Asthma ist eine Erkrankung die das komplette Immunsystems involviert, ein System so komplex, dass es sich nur unzureichend in-vitro studieren lässt. Daher haben sich Mausmodelle als ein unverzichtbares Werkzeug in der präklinischen Asthmaforschung etabliert. Da es sich weiterhin bei Asthma um eine Erkrankung handelt, die durch eine schnelle Änderung der Symptome gekennzeichnet ist, wäre longitudinale vorzugsweise nicht-invasive Bildgebung, insbesondere bei der Entwicklung und Bewertung neuer Therapiekonzepte von großem Interesse. Nachteilig hingegen ist, dass die Darstellung der Mauslunge in der Praxis auf Grund der Größe des Organs und, im Falle einer in vivo Bildgebung, durch die Bewegung des Brustkorbes sich als äußerst schwierig herausstellt. Die Vielzahl der Luft-Gewebe-Grenzflächen erzeugt starke Streuung in der optischen Bildgebung, der große Hohlraum der Lunge verursacht Suszeptibilitätsartefakte bei der MRT und die Rippen erschweren eine Ultraschallbildgebung. Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf an neuen Bildgebungsverfahren, um die durch Asthma verursachten anatomischen, funktionalen und molekularen Veränderungen darstellen zu können. Um die Schwierigkeiten in der Lungenbildgebung bei Mäusen zu umgehen, habe ich mich auf drei wesentliche Bildgebungsstrategien fokussiert: A) anatomische Bildgebung durch “inline free propagation phase contrast computed tomography”, B) direkte Messung der Lungenfunktion durch “low dose planar cinematic x-ray imaging” und C) funktionale Bildgebung mit Hilfe der „near infrared fluorescence imaging“ in Kombination mit Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, oder “smart probes”, die in Gegenwart von Entzündungen aktiviert werden. Durch die Anwendung von “phase contrast computed tomography” für die anatomische Bildgebung war ich in der Lage morphologische Veränderung des Lungengewebes zu quantifizieren, indem ich lokal das Verhältnis zwischen Weichgewebe und Luft, das Zusammenziehen der Luftwege sowie das Anschwellen der Bronchialwände im asthmatischen Lungengewebe ausgewertet habe. Diese Parameter erlaubten es zwischen Mäusen von Asthmamodellen unterschiedlicher Schweregrade, therapierten und gesunden Mäusen zu unterscheiden. Zusätzlich ermöglichte diese Technik die Darstellung intra-tracheal applizierter Bariumsulfat markierter Makrophagen im Lungengewebe. Dies stellt meines Wissens die erste Kombination einer funktionalisierten Kontrastierung und hochauflösender Lungenbildgebung mittels CT unter in vivo ähnlichen Bedingungen dar. Um diese Ergebnisse mit dem Grad der asthmabedingten Kurzatmigkeit zu korrelieren, habe ich eine einfache und verlässige Methode entwickelt die es, basierend auf 2D Röntgen-videos niedriger Röntgendosis (~6,5mGy) erlaubt, in narkotisierten Mäusen die Lungenfunktion zu bewerten. Mit Hilfe dieser neuen Methode gelang es mir charakteristische Unterschiede in der Lungenfunktion von asthmatischen, therapierten und gesunden Mäusen in vivo über die Zeit nachzuweisen, und diese Resultate mit den Ergebnissen von CT und Histologie zu korrelieren. Das Verfahren wird derzeit von mir für die Anwendung an frei beweglichen und nicht narkotisierten Mäusen weiterentwickelt. Dies sollte zu einer deutlichen Stressreduktion für die Maus bei der Untersuchung führen und somit, vor allem in Asthma, im Gegensatz zu etablierten Verfahren wie Plethysmographie, die Erhebung validerer Messdaten erlauben. Mit Hilfe von „near infrared fluorescence imaging“ konnten wir in vivo und longitudinal erfolgreich verschiedene durch Asthma ausgelöste molekulare Veränderungen in der Mauslunge verfolgen. Erstens erlaubte die Verwendung einer neuen Polyglyzerol Probe mit dendritischer Struktur (MN2012) die spezifisch an Selektine bindet, die Darstellung der durch Asthma verursachten Entzündung der Lunge. Im Zuge dessen konnten wir nachweisen, dass sich MN2012  zur Darstellung von Enzymkinetiken bei Entzündungsreaktionen durch eine schnellere Kinetik und höher Spezifität als kommerziell erhältliche Proben auszeichnet. Zweitens haben wir gezeigt, dass in Kombination mit einem Fluoreszenz markiertem Antikörper gegen SiglecF, einem Antigen das hauptsächlich auf Eosinophilen exprimiert ist, Eosinophilie in asthmatischen Mäusen verfolgt und der Effekt einer Dexamethason Behandlung  ebenso dargestellt werden kann. Drittens konnten wir den Verbleib inhalierter fluoreszierender Nanopartikel in der Lunge der Maus in vivo untersuchen und dabei nachweisen, dass diese hauptsächlich von endogenen Makrophagen im Lungengewebe aufgenommen werden. Alle diese Techniken wurden gegeneinander und mittels histologischer Analyse und Fluoreszenzmikroskopie korreliert und validiert.  Zusammenfassend bilden die in meiner Dissertation entwickelten Lungenbildgebungsstrategien für Asthmamausmodelle eine Bildgebungsplattform, um sowohl spezifische Effekte in asthmatischen Mäusen unterschiedlichen Schweregrades als auch die Auswirkungen neuer Therapien abzubilden und im Detail zu untersuchen.

Asthma ist eine Erkrankung die das komplette Immunsystems involviert, ein System so komplex, dass es sich nur unzureichend in-vitro studieren lässt. Daher haben sich Mausmodelle als ein unverzichtbares Werkzeug in der präklinischen Asthmaforschung etabliert. Da es sich weiterhin bei Asthma um eine Erkrankung handelt, die durch eine schnelle Änderung der Symptome gekennzeichnet ist, wäre longitudinale vorzugsweise nicht-invasive Bildgebung, insbesondere bei der Entwicklung und Bewertung neuer Therapiekonzepte von großem Interesse. Nachteilig hingegen ist, dass die Darstellung der Mauslunge in der Praxis auf Grund der Größe des Organs und, im Falle einer in vivo Bildgebung, durch die Bewegung des Brustkorbes sich als äußerst schwierig herausstellt. Die Vielzahl der Luft-Gewebe-Grenzflächen erzeugt starke Streuung in der optischen Bildgebung, der große Hohlraum der Lunge verursacht Suszeptibilitätsartefakte bei der MRT und die Rippen erschweren eine Ultraschallbildgebung. Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf an neuen Bildgebungsverfahren, um die durch Asthma verursachten anatomischen, funktionalen und molekularen Veränderungen darstellen zu können. Um die Schwierigkeiten in der Lungenbildgebung bei Mäusen zu umgehen, habe ich mich auf drei wesentliche Bildgebungsstrategien fokussiert: A) anatomische Bildgebung durch “inline free propagation phase contrast computed tomography”, B) direkte Messung der Lungenfunktion durch “low dose planar cinematic x-ray imaging” und C) funktionale Bildgebung mit Hilfe der „near infrared fluorescence imaging“ in Kombination mit Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, oder “smart probes”, die in Gegenwart von Entzündungen aktiviert werden. Durch die Anwendung von “phase contrast computed tomography” für die anatomische Bildgebung war ich in der Lage morphologische Veränderung des Lungengewebes zu quantifizieren, indem ich lokal das Verhältnis zwischen Weichgewebe und Luft, das Zusammenziehen der Luftwege sowie das Anschwellen der Bronchialwände im asthmatischen Lungengewebe ausgewertet habe. Diese Parameter erlaubten es zwischen Mäusen von Asthmamodellen unterschiedlicher Schweregrade, therapierten und gesunden Mäusen zu unterscheiden. Zusätzlich ermöglichte diese Technik die Darstellung intra-tracheal applizierter Bariumsulfat markierter Makrophagen im Lungengewebe. Dies stellt meines Wissens die erste Kombination einer funktionalisierten Kontrastierung und hochauflösender Lungenbildgebung mittels CT unter in vivo ähnlichen Bedingungen dar. Um diese Ergebnisse mit dem Grad der asthmabedingten Kurzatmigkeit zu korrelieren, habe ich eine einfache und verlässige Methode entwickelt die es, basierend auf 2D Röntgen-videos niedriger Röntgendosis (~6,5mGy) erlaubt, in narkotisierten Mäusen die Lungenfunktion zu bewerten. Mit Hilfe dieser neuen Methode gelang es mir charakteristische Unterschiede in der Lungenfunktion von asthmatischen, therapierten und gesunden Mäusen in vivo über die Zeit nachzuweisen, und diese Resultate mit den Ergebnissen von CT und Histologie zu korrelieren. Das Verfahren wird derzeit von mir für die Anwendung an frei beweglichen und nicht narkotisierten Mäusen weiterentwickelt. Dies sollte zu einer deutlichen Stressreduktion für die Maus bei der Untersuchung führen und somit, vor allem in Asthma, im Gegensatz zu etablierten Verfahren wie Plethysmographie, die Erhebung validerer Messdaten erlauben. Mit Hilfe von „near infrared fluorescence imaging“ konnten wir in vivo und longitudinal erfolgreich verschiedene durch Asthma ausgelöste molekulare Veränderungen in der Mauslunge verfolgen. Erstens erlaubte die Verwendung einer neuen Polyglyzerol Probe mit dendritischer Struktur (MN2012) die spezifisch an Selektine bindet, die Darstellung der durch Asthma verursachten Entzündung der Lunge. Im Zuge dessen konnten wir nachweisen, dass sich MN2012  zur Darstellung von Enzymkinetiken bei Entzündungsreaktionen durch eine schnellere Kinetik und höher Spezifität als kommerziell erhältliche Proben auszeichnet. Zweitens haben wir gezeigt, dass in Kombination mit einem Fluoreszenz markiertem Antikörper gegen SiglecF, einem Antigen das hauptsächlich auf Eosinophilen exprimiert ist, Eosinophilie in asthmatischen Mäusen verfolgt und der Effekt einer Dexamethason Behandlung  ebenso dargestellt werden kann. Drittens konnten wir den Verbleib inhalierter fluoreszierender Nanopartikel in der Lunge der Maus in vivo untersuchen und dabei nachweisen, dass diese hauptsächlich von endogenen Makrophagen im Lungengewebe aufgenommen werden. Alle diese Techniken wurden gegeneinander und mittels histologischer Analyse und Fluoreszenzmikroskopie korreliert und validiert.  Zusammenfassend bilden die in meiner Dissertation entwickelten Lungenbildgebungsstrategien für Asthmamausmodelle eine Bildgebungsplattform, um sowohl spezifische Effekte in asthmatischen Mäusen unterschiedlichen Schweregrades als auch die Auswirkungen neuer Therapien abzubilden und im Detail zu untersuchen.

Asthma ist eine Erkrankung die das komplette Immunsystems involviert, ein System so komplex, dass es sich nur unzureichend in-vitro studieren lässt. Daher haben sich Mausmodelle als ein unverzichtbares Werkzeug in der präklinischen Asthmaforschung etabliert. Da es sich weiterhin bei Asthma um eine Erkrankung handelt, die durch eine schnelle Änderung der Symptome gekennzeichnet ist, wäre longitudinale vorzugsweise nicht-invasive Bildgebung, insbesondere bei der Entwicklung und Bewertung neuer Therapiekonzepte von großem Interesse. Nachteilig hingegen ist, dass die Darstellung der Mauslunge in der Praxis auf Grund der Größe des Organs und, im Falle einer in vivo Bildgebung, durch die Bewegung des Brustkorbes sich als äußerst schwierig herausstellt. Die Vielzahl der Luft-Gewebe-Grenzflächen erzeugt starke Streuung in der optischen Bildgebung, der große Hohlraum der Lunge verursacht Suszeptibilitätsartefakte bei der MRT und die Rippen erschweren eine Ultraschallbildgebung. Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf an neuen Bildgebungsverfahren, um die durch Asthma verursachten anatomischen, funktionalen und molekularen Veränderungen darstellen zu können. Um die Schwierigkeiten in der Lungenbildgebung bei Mäusen zu umgehen, habe ich mich auf drei wesentliche Bildgebungsstrategien fokussiert: A) anatomische Bildgebung durch “inline free propagation phase contrast computed tomography”, B) direkte Messung der Lungenfunktion durch “low dose planar cinematic x-ray imaging” und C) funktionale Bildgebung mit Hilfe der „near infrared fluorescence imaging“ in Kombination mit Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, oder “smart probes”, die in Gegenwart von Entzündungen aktiviert werden. Durch die Anwendung von “phase contrast computed tomography” für die anatomische Bildgebung war ich in der Lage morphologische Veränderung des Lungengewebes zu quantifizieren, indem ich lokal das Verhältnis zwischen Weichgewebe und Luft, das Zusammenziehen der Luftwege sowie das Anschwellen der Bronchialwände im asthmatischen Lungengewebe ausgewertet habe. Diese Parameter erlaubten es zwischen Mäusen von Asthmamodellen unterschiedlicher Schweregrade, therapierten und gesunden Mäusen zu unterscheiden. Zusätzlich ermöglichte diese Technik die Darstellung intra-tracheal applizierter Bariumsulfat markierter Makrophagen im Lungengewebe. Dies stellt meines Wissens die erste Kombination einer funktionalisierten Kontrastierung und hochauflösender Lungenbildgebung mittels CT unter in vivo ähnlichen Bedingungen dar. Um diese Ergebnisse mit dem Grad der asthmabedingten Kurzatmigkeit zu korrelieren, habe ich eine einfache und verlässige Methode entwickelt die es, basierend auf 2D Röntgen-videos niedriger Röntgendosis (~6,5mGy) erlaubt, in narkotisierten Mäusen die Lungenfunktion zu bewerten. Mit Hilfe dieser neuen Methode gelang es mir charakteristische Unterschiede in der Lungenfunktion von asthmatischen, therapierten und gesunden Mäusen in vivo über die Zeit nachzuweisen, und diese Resultate mit den Ergebnissen von CT und Histologie zu korrelieren. Das Verfahren wird derzeit von mir für die Anwendung an frei beweglichen und nicht narkotisierten Mäusen weiterentwickelt. Dies sollte zu einer deutlichen Stressreduktion für die Maus bei der Untersuchung führen und somit, vor allem in Asthma, im Gegensatz zu etablierten Verfahren wie Plethysmographie, die Erhebung validerer Messdaten erlauben. Mit Hilfe von „near infrared fluorescence imaging“ konnten wir in vivo und longitudinal erfolgreich verschiedene durch Asthma ausgelöste molekulare Veränderungen in der Mauslunge verfolgen. Erstens erlaubte die Verwendung einer neuen Polyglyzerol Probe mit dendritischer Struktur (MN2012) die spezifisch an Selektine bindet, die Darstellung der durch Asthma verursachten Entzündung der Lunge. Im Zuge dessen konnten wir nachweisen, dass sich MN2012  zur Darstellung von Enzymkinetiken bei Entzündungsreaktionen durch eine schnellere Kinetik und höher Spezifität als kommerziell erhältliche Proben auszeichnet. Zweitens haben wir gezeigt, dass in Kombination mit einem Fluoreszenz markiertem Antikörper gegen SiglecF, einem Antigen das hauptsächlich auf Eosinophilen exprimiert ist, Eosinophilie in asthmatischen Mäusen verfolgt und der Effekt einer Dexamethason Behandlung  ebenso dargestellt werden kann. Drittens konnten wir den Verbleib inhalierter fluoreszierender Nanopartikel in der Lunge der Maus in vivo untersuchen und dabei nachweisen, dass diese hauptsächlich von endogenen Makrophagen im Lungengewebe aufgenommen werden. Alle diese Techniken wurden gegeneinander und mittels histologischer Analyse und Fluoreszenzmikroskopie korreliert und validiert.  Zusammenfassend bilden die in meiner Dissertation entwickelten Lungenbildgebungsstrategien für Asthmamausmodelle eine Bildgebungsplattform, um sowohl spezifische Effekte in asthmatischen Mäusen unterschiedlichen Schweregrades als auch die Auswirkungen neuer Therapien abzubilden und im Detail zu untersuchen.

Asthma ist eine Erkrankung die das komplette Immunsystems involviert, ein System so komplex, dass es sich nur unzureichend in-vitro studieren lässt. Daher haben sich Mausmodelle als ein unverzichtbares Werkzeug in der präklinischen Asthmaforschung etabliert. Da es sich weiterhin bei Asthma um eine Erkrankung handelt, die durch eine schnelle Änderung der Symptome gekennzeichnet ist, wäre longitudinale vorzugsweise nicht-invasive Bildgebung, insbesondere bei der Entwicklung und Bewertung neuer Therapiekonzepte von großem Interesse. Nachteilig hingegen ist, dass die Darstellung der Mauslunge in der Praxis auf Grund der Größe des Organs und, im Falle einer in vivo Bildgebung, durch die Bewegung des Brustkorbes sich als äußerst schwierig herausstellt. Die Vielzahl der Luft-Gewebe-Grenzflächen erzeugt starke Streuung in der optischen Bildgebung, der große Hohlraum der Lunge verursacht Suszeptibilitätsartefakte bei der MRT und die Rippen erschweren eine Ultraschallbildgebung. Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf an neuen Bildgebungsverfahren, um die durch Asthma verursachten anatomischen, funktionalen und molekularen Veränderungen darstellen zu können. Um die Schwierigkeiten in der Lungenbildgebung bei Mäusen zu umgehen, habe ich mich auf drei wesentliche Bildgebungsstrategien fokussiert: A) anatomische Bildgebung durch “inline free propagation phase contrast computed tomography”, B) direkte Messung der Lungenfunktion durch “low dose planar cinematic x-ray imaging” und C) funktionale Bildgebung mit Hilfe der „near infrared fluorescence imaging“ in Kombination mit Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, oder “smart probes”, die in Gegenwart von Entzündungen aktiviert werden. Durch die Anwendung von “phase contrast computed tomography” für die anatomische Bildgebung war ich in der Lage morphologische Veränderung des Lungengewebes zu quantifizieren, indem ich lokal das Verhältnis zwischen Weichgewebe und Luft, das Zusammenziehen der Luftwege sowie das Anschwellen der Bronchialwände im asthmatischen Lungengewebe ausgewertet habe. Diese Parameter erlaubten es zwischen Mäusen von Asthmamodellen unterschiedlicher Schweregrade, therapierten und gesunden Mäusen zu unterscheiden. Zusätzlich ermöglichte diese Technik die Darstellung intra-tracheal applizierter Bariumsulfat markierter Makrophagen im Lungengewebe. Dies stellt meines Wissens die erste Kombination einer funktionalisierten Kontrastierung und hochauflösender Lungenbildgebung mittels CT unter in vivo ähnlichen Bedingungen dar. Um diese Ergebnisse mit dem Grad der asthmabedingten Kurzatmigkeit zu korrelieren, habe ich eine einfache und verlässige Methode entwickelt die es, basierend auf 2D Röntgen-videos niedriger Röntgendosis (~6,5mGy) erlaubt, in narkotisierten Mäusen die Lungenfunktion zu bewerten. Mit Hilfe dieser neuen Methode gelang es mir charakteristische Unterschiede in der Lungenfunktion von asthmatischen, therapierten und gesunden Mäusen in vivo über die Zeit nachzuweisen, und diese Resultate mit den Ergebnissen von CT und Histologie zu korrelieren. Das Verfahren wird derzeit von mir für die Anwendung an frei beweglichen und nicht narkotisierten Mäusen weiterentwickelt. Dies sollte zu einer deutlichen Stressreduktion für die Maus bei der Untersuchung führen und somit, vor allem in Asthma, im Gegensatz zu etablierten Verfahren wie Plethysmographie, die Erhebung validerer Messdaten erlauben. Mit Hilfe von „near infrared fluorescence imaging“ konnten wir in vivo und longitudinal erfolgreich verschiedene durch Asthma ausgelöste molekulare Veränderungen in der Mauslunge verfolgen. Erstens erlaubte die Verwendung einer neuen Polyglyzerol Probe mit dendritischer Struktur (MN2012) die spezifisch an Selektine bindet, die Darstellung der durch Asthma verursachten Entzündung der Lunge. Im Zuge dessen konnten wir nachweisen, dass sich MN2012  zur Darstellung von Enzymkinetiken bei Entzündungsreaktionen durch eine schnellere Kinetik und höher Spezifität als kommerziell erhältliche Proben auszeichnet. Zweitens haben wir gezeigt, dass in Kombination mit einem Fluoreszenz markiertem Antikörper gegen SiglecF, einem Antigen das hauptsächlich auf Eosinophilen exprimiert ist, Eosinophilie in asthmatischen Mäusen verfolgt und der Effekt einer Dexamethason Behandlung  ebenso dargestellt werden kann. Drittens konnten wir den Verbleib inhalierter fluoreszierender Nanopartikel in der Lunge der Maus in vivo untersuchen und dabei nachweisen, dass diese hauptsächlich von endogenen Makrophagen im Lungengewebe aufgenommen werden. Alle diese Techniken wurden gegeneinander und mittels histologischer Analyse und Fluoreszenzmikroskopie korreliert und validiert.  Zusammenfassend bilden die in meiner Dissertation entwickelten Lungenbildgebungsstrategien für Asthmamausmodelle eine Bildgebungsplattform, um sowohl spezifische Effekte in asthmatischen Mäusen unterschiedlichen Schweregrades als auch die Auswirkungen neuer Therapien abzubilden und im Detail zu untersuchen.

The paucity of well validated preclinical models is frequently cited as a contributing factor to the high attrition rates seen in clinical oncological trials. There remains a critical need to develop models which are accurately able to recapitulate the features of human disease. The aims of this study were to use genetically engineered mouse models (GEMMs) to explore the efficacy of novel treatment strategies in HER2 positive breast cancer and to further develop the model to facilitate the study of mechanisms underpinning drug resistance. Using the BLG--HER2KI-PTEN+/- model, we demonstrated that Src plays an important role in the early stages of tumour development. Chemopreventative treatment with dasatinib delayed tumour inititation (p= 0.046, Wilcoxon signed rank test) and prolonged overall survival (OS) (p=0.06, Wilcoxon signed rank test). Dasatinib treatment also induced squamous metaplasia in 66% of drug treated tumours. We used 2 cell lines derived from this model to further explore dasatinib’s mechanism of action and demonstrated reduced proliferation, migration and invasion following in vitro treatment. Due to the prolonged tumour latency and the low metastatic rate seen in this model, further studies were undertaken with the MMTV-NIC model. This model also allowed us to study the impact of PTEN loss on therapeutic response. We validated this model by treating a cohort of MMTV-NIC PTEN+/- mice with paclitaxel and demonstrated prolonged OS (p=0.035, Gehan Breslow Wilcoxon test). AZD8931 is an equipotent signalling inhibitor of HER2, HER3 and EGFR. We observed heterogeneity in tumour response but overall AZD8931 treatment prolonged OS in both MMTV-NIC PTEN FL/+ and MMTV-NIC PTEN+/- models. PTEN loss was associated with reduced sensitivity to AZD8931 and failure to suppress Src activity, suggesting these may be suitable predictive biomarkers of AZD8931 response. To facilitate further studies exploring resistance, we transplanted MMTV-NIC PTEN+/- fragments into syngeneic mice and generated 3 tumours with acquired resistance to AZD8931. These tumours displayed differing resistance strategies; 1 tumour continued to express HER2 whilst the remaining 2 underwent EMT and lost HER2 expression reflecting to a very limited degree some of the heterogeneity of resistance strategies seen in human disease. To further explore resistance to HER2 targeting tyrosine kinase inhibitors, we generated a panel of human cell lines with acquired resistance to AZD8931 and lapatinib. Western blotting demonstrated loss of HER2, HER3 and PTEN in all resistant lines. Acquisition of resistance was associated with a marked change in phenotype and western blotting confirmed all lines had undergone EMT. We used a combination of RPPA and mass spectrometry to further characterise the AZD8931 resistant lines and identified multiple potential novel proteins involved in the resistant phenotype, including several implicated in EMT. In conclusion, when coupled with appropriate in vitro techniques, the MMTV-NIC model is a valuable tool for selection of emerging drugs to carry forward into clinical trials of HER2 positive breast cancer.

Each year liver cancer kills more than half a million people, making it the third leading cause of cancer-related death worldwide. Annual incidence continues to rise steadily, both domestically and globally, increasing the burden of this disease. Advancements in the ability to obtain detailed molecular profiles of tumors have led to the successful development of targeted therapies for a number of different cancers. Unfortunately, however, the molecular pathogenesis of liver cancer is poorly understood relative to many other types of malignancies. Thus, the identification of factors contributing to the development and progression of liver tumors is a major goal of current research. In pursuit of this goal, I have utilized the Sleeping Beauty (SB) transposon system as a tool for forward genetic mutagenesis screening in mice. The SB system recapitulates the kinetics of spontaneous tumor development in humans by providing a stepwise accumulation of mutations. Micro-evolutionary processes within a developing tumor lead to the selective expansion of cells harboring mutations that confer some kind of selective advantage. By identifying the most prevalent mutation events within a specific tumor type across a large number of independent samples, a list of genes implicated as being involved in tumorigenesis can be generated. Using this approach, the Dlk1-Dio3 imprinted domain was identified as a site of frequent mutation in SB-induced hepatocellular carcinomas (HCCs). I discovered that the mechanistic basis for recurrent selection of transposon insertion within this domain in liver tumors involved activated expression of Retrotransposon-like 1 (Rtl1). I also found that RTL1 activation is a common event in human HCC, suggesting that it could potentially be beneficial as a therapeutic target in a subset of patients. Etiological factors related to liver cancer development are varied, but are linked by the fact that each provides a chronic liver injury stimulus that promotes the development of hepatic fibrosis. In fact, ˜ 90% of human HCC occurs in this context, and yet the majority of mouse liver cancer models fail to account for this important environmental component of the disease. I have conducted a screen for genetic drivers of liver cancer in the presence or absence of hepatic fibrosis. Comparison of mutation profiles between fibrotic and non-fibrotic tumors revealed largely non-overlapping sets of candidate genes, indicative of a differential selective pressure for mutations depending on the fibrotic context of the liver. Driver mutations identified preferentially in the presence of liver fibrosis have a high likelihood of relevance to human disease, given the similarities in environmental context and kinetics of mutation acquisition. Consistent with this idea, multiple genes with well-established roles in human HCC were found to be preferentially mutated in SB-induced tumors developed in a fibrotic liver. Before a candidate cancer gene identified in an animal model system can have an impact on human disease, its proposed role in tumorigenesis must be validated. Existing techniques for validation of putative liver cancer genes suffer from significant limitations including high cost, low throughput, and a level of complexity that prohibits widespread utilization. I have contributed to the generation of a novel tool for in vivo validation of candidate genes that is not subject to these limitations. By combining elements of recombinant adenoviral vectors and the piggyBac transposition system, we have generated a highly flexible gene delivery system with significant advantages over existing techniques. The Ad-PB system has broad accessibility and applicability, making it a valuable tool for advancing efforts to improve cancer therapies.

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T cells modified for expression of Chimeric Antigen Receptors (CARs) were the first genemodified cell products approved for use in cancer immunotherapy. CAR-T cells engineered with gammaretroviral or lentiviral vectors (RVs/LVs) targeting B-cell lymphomas and leukemias have shown excellent clinical efficacy and no malignant transformation due to insertional mutagenesis to date. Large-scale production of RVs/ LVs under good-manufacturing practices for CAR-T cell manufacturing has soared in recent years. However, manufacturing of RVs/LVs remains complex and costly, representing a logistical bottleneck for CAR-T cell production. Emerging gene-editing technologies are fostering a new paradigm in synthetic biology for the engineering and production of CAR-T cells. Firstly, the generation of the modular reagents utilized for gene editing with the CRISPR-Cas systems can be scaled-up with high precision under good manufacturing practices, are interchangeable and can be more sustainable in the long-run through the lower material costs. Secondly, gene editing exploits the precise insertion of CARs into defined genomic loci and allows combinatorial gene knock-ins and knock-outs with exciting and dynamic perspectives for T cell engineering to improve their therapeutic efficacy. Thirdly, allogeneic edited CAR-effector cells could eventually become available as “off-the-shelf” products. This review addresses important points to consider regarding the status quo, pending needs and perspectives for the forthright evolution from the viral towards gene editing developments for CAR-T cells.

Magnesium ist eines der am häufigsten vorkommenden Elemente auf der Erde. Es ist sowohl für niedere als auch für höhere Organismen lebensnotwendig und für die neuronale Übertragung, die kardiale Erregungsleitung und Funktion zahlreicher Enzyme erforderlich. In höheren Organismen wird der Großteil von Mg2+ in der Niere filtriert und reabsorbiert. Störungen in diesem Prozess führen zu verschiedenen genetischen Erkrankungen beim Menschen. CNNM2 (Cyclin und CBS Domain Divalent Metal Cation Transport Mediator 2) wurde als magnesiumresponsives Gen identifiziert, seine genaue Rolle ist jedoch noch unklar. In dieser Arbeit wurden verschiedene Zell- und In-vivo-Modelle verwendet, um die Rolle von CNNM2 zu verstehen. Ich fand heraus, dass CNNM2 hauptsächlich auf der apikalen Oberfläche polarisierter MDCK-Zellen exprimiert wird, was durch Oberflächenbiotinylierungs- und Immunfluoreszenz-Experimente unterstützt wurde. Darüber hinaus wurde ARL15 durch Massenspektrometrie als neuer Interaktionspartner von CNNM2 identifiziert. Ich fand heraus, dass ARL15 die CNNM2-Oberflächenexpression erhhöhte und dessen Monomerisierung bevorteilte. Bei Mäusen führte die Deletion von Cnnm2 zu Fehlbildungen des Gehirns, verringerten Mg2+ -Spiegeln im Serum und perinatalen Letalität. Um die Rolle von CNNM2 in vivo weiter aufzuklären, wurde ein Mausmodell mit gezielter Deletion von Cnnm2 in der Niere unter Verwendung der Ksp-Cadherin-Cre-Linie erstellt, was zu einer teilweisen Verringerung der CNNM2-Spiegel führte. Insgesamt konnte diese Studie unter Verwendung von gentechnisch veränderten Mausmodellen und In-vitro Modellsystemen zum Verständnis der CNNM2-Funktion beitragen. / Magnesium is one of the most abundant elements found on earth. It is vital to both lower and higher organisms and required for neuronal transmission, cardiac conduction, and enzyme function. In higher organisms, the majority of Mg2+ is filtered in the kidney. Disturbances in this process result in various human diseases. CNNM2 (Cyclin and CBS Domain Divalent Metal Cation Transport Mediator 2) was identified as a Mg2+ responsive gene, but its exact role is still uncertain. In this thesis, various cell and in vivo models were utilized to understand the role of CNNM2. I found that CNNM2 is expressed mostly on the apical surface of the polarized MDCK cells which was supported by cell surface biotinylation and immunofluorescence experiments. Furthermore, ARL15 was identified as a novel interaction partner of CNNM2 by mass spectrometry. I found that ARL15 increased CNNM2 surface expression and monomerization. Moreover, deletion of Cnnm2 in mice resulted in brain malformations, reduced serum Mg2+ levels and prenatal death. To further elucidate the role of CNNM2 in vivo, a mouse model with targeted deletion of Cnnm2 in the kidney was generated by using Ksp cadherin-cre line which resulted in a partial reduction in the CNNM2 levels. Overall, this study contributed to the understanding of CNNM2 function by combining genetically engineered mouse models and in vitro models.

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