit en situation postprandiale ou lors d’un travail musculaire, le muscle squelettique capte de grandes quantités de glucose sanguin à des fins d’entreposage ou de production d’énergie. Les voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation du transport du glucose à l’intérieur de la cellule musculaire sont nombreuses et complexes. En présence de désordres physiologiques et/ou métaboliques, de nombreux médiateurs chimiques et enzymatiques peuvent interagir avec les différentes protéines de ces voies de signalisation et entraîner des perturbations importantes au niveau de l’homéostasie du glucose. Notre première étude nous a permis de confirmer l’implication de la protéine AMPK dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire. L’AMPK est un senseur énergétique important activé dans le muscle squelettique au cours d’un effort physique. Toutefois, son rôle dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire demeure controversé. Grâce à un modèle murin d’invalidation génétique de l’AMPK spécifique au tissu musculaire et à l’élaboration d’un protocole de contraction ex vivo approprié, nous avons établi l’importance de l’AMPK dans la régulation du transport du glucose. Notre seconde étude nous a permis de démontrer que l’incubation ex vivo prolongée du muscle épitrochléen modifie l’expression du transporteur de glucose GLUT1. Nous avons également observé l’induction de la protéine iNOS et la production du NO. Parallèlement, nous avons mesuré une augmentation de l’expression de GLUT1 à la suite d’une exposition au NO dans un modèle de cellules musculaires ainsi qu’une augmentation du transport basal du glucose. L’ensemble de nos résultats nous permet de consolider le lien causal entre la production du NO et la modulation de l’expression de GLUT1 et potentiellement, le développement de perturbations au niveau du métabolisme du glucose musculaire.

La résistance à l' insuline du muscle squelettique se situe au niveau des étapes subséquentes à la liaison de l'hormone à son récepteur. L' origine de la résis'tance à l'insuline n est pas identifiée avec précision, bien que l'on sache qu'une association de plusieurs facteurs en soit responsable. Parmi ces facteurs de risque, nous avons identifié la synthase inductible du monoxyde d'azote (NO). Cette enzyme (iN OS) a la particularité de produire de fortes concentrations de NO e'n réponse à divers stimuli inflammatoires. Les études présentées dans cette thèse perniettent de mieux comprendre l' implication de cette enzyme dans la résistance à l' insuline ainsi que les mécanismes d'action via lesquels le NO inhibe 1 action de l' insuline. Dans la première étude, nous avons confirmé dans un modèle cellulaire de muscles la capacité de iNOS à causer un défaut du transport du glucose en réponse à l'insuline. Nous avons toutefois également observé que les adipocytes ne développaient pas ce défaut suite à l' induction de l'enzyme. Dans une seconde étude, nous avons cherché à comprendre le mécanisme par lequel la production de NO pouvait être reliée à la résistance à l' insuline. Nous avons montré que la génération d'un oxydant découlant de la synthèse de NO, le peroxynitrite (ONOO-), causait la nitration de tyrosine de la molécule IRS-l et ainsi interfère dans la cascade des étapes de signalisation de l' insuline. Dans une troisième étude, nous avons démontré que l'incubation de muscles in vitro causait des altérations dans la captation de glucose via l' induction de iNOS causée par le procédé d' incubation. Finalement, dans une quatrième étude, nous proposons un mécanisme d'inhibition de iNOS pouvant être mis à profit dans la recherche de cibles thérapeutiques contre la résistance à l' insuline. Nous avons démontré que l'activati.on de la kinase sensible à l'AMP (AMPK) réduisait l' induction de iNOS, tant au niveau cellulaire (myocytes, adipocytes et macrophages) que dans les muscles et le tissu adipeux de rats traités à la lipopolysaccharide (LPS). L' ensemble de nos études précise l'implication de iNOS dans la résistance à l' insuline associée à l'inflammation et oriente la recherche vers de nouvelles pistes et un certain nombre d'applications thérapeutiques.

Lors d'une infection, la principale voie d'activation du macrophage passe par l'IFNY . Par conséquent, la connaissance des événements qui surviennent préalablement à l'activation du macrophage revêt un intérêt certain. Cette thèse s'est donc intéressée à l'effet de l'infection par le parasite protozoaire intracellulaire Trypanosoma cruzi sur deux fonctions IFN-Y -dépendantes du macrophage murin: la production d'oxyde nitrique et la synthèse de la machinerie de présentation antigénique restreinte au CMH de classe I. Les résultats obtenus démontrent que l'infection préalable du parasite pré-active le macrophage à produire de l'oxyde nitrique en réponse à l'IFN-y à des niveaux nettement supérieurs de ceux atteints par le macrophage uniquement stimulé à l'IFN-Y • Cette pré-activation résulte de l'engagement par le parasite des voies NF-KB, Erkl/Erk2 et SAPK/JNK. L'activation subséquente de la voie Jak/STAT par l'IFN-y induit la translocation au noyau de STATla et à la transcription d'un ARNm stable d'iNOS. Une dégradation ralentie de l'ARNm d'iNOS mène à des niveaux élevés de protéine iNOS et d'oxyde nitrique. La stabilité de l'ARNm d'iNOS résulte de l'activation des voies Erkl/Erk2 et SAPK/JNK par le parasite, alors que le facteur de transcription NF-KB favorise probablement une expression maximale d'iNOS. Les résultats présentés dans cette thèse montrent également que l'infection préalable du macrophage par T. cruzi réduit l'expression IFN-Y -dépendante du CMH de classe I et des immuno-sous-unités du protéasome, que cette diminution est due à l'activation de c-Jun suite à l'inhibition des phosphatases murines qui, en retour, est une conséquence des radicaux libres d'oxygène générés par le macrophage en réponse au contact de T. cruzi. Bien que ces résultats soient intéressant en soi, l'ensemble des travaux présentés dans cette thèse vont quelque peu au-delà des objectifs initiaux, en faisant ressortir le rôle essentiel que semble jouer la voie de signalisation SAPK/JNK dans la modulation des fonctions IFN-y -dépendantes du macrophage.

Cette étude a analysé l’influence qu’exerce le vieillissement sur les mécanismes du sommeil chez le rat. Dans un premier temps, nous avons abordé le rôle joué par la NO-synthase inductible (iNOS) dans la régulation du sommeil paradoxal (SP). Nous rapporterons que l’injection d’un inhibiteur spécifique de la iNOS dans le tegmentum latérodorsal (LDT), inhibe l’apparition du SP chez le rat âgé (24 mois) mais pas chez l’adulte (4 mois). Cet effet est antagonisé par une injection secondaire d’un donneur de NO. Les corps cellulaires exprimant la iNOS sont localisés dans des noyaux voisins du LDT, mais, seuls des prolongements neuronaux expriment la iNOS dans ce noyau. Aucune expression de la iNOS n’est apparente dans le cerveau du rat adulte. Ces résultats sont la première preuve du rôle joué par la iNOS dans la régulation du SP chez l’animal âgé. Nous avons ensuite comparé la capacité des rats adultes et âgés à répondre à un stress d’immobilisation sur le plan polysomnographique. Les résultats obtenus confirment que, chez le rat adulte, le stress d’immobilisation d’une heure, imposé en début de période d’obscurité, provoque un rebond de SP. Chez l’animal âgé, au contraire, le stress d’immobilisation reste sans effets sur les états de veille et de sommeil. Enfin, nous avons tenté de mettre en évidence si l’agomélatine, un antidépresseur de nouvelle génération, était capable de compenser l’absence de rebond de SP observée chez l’animal âgé après un stress d’immobilisation. Les résultats obtenus indiquent que l’agomélatine, administrée au début de la période d’obscurité pendant 3 jours consécutifs, pouvait vraisemblablement favoriser la réapparition d’un rebond de SP / This study analysed the influence exerted by aging on the rat sleep-wake cycle. We first considered the part played by the inducible NO-synthase (iNOS) in the regulation of paradoxical sleep (PS or REM sleep). We report that the injection of an iNOS inhibitor, within the laterodorsal pontin tegmentum (LDT), suppresses the occurrence of PS in the aged animals (24 months), but not in the adult ones (4 months). This effect can be reversed by a secondary injection of a NO donor. While the cell bodies expressing the iNOS are localized in the structures neighbouring the LDT, only nerves ending impinge this nucleus. The iNOS is not expressed in the brain of the adult rat. These data constitute the first demonstration of the part played by the iNOS in the regulation of PS in the aged animal. Afterwards, we compared the ability of adult and aged rats to reply to an immobilization stress by a sleep rebound. Data obtained confirm that a sleep rebound occurs after a 1h immobilization stress in the adult rat. In the same conditions, such a sleep rebound is not observed in the aged animal. Finally, we checked whether agomelatine, a new type of antidepressant, was able to compensate the loss of the sleep rebound observed in the aged rat after an immobilization stress. Data obtained indicate that agomelatine, administered at the beginning of the dark period during 3 consecutive days, might facilitate the occurrence of a sleep rebound related to stress in the aged rat

Depuis sa découverte, le monoxyde d'azote n'a pas cessé d'intéresser la communauté scientifique. Sa biosynthèse est catalysée par les NO Synthases, qui est une famille de trois isoenzymes. La NOS neuronale et la NOS endothéliale sont constitutives et produisent du NO impliqué dans la neurotransmission et la vasodilatation respectivement. La NOS inductible quant à elle produit du NO impliqué dans la réponse immunitaire innée. Une surproduction de monoxyde d'azote est impliqué dans de nombreuses pathologies comme les maladies neuro-dégénératives ou les maladies chroniques à composantes inflammatoires. L'inhibition de iNOS et nNOS présente donc un grand intérêt thérapeutique. Cependant l'enjeu est de développer des inhibiteurs hautement sélectifs, afin de préserver les fonctions vitales de eNOS.Nous avons choisi de synthétiser des composés constitués d'un analogue de substrat tel que thiocitrulline et S-alkyl-isothiocitrulline auquel est ajouté, par un lien peptidique ou hétérocyclique, un résidu susceptible de se lier dans le canal d'accès du substrat, région moins conservée du site actif pouvant fournir des interactions spécifiques. La synthèse de ces composés a été réalisée sur support solide selon une méthode d'ancrage par la chaîne latérale développée au laboratoire, ou pour certains composés, selon une méthode classique d'ancrage par l'amine alpha, ces deux méthodes offrant un fort potentiel en chimie combinatoire. Les différents composés synthétisés ont été testés sur les trois isoformes recombinantes.Un second travail est brièvement exposé dans ce manuscrit. La synthèse de cyclopeptides basés sur le motif RGD impliqué dans la liaison aux intégrines a été réalisée selon un mode de cyclisation développé au laboratoire faisant intervenir la formation d'un pont guanidine qui sera ensuite diversement substitué. L'étude RMN et l'évaluation de leur activité biologique sur les récepteur opioïdes semble montrer un influence de la substitution du pont sur leur conformation et leur activité. / Since its discovery, Since its discovery, the nitric oxide did not stop interesting the scientific community. Its biosynthesis is catalyzed by NO synthases, a family of three isoenzymes. Neuronal NOS and endothelial NOS are constitutive and produce NO involved in neurotransmission and vasodilation process respectively. Inducible NOS produces NO involved in the innate immune response. An overproduction of nitric oxide is involved in many diseases such as neurodegenerative diseases or chronic diseases with inflammatory components. Thus, its inhibition should be of high therapeutical interest. However, it is necessary to develop highly selective inhibitors to preserve the vital functions of eNOS.We chose to synthesize compounds constituted of one substrate analogue as thiocitrulline or S-alkyl-isothiocitrulline which linked by a peptide bond or heterocycles to a residue able to bind into the substrate access channel, a less conserved region into the active site were specific interactions could be established. The synthesis of these compounds was performed on solid support according to an anchoring method through the side chain developed at the laboratory or, for some compounds, according to a conventional anchoring method through the alpha amine. These approaches are particulary interesting for a combinatory chemistry approach. All compounds were tested on the three recombinant isoforms.A second work is outlined in this manuscript. It consist of synthesizing cyclopeptides based on RGD motif involved in the binding to integrins and enkephalins analogues. The cyclisation method was developed in the lab and involves the formation of a guanidine bridge diversely substituted. NMR studies and biological evaluations on opioid receptor suggests that the diverse bridge substitutions could modulate the conformation and activity of the peptides.