Prion diseases are fatal neurodegenerative disorders of humans and animals. The prion hypothesis states that PrPSc, a misfolded conformational isoform of the cellular prion protein (PrPC), is the sole component of the infectious particle. Many open questions exist in prion biology including the cellular role of PrPC, the potential involvement of auxiliary factors in prion replication, and the mechanism of PrPSc-induced toxicity in prion disease. The identification of novel prion-like proteins and authentic in vivo prion protein-interacting proteins would certainly assist the process of demystifying these unsolved mysteries. Accordingly, two newly-identified proteins with potential relevance to prion protein biology, Shadoo and DPPX, were selected for biochemical and functional characterization. Shadoo, a hypothetical prion-like protein, is revealed as being a glycoprotein which possesses many overlapping properties with PrPC including neuronal expression, C1-like endoproteolytic processing, and the ability to protect against apoptotic stimuli in cerebellar neurons. Shadoo loosely resembles the disordered N-terminal domain of PrPC and consistent with this notion, Shadoo appears to lack a well-defined structure. Remarkably, Shadoo levels in the brains of mice with clinical prion disease are significantly decreased suggesting that Shadoo may be inherently linked to prion replication or prion disease pathogenesis. These experiments define Shadoo as the third member of the prion protein family and, because of its functional similarities to PrPC, Shadoo may be a useful tool for deciphering the in vivo function of PrPC. DPPX, a neuronal type II transmembrane protein, is demonstrated to be the first protein capable of interacting with all three members of the prion protein family (PrPC, Doppel, and Shadoo) in vivo. Complex formation between prion proteins and DPPX appears to be mediated by multiple binding sites. When coupled with high levels of DPPX expression in cerebellar granular neurons, DPPX is a strong candidate for mediating phenotypic interactions between prion proteins in cerebellar cells. Thus, Shadoo and DPPX comprise two new entry points for studying prion proteins. Further investigation of the roles of Shadoo and DPPX in both the cell biology of prion proteins and prion disease may yield important clues to these enigmatic topics.

Der Wnt/β-catenin Signalweg reguliert zusammen mit anderen Signalkaskaden die Embryogenese sowie auch die Homöostase und die Proliferation der Stammzellen im adulten Organismus. Mutationen in Komponenten dieses Signaltransduktionsweges führen zu einer aberranten Aktivierung von β-catenin und wurden in vielen verschieden Krebsarten einschließlich Darmkrebs beobachtet. Die transkriptionelle Akivität von β-catenin wird von verschiedenen nukleären Kofaktoren beeinflusst. Hierzu zählen insbesondere die Proteine der Pygopus Familie, die in Drosophila eine essentielle Rolle im kanonischen Wnt-Signalweg spielen, in Vertebraten allerdings vielmehr Kontext abhängig agieren. Insbesondere Pygo2 ist hierbei vermutlich auch an der malignen Transformation verschiedener Zelltypen mit anschließender Ausbildung von Tumoren beteiligt. Auch wenn bereits gezeigt werden konnte, dass Pygo2 in Darmtumoren überexprimiert wird, ist bisher unbekannt, ob es tatsächlich eine Rolle bei der Entstehung von intestinalen Tumoren spielt. Anhand von genetischen Experimenten in der Maus zeigt diese Arbeit zum ersten Mal in vivo, dass Pygo2 für die normale Homöostase des Darms nicht essentiell ist, aber an der Ausbildung von Darmtumoren, welche durch eine Stabilisierung von β-catenin induziert werden, beteiligt ist. Weder im embryonalen noch im adulten Darm beeinflusste der konditionale Villin-Cre bedingte Knock-out von Pygo2 in epithelialen Zellen die normale embryonale Entwicklung oder die Homöostase im adulten Darm. Auch für die Regulation von Zielgenen des Wnt/β-catenin Signalweges unter physiologischen Bedingungen scheint Pygo2 funktionell redundant zu sein. Im Gegensatz dazu verhinderte der Verlust von Pygo2 die Entstehung von β-catenin induzierten intestinalen Tumoren und normalisierte die damit verbundene Hyperproliferation sowie die erhöhte Expression von Wnt/β-catenin Zielgenen und intestinalen Stammzellmarkern. Überraschenderweise konnte die Ausbildungen von Adenomen in ApcMin/+ Mäusen durch Deletion von Pygo2 nicht verhindert werden. Der Vergleich beider Mausmodelle ergab eine erhöhte Expression von BCL9-2 in den Adenomen der ApcMin/+ Mäuse aber nicht in den Hyperplasien, die durch aktiviertes β-catenin induziert wurden. Dies könnte darauf hinweisen, dass in Apc mutierten epithelialen Zellen BCL9-2 für die Tumorprogression verantwortlich ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sowohl der knock-down von Pygo2 als auch von BCL9-2 in human Kolonkarzinomzellen die Proliferation reduzierte. Anhand von immunohistochemischen Analysen des Phosphorylierungsstatus von ERK1/2, einem „downstream“ Effektor von K-ras, konnten außerdem pERK1/2 positive Zellen in den intestinalen Adenomen von ApcMin/+ Mäusen, nicht aber in hyperproliferierenden Zellen mit stabilisierten β-catenin nachgewiesen werden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit daraufhin, dass die Funktion von Pygo2 im Darm Kontext abhängig ist. Während in normalen epithelialen Zellen des Darms Pygo2 offensichtlich funktionell redundant ist, scheint es für die Ausbildung von intestinalen Tumoren, welche durch dereguliertes Wnt/β-catenin induziert werden, essentiell zu sein. Daher könnte Pygo2 ein idealer Angriffspunkt für die zielgerichtete Therapie von Darmtumoren mit β-catenin Mutation sein.

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Microvascular lesions of the brain are observed in numerous pathological conditions including Alzheimer's disease (AD). Regional patterns of microvascular abnormality can be characterized using current neuroimaging technologies. When applied to mouse models of human disease, these technologies reveal cerebral vascular patterns and help uncover genotype-to-phenotype relationships. This thesis focuses on the development and testing of techniques for measuring two perfusion-related metrics in mouse brain regions, namely, cerebral blood volume (CBV) and cerebral blood flow (CBF) using micro-computed tomography (micro-CT) and arterial spin labeling (ASL), respectively. The main developments for measurement of CBV have included: refinements to micro-CT specimen preparation; registration of micro-CT images to an MRI anatomical brain atlas; and masking of major vessels to calculate small-vessel CBV (sv-CBV). The development of this micro-CT technique provided reference values of CBV over neuroanatomical brain regions in wildtype mice. A separate study was conducted to assess regional sv-CBV in a mouse model of AD; this study was motivated by the prevalence of microvascular lesions in patients who suffer from AD. Significant regional differences in sv-CBV were found between AD-afflicted mice and controls. The main developments for measurement of CBF have included: design and implementation of accurate ASL slice positioning and optimization of inversion efficiency parameters. The development of this ASL technique provided reference values of CBF over neuroanatomical brain regions in wildtype mice. These techniques for measuring CBV and CBF over mouse brain regions could lead to improved characterization of vascularity in models of neurological diseases.

Microvascular lesions of the brain are observed in numerous pathological conditions including Alzheimer's disease (AD). Regional patterns of microvascular abnormality can be characterized using current neuroimaging technologies. When applied to mouse models of human disease, these technologies reveal cerebral vascular patterns and help uncover genotype-to-phenotype relationships. This thesis focuses on the development and testing of techniques for measuring two perfusion-related metrics in mouse brain regions, namely, cerebral blood volume (CBV) and cerebral blood flow (CBF) using micro-computed tomography (micro-CT) and arterial spin labeling (ASL), respectively. The main developments for measurement of CBV have included: refinements to micro-CT specimen preparation; registration of micro-CT images to an MRI anatomical brain atlas; and masking of major vessels to calculate small-vessel CBV (sv-CBV). The development of this micro-CT technique provided reference values of CBV over neuroanatomical brain regions in wildtype mice. A separate study was conducted to assess regional sv-CBV in a mouse model of AD; this study was motivated by the prevalence of microvascular lesions in patients who suffer from AD. Significant regional differences in sv-CBV were found between AD-afflicted mice and controls. The main developments for measurement of CBF have included: design and implementation of accurate ASL slice positioning and optimization of inversion efficiency parameters. The development of this ASL technique provided reference values of CBF over neuroanatomical brain regions in wildtype mice. These techniques for measuring CBV and CBF over mouse brain regions could lead to improved characterization of vascularity in models of neurological diseases.

La spermatogenèse, processus de production des gamètes mâles, représente un modèle physiologique pertinent pour l'étude de la dynamique de la chromatine. En effet, la chromatine de type somatique subit un remodelage drastique en fin de spermatogenèse, lors des étapes post-méiotiques. La chromatine, organisée en nucléosomes, est restructurée par enlèvement massif des histones qui sont remplacées par des petites protéines basiques spécifiques des spermatozoïdes, les protamines. Les mécanismes moléculaires responsables de cette transition structurale de la chromatine sont encore mal connus et constituent le champ d'investigation de notre laboratoire. D'autre part, la programmation de l'expression des gènes doit être finement régulée au cours de la spermatogenèse, afin de permettre l'expression des facteurs qui guideront les transitions structurales de la chromatine en post-méiose. Les marques épigénétiques mises en œuvre pour déterminer le statut d'expression des gènes sont encore mal documentées. Enfin, après fécondation de l'ovocyte par le spermatozoïde, le génome mâle subit à nouveau une restructuration visant à inverser le processus et à rendre la chromatine de type somatique, tout en prenant en compte les informations épigénétiques amenées par le spermatozoïde. Les évènements chromatiniens visant à reprogrammer le génome mâle après fécondation sont eux aussi peu connus. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à décrypter l'action de nouveaux acteurs épigénétiques, tels que des variants d'histones et des modifications post-traductionelles des histones, dans le cadre de la spermatogenèse chez la souris. Je démontre leurs implications lors du remplacement massif des histones en post-méiose, mais également vis-à-vis de la régulation de l'expression des gènes, ainsi que lors du développement embryonnaire précoce après fécondation. / The process of male gametogenesis, called spermatogenesis, represents a relevant physiological model to study chromatin dynamics. Indeed, a drastic chromatin remodeling occurs during the postmeiotic steps of spermatogenesis. The nucleosomal-based chromatin is restructured by massive eviction of histone and subsequent replacement by sperm small basic proteins, the protamines. Molecular mechanisms involved during this structural transition of chromatin are obscure, and constitute the area of investigation of our lab. On the other hand, gene expression program has to be tightly regulated during spermatogenesis, to allow expression of factors that will guide postmeiotic chromatin structural transitions. Implemented epigenetic marks which determined this gene expression program are poorly documented. Finally, the male genome undergoes a new chromatin restructuration after fertilization by an inverted process that lead to a somatic chromatin, while taking into account epigenetic information carried by the spermatozoa. Chromatin events involved in male genome reprogramming after fertilization are also poorly documented. During my PhD thesis, I have been interested in deciphering the role of new epigenetic actors in the context of murine spermatogenesis, as histone variants and histones post-translational modifications. I reveal their involvement in the massive postmeiotic histone replacement, for the regulation of gene expression, and in the early embryonic development.

La trisomie 21 (T21) résulte de la présence d’une extra-copie du chromosome 21 (Chr21). Parmi les gènes candidats impliqués dans les déficits cognitifs liés à la T21, DYRK1A est un des plus pertinents. Des études ont montré une corrélation entre l’augmentation de son activité kinase avec les déficits mnésiques observés dans les modèles murins de T21. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents aux altérations cognitives causées par son surdosage, nous avons utilisé des modèles murins sur-exprimant DYRK1A seule ou en plus d’autres gènes orthologues au Chr21, ainsi que des inhibiteurs spécifiques de DYRK1A (Leucettines) synthétisés par ManRos Therapeutics. Ici sont présentées les conséquences d’un traitement chronique avec ces Leucettines sur la cognition de ces animaux. Des analyses du phosphoprotéome de ces souris traitées ou non avec une des Leucettines, la L41, a mis en lumière des cibles et mécanismes biologiques impliqués dans les perturbations mnésiques de ces animaux. Enfin, ce projet a surtout permis de mettre en évidence un nouvel inhibiteur plus sélectif pour DYRK1A comme candidat-médicament pour l’amélioration des fonctions cognitives des porteurs de la T21. / Down Syndrome (DS), is due to the presence of an extra copy of chromosome 21 (Ch21). Among the candidates implicated in DS intellectual disabilities, DYRK1A is one of the most relevant. Several studies have shown a correlation between an increase of its kinase activity and the intellectual defects observed in DS models. In order to understand the mechanisms underlying the impact of DYRK1A overdosage on cognitive alterations, we used several trisomic mouse models expressing DYRK1A alone or with additional Hsa21 orthologous genes and specific DYRK1A inhibitors (Leucettines) from ManRos Therapeutics. We will present here the consequence of the Leucettines treatment following repetitive administration to several DS mouse models on the behavior and cognition. Further analysis of the phosphoproteome of DS mouse models treated or not with one of the Leucettine, the L41, unravels a few targets and pathways which are involved in the cognitive alterations observed in these trisomic mice. These results support the potential of more selective DYRK1A inhibitor as a therapeutic approach to improve cognitive functions in DS patients.

Les variations du nombre de copies (CNVs) incluent les délétions et les duplications de régions chromosomiques d’une taille variant de 50 pb à plusieurs Mb. Depuis 2005, les études d’association pangénomiques (GWAS) ont permis d’associer certains larges CNVs à des maladies syndromiques associées à la déficience intellectuelle incluant les syndromes de DiGeorge, Williams, Angelman, etc. En fonction de la densité génique de la région d’intérêt et de la variabilité des phénotypes associés, l’étude de la physiopathologie des syndromes peut être extrêmement complexe. La modélisation murine offre de nombreux avantages pour l’identification des gènes candidats et la compréhension des mécanismes moléculaires associés à ces pathologies.Les travaux présentés dans ce manuscrit consistent en la caractérisation des modèles murins pour cinq maladies syndromiques associées aux CNVs : la monosomie 21 partielle ainsi que les réarrangements des régions 16p11.1 et 17q21.31. Les caractérisations anatomiques, métaboliques et comportementales des animaux nous ont permis d’évaluer un grand nombre de paramètres associés à la symptomatique humaine. Nous avons également réalisé des analyses électrophysiologiques et transcriptomiques en ciblant nos investigations sur l’hippocampe, structure cérébrale qui joue un rôle central dans les processus de mémoire et d’apprentissage. Ce projet de recherche s’inscrit dans une perspective plus large qui est l’identification des gènes candidats pour les phénotypes observés et le développement de premières stratégies thérapeutiques pouvant potentiellement aboutir à l’amélioration des capacités cognitives des patients. / Copy number variations (CNVs) include deletions and duplications of chromosomal regions ranging in size from 50bp to several Mb. Since 2005, genome-wide association studies (GWAS) have associated some large CNVs to syndromic diseases linked to intellectual disability including DiGeorge, Williams, Angelman syndroms, etc. Depending on the gene density of the region of interest and the variability of symptoms, the study of the pathophysiology of syndromes can be extremely complex. Mouse modeling show many advantages for the identification of candidate genes and the understanding of molecular mechanisms associated with these diseases.The work presented in this manuscript consists of the characterization of mouse models of five syndromic diseases associated with CNVs: partial monosomy 21 and rearrangements of 16p11.2 and 17q21.31 regions. Anatomical, metabolic and behavioral characterizations of animals allowed us to evaluate a broad number of parameters associated with human phenotypes. We also performed electrophysiological and transcriptomic analysis focusing our investigation on the hippocampus which has a major role in learning and memory processes. This project is part of a wider perspective which is the identification of candidate genes for the different phenotypes we observe in the mouse and the development of first treatment strategies which can potentially lead to the improvement of cognitive capacity of patients.

L’autophagie est un processus catabolique lié aux lysosomes, essentiel à la l’homéostasie cellulaire notamment dans les lymphocytes. Elle est impliquée dans la pathogenèse de nombreuses maladies et pourrais jouer un rôle dans le développement de maladies auto-immunes. Nous avons voulu étudier son rôle in vivo dans les lymphocytes B et T. Nous avons généré des souris déficientes en autophagie spécifiquement dans ces cellules et montré que l’autophagie n’est pas essentielle au développement des LB, mais que dans un contexte auto-immun la persistance de plasmocytes et la production d’autoanticorps été diminuée. Cela démontre un rôle de l’autophagie dans les réponses à long terme. Les réponses humorales à long-terme T dépendantes sont également impactées. De plus des souris transplantées avec des LT CD4+ déficients en autophagie montrent une réponse humorale mémoire diminuée. Nous nous sommes également intéressé aux voies de signalisation conduisant à l’induction de l’autophagie en réponse à une stimulation du TCR dans des LT normaux et pathologiques. Nos résultats préliminaires montrent une implication de la voie calcique. / Autophay is a catobolic lysosomal process essentail for cellular maintenance and fucntion such as lymphocyte homeosatsis. The generation of mice models with an Atg5 conditional knock-out in B and T cells respectively, have allowed us to study autophagy requirements of those immune cells in vivo. We have demonstrated that autophagy was dispensable for B cell development but that in autoimmune settings B cell autophagy was required for the maintenance of long-lived plasma cells and for the production of autoantibodies. In mice deficient for autophagy in T cells, long-term tumoral response to a T-dependent antigen is decreased. We also showed that in mice adoptively transferred with autophagy deficient CD4 T cells, the antigen specific memory humoral immune response was impaired. We also investigated the signaling pathways leading to autophagy induction upon TCR stimulation in normal and lupus T cells and showed that the calcium signaling is highly involved.

Asthma ist eine Erkrankung die das komplette Immunsystems involviert, ein System so komplex, dass es sich nur unzureichend in-vitro studieren lässt. Daher haben sich Mausmodelle als ein unverzichtbares Werkzeug in der präklinischen Asthmaforschung etabliert. Da es sich weiterhin bei Asthma um eine Erkrankung handelt, die durch eine schnelle Änderung der Symptome gekennzeichnet ist, wäre longitudinale vorzugsweise nicht-invasive Bildgebung, insbesondere bei der Entwicklung und Bewertung neuer Therapiekonzepte von großem Interesse. Nachteilig hingegen ist, dass die Darstellung der Mauslunge in der Praxis auf Grund der Größe des Organs und, im Falle einer in vivo Bildgebung, durch die Bewegung des Brustkorbes sich als äußerst schwierig herausstellt. Die Vielzahl der Luft-Gewebe-Grenzflächen erzeugt starke Streuung in der optischen Bildgebung, der große Hohlraum der Lunge verursacht Suszeptibilitätsartefakte bei der MRT und die Rippen erschweren eine Ultraschallbildgebung. Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf an neuen Bildgebungsverfahren, um die durch Asthma verursachten anatomischen, funktionalen und molekularen Veränderungen darstellen zu können. Um die Schwierigkeiten in der Lungenbildgebung bei Mäusen zu umgehen, habe ich mich auf drei wesentliche Bildgebungsstrategien fokussiert: A) anatomische Bildgebung durch “inline free propagation phase contrast computed tomography”, B) direkte Messung der Lungenfunktion durch “low dose planar cinematic x-ray imaging” und C) funktionale Bildgebung mit Hilfe der „near infrared fluorescence imaging“ in Kombination mit Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, oder “smart probes”, die in Gegenwart von Entzündungen aktiviert werden. Durch die Anwendung von “phase contrast computed tomography” für die anatomische Bildgebung war ich in der Lage morphologische Veränderung des Lungengewebes zu quantifizieren, indem ich lokal das Verhältnis zwischen Weichgewebe und Luft, das Zusammenziehen der Luftwege sowie das Anschwellen der Bronchialwände im asthmatischen Lungengewebe ausgewertet habe. Diese Parameter erlaubten es zwischen Mäusen von Asthmamodellen unterschiedlicher Schweregrade, therapierten und gesunden Mäusen zu unterscheiden. Zusätzlich ermöglichte diese Technik die Darstellung intra-tracheal applizierter Bariumsulfat markierter Makrophagen im Lungengewebe. Dies stellt meines Wissens die erste Kombination einer funktionalisierten Kontrastierung und hochauflösender Lungenbildgebung mittels CT unter in vivo ähnlichen Bedingungen dar. Um diese Ergebnisse mit dem Grad der asthmabedingten Kurzatmigkeit zu korrelieren, habe ich eine einfache und verlässige Methode entwickelt die es, basierend auf 2D Röntgen-videos niedriger Röntgendosis (~6,5mGy) erlaubt, in narkotisierten Mäusen die Lungenfunktion zu bewerten. Mit Hilfe dieser neuen Methode gelang es mir charakteristische Unterschiede in der Lungenfunktion von asthmatischen, therapierten und gesunden Mäusen in vivo über die Zeit nachzuweisen, und diese Resultate mit den Ergebnissen von CT und Histologie zu korrelieren. Das Verfahren wird derzeit von mir für die Anwendung an frei beweglichen und nicht narkotisierten Mäusen weiterentwickelt. Dies sollte zu einer deutlichen Stressreduktion für die Maus bei der Untersuchung führen und somit, vor allem in Asthma, im Gegensatz zu etablierten Verfahren wie Plethysmographie, die Erhebung validerer Messdaten erlauben. Mit Hilfe von „near infrared fluorescence imaging“ konnten wir in vivo und longitudinal erfolgreich verschiedene durch Asthma ausgelöste molekulare Veränderungen in der Mauslunge verfolgen. Erstens erlaubte die Verwendung einer neuen Polyglyzerol Probe mit dendritischer Struktur (MN2012) die spezifisch an Selektine bindet, die Darstellung der durch Asthma verursachten Entzündung der Lunge. Im Zuge dessen konnten wir nachweisen, dass sich MN2012  zur Darstellung von Enzymkinetiken bei Entzündungsreaktionen durch eine schnellere Kinetik und höher Spezifität als kommerziell erhältliche Proben auszeichnet. Zweitens haben wir gezeigt, dass in Kombination mit einem Fluoreszenz markiertem Antikörper gegen SiglecF, einem Antigen das hauptsächlich auf Eosinophilen exprimiert ist, Eosinophilie in asthmatischen Mäusen verfolgt und der Effekt einer Dexamethason Behandlung  ebenso dargestellt werden kann. Drittens konnten wir den Verbleib inhalierter fluoreszierender Nanopartikel in der Lunge der Maus in vivo untersuchen und dabei nachweisen, dass diese hauptsächlich von endogenen Makrophagen im Lungengewebe aufgenommen werden. Alle diese Techniken wurden gegeneinander und mittels histologischer Analyse und Fluoreszenzmikroskopie korreliert und validiert.  Zusammenfassend bilden die in meiner Dissertation entwickelten Lungenbildgebungsstrategien für Asthmamausmodelle eine Bildgebungsplattform, um sowohl spezifische Effekte in asthmatischen Mäusen unterschiedlichen Schweregrades als auch die Auswirkungen neuer Therapien abzubilden und im Detail zu untersuchen.