Le thème des travaux qui fait l'objet de ce mémoire de thèse s'inscrit dans le cadre de la caractérisation de systèmes biologiques par modèles non entiers. Cette thèse comporte deux parties qui reposent sur deux collaborations distinctes. La première s'appuie sur une collaboration avec le laboratoire Mouvement Adaptation Cognition de l'Université Bordeaux 2 et l'institut Magendie de l'Inserm. L'objectif de ce travail consiste à étudier l'influence la longueur du muscle sur sa dynamique dans les cas de variations statiques et dynamiques de cette grandeur. La deuxième collaboration est un projet original, en partenariat avec l'équipe Anesthésiologie-Réanimation II du CHU Haut-Lévêque ayant pour but l'identification de transfert thermique dans le poumon au cours d'opération à cœur ouvert, grâce à des mesures obtenues sur des poumons de mouton.

Le muscle squelettique adulte est un tissu possédant la capacité fondamentale d'adapter sa taille à la demande fonctionnelle : il peut s'atrophier ou s'hypertrophier en réponse à une variation de la charge mécanique qui lui est appliquée. A l'heure actuelle, les facteurs impliqués dans la plasticité musculaire demeurent méconnus. D'une part, grâce à différents modèles d'atrophie musculaire, nous démontrons que le facteur de transcription Srf joue le rôle de médiateur de la mécano-transduction par la voie actine/Mrtfs/Srf. L'arrêt de l'activité mécanique provoque une accumulation nucléaire d'actine monomérique, une délocalisation de Mrtf-A, coactivateur de Srf, et une diminution de l'activité de Srf, se traduisant notamment par une baisse de la transcription Srf-dépendante. Les gènes cibles de Srf comptant un grand nombre de protéines sarcomériques, telles que l'α-actine squelettique, la réduction de leur expression pourrait participer à l'atrophie musculaire. De plus, nos travaux suggèrent que la diminution de l'activité de Srf pourrait influencer l'organisation du réseau mitochondrial et le flux autophagique par des mécanismes qui restent à élucider. D'autre part, en tirant parti d'un modèle d'invalidation conditionnelle et inductible de Srf dans les cellules satellites, nous montrons que le phénomène d'hypertrophie compensatoire requiert l'expression de Srf par les cellules satellites. L'absence de Srf n'altère ni la prolifération ni l'entrée en différenciation des myoblastes, néanmoins elle provoque un défaut de fusion des myoblastes aux fibres au cours de l'hypertrophie induite par surcharge. Ainsi, nos travaux démontrent que Srf est un acteur majeur de la plasticité musculaire, à la fois en tant que médiateur de la mécano-transduction par la voie actine/Mrtfs/Srf et par son implication dans la fusion des cellules satellites aux fibres musculaires, nécessaire à l'hypertrophie compensatoire.

Dans un premier temps, nous avons observé la chronologie des altérations de la biogenèse et de la fonction mitochondriale dans les ventricules droit (VD) et gauche (VG) et le muscle gastrocnémien (GAS) dans un modèle animal d'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Nous avons constaté une diminution précoce des facteurs impliqués dans la biogénèse mitochondriale du GAS. Plus tard, les mêmes anomalies apparaissaient dans le VD. Au stade décompensé de l'insuffisance cardiaque droite s'ajoutaient une diminution de la protéine PGC-1 , de l'activité de la citrate-synthase et de la respiration mitochondriale. L'expression des ARNm et la respiration mitochondriale du VG n'étaient pas modifiées de façon significative.Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'effet de l'entraînement en mode excentrique sur le même modèle d'HTAP. La survie des rats entraînés n'était pas différente de celle des rats sédentaires et la tolérance hémodynamique évaluée par échocardiographie et cathétérisme cardiaque a été bonne. Le bénéfice de l'entraînement s'est traduit par une augmentation de la vitesse maximale de course dans les deux groupes entraînés, malades et témoins.

Les β2-agonistes sont couramment utilisés pour prévenir et réduire les symptômes de l'asthme et de la bronchoconstriction induite par l'exercice. Mais, pris en quantités supérieures aux doses thérapeutiques, les β2-agonistes ont un effet anabolisant qui a été clairement démontré in vivo. Un certain nombre d'acteurs sont mis en jeu dans la réponse biologique du tissu musculaire aux β2-agonistes. L'un de ces acteurs est la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR, voie d'initiation de la traduction, ayant un rôle majeur dans la synthèse protéique. Dans ce contexte, notre première étude avait pour objectif de déterminer la cinétique des événements moléculaires responsables de l'hypertrophie du muscle squelettique de rat après administration de formotérol pendant 1 jour (J1), 3 jours (J3) et 10 jours (J10). Nous avons montré que l'administration de formotérol induisait une hypertrophie musculaire à J3 et J10 associée à l'activation transitoire de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR (J1 et J3), et à une diminution de l'expression de l'E3 ubiquitine ligase MAFbx/Atrogin-1 (J3). La voie autophagie lysosome ne semblait pas être affectée. Ainsi, l'ensemble de ces résultats suggère que l'activation de la voie PI3K/Akt/mTOR est associée à la voie ubiquitine-protéasome mais pas à la voie autophagie-lysosome. La régulation transitoire de la voie PI3K/Akt/mTOR suggère que d'autres voies de signalisation sont impliquées dans l'hypertrophie musculaire induite par le formotérol. Le 007-AM, analogue de l'AMPc, a été décrit comme pouvant stimuler la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR via l'activation de la protéine Epac, suggérant que le 007-AM puisse constituer une molécule de substitution à l'utilisation des β2-agonistes. Notre seconde étude avait pour but de déterminer si le 007-AM avait une action anabolisante sur le tissu musculaire, mais également de déterminer si la 007-AM était une molécule stable permettant d'envisager son usage dans un cadre pharmacologique. L'administration de 007-AM pendant 7 jours chez des souris n'engendrait pas d'hypertrophie musculaire. En revanche, in vitro sur cellules C2C12, le 007-AM activait la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR comme en témoignait l'augmentation de la phosphorylation des protéines rpS6 et 4E-BP1. Nos résultats montraient également que le 007-AM était instable dans le plasma alors que son produit de dégradation, le 007 était plus stable. Pris ensembles, ces résultats suggèrent qu'un traitement de 7 jours au 007-AM n'est pas suffisant pour induire une hypertrophie musculaire et que l'absence d'hypertrophie musculaire pourrait provenir de l'instabilité du 007-AM dans le plasma. Toutefois, des études supplémentaires seront nécessaires pour confirmer ces résultats

L’ingénierie du tissu musculaire squelettique vise à reconstituer in vitro un tissu fonctionnel aussi physiologique que possible dans le but de mieux comprendre la myogenèse, l’impact de mutations génétiques et tester des médicaments. Ces dernières années, différents modèles de tissus musculaires tridimensionnels ont été développés. Toutefois, l’utilisation prépondérante de cellules murines et la taille de ces modèles restreint leur pertinence pour les études de pathologies humaines et le criblage pharmacologique. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons donc développé différents modèles de tissus musculaires humains micrométriques pour répondre à ces limitations. Dans un premier temps, nous avons conçu et optimisé par microfabrication une plateforme caractérisée par la présence de microcanaux. Nous avons ainsi généré des tissus musculaires multicouches alignés présentant une organisation proche du muscle natif à partir de myoblastes murins immortalisés C2C12 puis de myoblastes humains immortalisés. Nous avons ainsi montré l’influence de la topographie et de la concentration cellulaire sur l’alignement des myotubes et la maturation du tissu musculaire. Dans un second temps, nous avons développé une plateforme constituée de micropuits contenant chacun deux micropiliers permettant d’analyser la contractilité des tissus. Des microtissus musculaires 3D standardisés ont ainsi été générés avec cette plateforme à partir de myoblastes murins, et de myoblastes C2C12 électroporés avec un gène muté ou non de la desmine. Par la suite, des microtissus ont été générés à partir de myoblastes humains. L’importance du choix de la matrice dans la formation des microtissus et les bénéfices d’une coculture de myoblastes et fibroblastes dans la stabilité des tissus ont ainsi été mis en évidence. La géométrie de micropiliers a aussi été optimisée afin de générer et comparer des microtissus composés de myoblastes isolés de patients sains et malades (dystrophie musculaire de Duchenne). Une preuve de concept démontrant la possibilité d’utiliser cette technologie pour tester des thérapies chimiques et géniques a été établie. Nous avons en effet suivi en temps réel les effets de l’inhibiteur de la kinase Rho-associée Y-27632 sur la contractilité des microtissus, ainsi que la transduction d’un gène rapporteur fluorescent modèle par les cellules composant les microtissus. Les résultats de ce travail de thèse démontrent le potentiel de cette technologie pour l’étude des processus fondamentaux de la myogenèse, l’évaluation des effets fonctionnels de mutations patient-spécifique et le criblage de thérapies chimiques et géniques. / Skeletal muscle tissue engineering aims to build functional and physiological tissues in vitro in order to better understand myogenesis, to investigate the impact of genetic mutations and to screen potential therapies. Over the past few years, bi- and tridimensional models of muscle tissue have been developed, but most of these models are based on the use of murine cells and require large amounts of cells, thus limiting their relevance to study pathologies of human muscles and drug screening assays. Here we aimed at developing different models of human muscle microtissues to address these issues. By using microfabrication techniques, we first engineered a microgrooved platform we used to generate aligned multilayered skeletal muscle tissues from murine C2C12 myoblasts and human immortalized myoblasts. We showed the impact of topography and cell density on the maturation and myotube alignment. We then fabricated a microdevice, consisting of microwells containing two micropillars allowing an easy access to the contractility of muscle tissues. We engineered microtissues from C2C12 and C2C12 myoblasts electroporated with a mutated gene of desmin, and showed some limitation of this technique of transduction. Finally, we generated microtissues from human myoblasts. We investigated the role of the extracellular matrix in the tissue formation and evidenced the benefits of coculturing myoblasts and fibroblasts on the stability of muscle microtissues. Furthermore, we optimized the geometry of the micropillars to engineer and compare microtissues composed of human myoblasts isolated from healthy and diseased (Duchenne muscular dystrophy) patients. A proof of concept of the potential of this technology for screening chemical and gene therapies was established. We were indeed able to analyze in real time the effects of the Rho-associated kinase-inhibitor Y-27632 on the tissue contractility, as well as the transduction of a model fluorescent reporter gene. Altogether, the results of this work demonstrate the potential of this technology to study fundamental muscle biology, examine functional effects of patient-specific mutations or screen chemical and gene therapies.

Dans un premier temps, nous avons observé la chronologie des altérations de la biogenèse et de la fonction mitochondriale dans les ventricules droit (VD) et gauche (VG) et le muscle gastrocnémien (GAS) dans un modèle animal d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Nous avons constaté une diminution précoce des facteurs impliqués dans la biogénèse mitochondriale du GAS. Plus tard, les mêmes anomalies apparaissaient dans le VD. Au stade décompensé de l’insuffisance cardiaque droite s’ajoutaient une diminution de la protéine PGC-1 , de l’activité de la citrate-synthase et de la respiration mitochondriale. L’expression des ARNm et la respiration mitochondriale du VG n’étaient pas modifiées de façon significative.Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’effet de l’entraînement en mode excentrique sur le même modèle d’HTAP. La survie des rats entraînés n’était pas différente de celle des rats sédentaires et la tolérance hémodynamique évaluée par échocardiographie et cathétérisme cardiaque a été bonne. Le bénéfice de l’entraînement s’est traduit par une augmentation de la vitesse maximale de course dans les deux groupes entraînés, malades et témoins. / We assessed the time courses of mitochondrial biogenesis factors and respiration in the right ventricle (RV), gastrocnemius (GAS) and left ventricle (LV) in a model of pulmonary-hypertensive (PH) rats induced by monocrotaline (MT). The expression of the studied genes was decreased early in the MT GAS. At 4 weeks, the MT GAS and MT RV showed decreased mRNA levels whatever the stage of disease, but PGC-1 protein and citrate-synthase activity were significantly reduced only atthe decompensated stage. The functional result was a significant fall in mitochondrial respiration at the decompensated stage in the RV and GAS. The mRNA expression and mitochondrial respiration were not significantly modified in the MT LV. Secondly, we assessed the effects of eccentric exercise training (ECCt) in MT rats with PH. ECCt was initiated 2 weeks after MT injection for 4 weeks. The trained MT rats survival was not different from that of sedentary rats. ECCt was not detrimental on hemodynamic condition estimated by echocardiography and right heart catheterization. Maximal speed significantly increased in trained rats. The mRNA expression of mitochondrial biogenesis factors were not significantly modified in skeletal muscle and in RV.

Le couplage excitation-contraction (EC) du muscle squelettique correspond à l’efflux de Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique (RS) suite à une dépolarisation sarcolemmale. Des mutations dans les gènes MTM1 et DNM2 sont responsables respectivement de la forme sévère et modérée de la myopathie centronucléaire (CNM). Chez la souris Mtm1 KO, l’absence de la (PtdInsP) 3-phosphatase MTM1 est associée à une altération du couplage EC, propablement la cause majeure de la faiblesse musculaire. Le rôle du PdtIns(4,5)P2 dans la régulation du couplage EC a été étudié dans des fibres musculaires exprimant une PtdInsP phosphatase sensible au potentiel. Grâce à une combinaison d’électrophysiologie et d’imagerie confocale, nous avons montré une altération de l’efflux calcique en réponse à de fortes dépolarisations déplétant les stocks de PdtIns(4,5)P2 à la membrane.Dans un deuxième temps, une caractérisation complète des défauts de signalisation calcique et du couplage EC a été réalisée dans les fibres musculaires isolées de souris Mtm1 KO. Nos résultats indiquent que l’efflux calcique est d’amplitude réduite, est retardé et est spatialement hétérogène. L’inhibition pharmacologique de l’activité PtdInsP 3-kinase améliore ces défauts in vitro et la survie des souris in vivo, suggérant que l’accumulation des substrats de MTM1 participe au défaut du couplage EC. Ces résultats montrent le bénéfice thérapeutique d’une approche pharmacologique aux inhibiteurs d’activité PtdInsP 3-kinase.Enfin, nous avons montré que les fibres musculaires d’un modèle murin de la forme modérée de CNM (KI-Dnm2R465W) partagent certaines altérations du couplage EC avec le modèle Mtm1 KO (retard de l’efflux calcique) pouvant contribuer à la faiblesse musculaire. Cependant, d’autres défauts (altérations structurales, réduction de l’efflux calcique) affectent plus sévèrement le modèle Mtm1 KO, et pourraient être déterminants dans la différence de sévérité entre les deux formes de CNM / Excitation-contraction (EC) coupling is the process whereby a membrane depolarization leads to an increased cytosolic Ca2+ content, allowing contraction. Mutations in the genes MTM1 and DNM2 are responsible respectively for severe and moderate forms of centronuclear myopathy (CNM). In Mtm1 KO mouse model, MTM deficiency is associated with defective EC coupling, which makes probably the major contribution to muscle meakness.PdtIns(4,5)P2 involvement in regulating EC coupling has been investigated in muscle fibers expressing a voltage sensing PtdInsP phosphatase. Thanks to a combination of electrophysiology and confocal imaging techniques, we showed a reduction of SR Ca2+ release amplitude in response to strong depolarizations activating PdtIns(4,5)P2 depletion at plasma membrane.Secondly, we made a complete characterization of calcium signaling and EC coupling properties in isolated muscle fibers from Mtm1 KO mice. Our results demonstrate that SR Ca2+ release is depressed, delayed and spatially heterogeneous in diseased fibers. Moreover, we showed that pharmacological inhibition of PtdInsP 3-kinase activity improves these defects in vitro and mice survival in vivo, suggesting that accumulation of MTM1 substrates may participate to defective EC coupling. Overall, these results provide proof of concept for the use of PtdIns 3-kinase inhibitors in severe form of CNM.Finally, we showed that muscle fibers from murine model of moderate CNM form (KI-Dnm2R465W) share some of EC coupling defects with Mtm1 KO model (delayed SR Ca2+ release) that may contribute to muscle weakness. However, other defects (structural alterations, depressed SR Ca2+ release) affect more severely Mtm1 KO model, and may be critical in determining the severity of CNM

Le muscle squelettique (MS) est un tissu métabolique important. L'objectif de ma thèse était de caractériser le rôle des corégulateurs de la transcription, PGC-1β (transcriptional coactivator peroxisome proliferator-activated receptor-gammacoactivator 1beta) et TIF2 (Transcriptional Intermediary Factor 2) dans ce tissu. Mon travail a démontré que PGC-1β limite le stress oxydatif est crucial dans le maintien de la structure et de la fonction mitochondriale, via le contrôle de l’expression de gènes impliqués dans les voies de signalisation liées à l’énergie, à la dynamique mitochondriale et à la machinerie d’import mais n'est pas indispensable pour le contenu mitochondrial. Mon travail aussi démontré que TIF2 de la MS a un impact négatif sur la durée de vie des mammifères. De plus, la déplétion de TIF2 conduit à une protection partielle du MS contre les dommages oxydatifs induits par le stress. Ainsi notre travail représente une avancée dans l’établissement futur de traitements contre les troubles liés au stress oxydatif et au vieillissement. / Skeletal muscle (SM) accounting for ~ 40% of total body mass is an important metabolic tissue. The aim of my thesis was to characterize the role of transcriptional coregulators, peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1β (PGC-1β) and transcriptional intermediary factor 2 (TIF2) in this tissue. My work demonstrated that PGC-1β is crucial to maintain SM mitochondrial structure and function, by controlling expression of genes involved in energy pathways, mitochondrial dynamics and import machinery, but is dispensable for mitochondrial content and fiber type maintenance. Furthermore, it limits oxidative stress. The second part of my work demonstrated that myofiber TIF2 has negative impact onmammalian life span. Moreover, TIF2 ablation leads to partial protection of SM from oxidative stress-induced damage. In conclusion, our work provides a better understanding of SM homeostasis regulation and insights in treatments for disordersrelated to oxidative stress and aging.

L'ingénierie tissulaire consiste à assembler de façon intelligente des cellules et des matériaux biocompatibles dans le but de créer des tissus artificiels. Pour la construction de tissus en laboratoire, il est indispensable d'élaborer des matériaux qui miment cet environnement. Dans ce cadre, la collaboration entre les scientifiques de différents domaines (matériaux, chimie, biologie, biochimie) s'avère nécessaire. L'ingénierie du muscle squelettique est prometteuse pour remplacer le tissu musculaire endommagé et pour le traitement des maladies du muscle, mais aussi pour les essais pharmaceutiques. Dans ce but, les matériaux avec les propriétés mécaniques et chimiques contrôlées sont requis -- pour l'amplification et la différenciation in vitro de cellules souches musculaires, mais aussi pour l'étude de la myogenèse sur des microenvironnements contrôlés 2D et dans les matrices 3D. Dans ce travail, nous avons utilisé la technique d'assemblage couche par couche (LbL, layer-by-layer) pour deux buts. Le premier a été de développer de nouveaux films biomimétiques possédant des propriétés biochimiques et mécaniques parfaitement contrôlées, pour étudier les interrelations entre ces deux paramètres sur les processus cellulaires. En plus, nous avons associé ces films biomimetiques aux substrats avec la topographie contrôlée, afin de guider la formation du tissu. Dans un second temps, nous avons utilisé la technique LbL pour organiser les cellules en structures 3D. Nous avons ainsi crée des microtissus d'épaisseur contrôlée, qui pourraient être utilisés en tant que modèles de tissus artificiels pour les applications thérapeutiques ou pour les évaluations de médicament en industrie pharmaceutique. / Tissue engineering approach consists in combining cells, engineering and biomaterials to improve the biological functions of damaged tissues or to replace them. Production of “artificial tissues” is still challenging and requires collaboration of scientists from different domains like cell biology, chemistry, materials and polymer science. Skeletal muscle tissue engineering holds promise for the replacement of muscle due to an injury and for the treatment of muscle diseases, such as muscle dystrophies or paralysis, but is also required for pharmaceutical assays. To this end, materials with tunable mechanical and biochemical properties for myoblast expansion and differentiation in vitro, as well as for the studies of myogenesis on controlled 2D microenvironments or in 3D scaffolds, are crucially needed. In this work, we use layer-by-layer (LbL) assemblies for two goals. The first consisted in the development of multifunctional biomimetic thin films for the control of skeletal muscle cell fate on 2D substrates. We use LbL films made of polypeptides, which can be stiffened by chemical cross-linking and can be specifically functionalized by grafting of biomimetic peptides onto their surface. In addition, we combined the peptide-grafted films with substrate microtopography. Such approach is promising for the development or multifunctional materials that combine the different stimuli present in in vivo ECM, among them physical and biochemical cues, but also microtopography. In the second part, we use LbL assemblies for the construction of 3D skeletal muscle microtissues. This allows to rapidly build 3D muscle tissues and is promising for the in vitro construction of physiologically relevant skeletal muscle tissue models.

L’ischémie-reperfusion (IR) du muscle squelettique est à l’origine de lésions au niveau local et au niveau systémique. Au niveau musculaire, l’IR est caractérisée par une atteinte de la chaîne respiratoire mitochondriale, une production de ROS et une activation de l’inflammation. Au niveau systémique, ces lésions peuvent aboutir à un tableau de défaillance multiviscérale. La physiopathologie et la chronologie précise de ces évènements demeurent néanmoins imprécises. Enfin, différentes stratégies ont été développées pour limiter ces lésions. Récemment, le dérivé Bβ (15-42) de la fibrine (nommé FX06) et le perconditionnement ont permis de protéger le myocarde des lésions d’IR. Les objectifs de notre travail sont de préciser, au niveau du muscle squelettique, les mécanismes à l’origine de ces lésions et d’évaluer ces deux nouvelles stratégies. Sur un modèle animal d’IR du muscle squelettique, nous avons observé une production de ROS pendant l’ischémie, préalable à l’atteinte mitochondriale et peut-être à l’origine de l’inflammation, et enfin une absence d’atteinte systémique au niveau mitochondrial après 2 heures et 24 heures de reperfusion. En ce qui concerne les traitements étudiés dans ce travail, nous n’avons pas pu démontrer l’efficacité du perconditionnement ischémique. Nous avons pu constater par contre que le peptide FX06 dérivé de la fibrine permet de prévenir l’apparition de ces lésions. Ces nouvelles connaissances vont nous permettre d’élaborer de nouvelles stratégies pour prévenir le développement des lésions d’IR. / Lower limb ischemia-reperfusion (IR) results in skeletal muscle mitochondrial alterations, production of reactive oxygen species (ROS), inflammation and remote organ impairments which are largely involved in patients prognosis. However, whether ischemia without reperfusion increases ROS production and preceedes mitochondrial alteration and whether mitochondrial dysfunction occurs early in remote organ is unknown. Remote ischemic perconditioning (PerC) and Fibrin-derived peptide Bβ(15-42) (FX06) prevent during cardiac IR but whether and how PerC and FX06 might protect skeletal muscle is unknown. This study tested whether PerC and FX06 would decrease skeletal muscle inflammation and reduce reactive oxygen species (ROS) production and mitochondrial dysfunction during IR. In an animal lower limb ischemia-reperfusion model, the objectives of our study were therefore to determine simultaneously the kinetic of ROS production, mitochondrial respiration and inflammation changes in skeletal muscle and remote organs during ischemia reperfusion and to challenge the effect of PerC and FX06 on mitochondrial respiratory chain complexes activities, ROS production and inflammation. We observed that oxidative stress preceedes skeletal muscle mitochondrial dysfunction and probably may be seen before inflammation activation. FX06 decreased inflammation, normalized ROS production and restored mitochondrial oxidative capacity during experimental skeletal muscle IR. PerC not only failed to protect ischemic skeletal muscle but impaired contralateral non ischemic suggesting that such therapy should be used with caution. This better knowledge will allow us to develop new strategies to prevent the development of IR lesions.