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Thema: „Einfluß der zyklischen mechanischen Dehnung auf humane Gefäßzellen aus der Tunica media von der Vene, Arterie und Aorta“ Autor(en): Neubert D. [1],Mohr F.W.[2], Dhein S.[2] Institut(e): [1]Sana Kliniken Leipziger Land, Gefäßchirurgie, Borna, Germany, [2]Universität Leipzig, Herzzentrum, Klinik für Herzchirurgie, Leipzig, Germany Fragestellung: Verhalten humaner glatter Gefäßmuskelzellen unter der zyklischen mechanischen Dehnung im Zellkulturexperiment. Methodik: Es wurden erstmalig Veränderungen der Proteinexpressionen von α-SM Aktin, Prolyl- 4-Hydroxylase, Decorin und Kollagen I unter statischen Bedingungen und zyklischer mechanischer Dehnung beobachtet. Hierzu wurden die Zellen mittels Gewebeverdau aus nativen humanen Arterien, Aorta und Venen gewonnen. Die Experimente wurden mit Hilfe einer „Flexercell strain unit“ durchgeführt und die Zellkulturen unter Zellkulturbedingungen auf „Bioflex“-kollagenbeschichtete Platten einer Dehnung von 10%, 0.5 Hz, 24 und 96 Stunden ausgesetzt. Die Proteinanalyse erfolgte mittels Western Blot. Ergebnis: Es läßt sich folgern, dass eine abnehmende und fehlende zyklische mechanische Dehnung eine Phänotypänderung der arteriellen Gefäßzellen aus der Tunica media von kontraktilen hin zum sekretorischen und proliferativen Typ bewirkt. Konträr verhält es sich unter Vorliegen einer zyklischen mechanischen Dehnung wie der pulsatilen Wanddehnung. Hierbei wird in den arteriellen Gefäßzellen der kontraktile Phänotyp ausgebildet. In den Gefäßzellen der Venen konnte unter Zellkulturdehnung eine starke Zunahme der extrazellulären Matrix und die Begünstigung des sekretorischen und damit proliferativen Typs beobachtet werden. Schlussfolgerung: Bei fortschreitender Arteriosklerose einhergehend mit der Abnahme der Wandelastizität und dadurch reduzierter pulsatiler Stimuli ist eine zunehmende Zellproliferation und Synthese von extrazellulärer Matrix zu erwarten, welche folgend die Progredienz stenotischer Gefäßveränderungen bewirken würde. In diesem Kontext begünstigen möglicherweise die medizinischen minimalinvasiven Behandlungen mit Stentgraftmaterialien die Gefäßwandhyperplasie mit Ausbildung von Restenosen. In der Gefäßchirurgie häufig beobachteten Stenosierungen im Bereich der Gefäßnaht könnten durch den Verlust der Wandelastizität und hierdurch Reduktion der Wanddehnung im Bereich der Nahtlinie erklärt werden. Unter Annahme einer geringeren Gefäßwandelastizität bei erhöhten Gefäßwandtonus wären Beobachtungen zu protektiven Massnahmen wie auch medikamentöse Behandlungen im frühen Stadium der pAVK wie zum Beispiel durch Abnahme des peripheren Gefäßtonus mit peripheren Vasodilatatoren sinnvoll. Die unter Zellkulturdehnung beobachtete starke Zunahme der extrazellulären Matrix der glatten Muskelzellen der Vene sollte eine Erklärung für die höhere Stenoseneigung durch Gefäßwandhyperplasie und Hypertrophie in arterialisierten Venen sein. Der regulatorische Einfluß des pulsatilen Stimulus findet im Zusammenhang mit dem Verständnis des humanen Gefäßsystems und dessen Erkrankungen einschließlich der Reaktion in vivo auf medizinische Eingriffe noch wenig Anerkennung.

Anhand von immunhistochemischen Färbemethoden wurde die Expression von CD 31 (immunhistochemischer Marker für Endothelzellen) und -Aktin (immunhistochemischer Marker für glatte Muskelzellen) auf Zellen der intramyokardialen Blutgefäße herztransplantierter Patienten histomorphometrisch ausgewertet. In die Bewertung der myokardialen Strukturen ging auch die Untersuchung der jeweiligen zugehörigen HE-Färbungen mit ein. Ziel dieser Untersuchungen war die Beurteilung von qualitativen und quantitativen Unterschieden dieser Marker während eines Untersuchungszeitraumes von 14 Monaten nach Herztransplantation (HTx) bei Patienten mit einer angiographisch diagnostizierten Transplantatvaskulopathie (TVP) mit Patienten ohne einer prä- bzw. postmortem diagnostizierten TVP. Der Einsatz dieser Immunomarker richtete sich hierbei auf die selektive Darstellung der terminalen Strombahn mit der Fragestellung, ob ein intramyokardiales morphologisches Korrelat zu der TVP der epikardialen Blutgefäße existiert und ob die histomorphometrische Auswertung der bewerteten Strukturen eine mögliche Frühdiagnose der TVP nach HTx zuläßt. Des weiteren sollte eine mögliche Assoziation der TVP mit den demographischen Charakteristika sowie der Anzahl und dem Schweregrad der Rejektionsepisoden der untersuchten Patienten überprüft werden. Als Basis dienten dabei in Paraffin eingebettete rechtsventrikuläre Rejektionskontrollbiopsien, die im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Abstoßungsdiagnostik entnommenen wurden. Nach morphologischer Bewertung dieser Schnitte im Hinblick auf die Existenz und den Schweregrad einer Abstoßungsreaktion wurden diese immunhistochemisch aufbereitet und anschließend quantitativausgewertet. Im Rahmen dieser Arbeit weist die quantitativ- histomorphometrische Erfassung intramyokardialer Blutgefäße in rechtsventrikulären Rejektionskontrollbiopsien auf die mögliche Frühdiagnose einer TVP nach HTx hin. Dieses Verfahren könnte die zur Zeit verwendeten diagnostischen Methoden ergänzen. Jedoch sind noch weitere prospektive klinische Studien für die Validierung dieser Ergebnisse notwendig. / In this study, immunohistochemical and histomorphometric investigations were performed in order to investigate the expression of CD 31 (immunohistochemical marker for endothelial cells) and -Aktin (immunohistochemical marker for smooth muscle cells) on cells of intramyocardial blood vessels in heart transplant (HTx) patients. The evaluation of myocardial structures also implicated the investigation of the corresponding histological H & E stainings. The aim of this study was to ascertain whether HTx patients with angiographic evidence of graft vessel disease (GVD) showed different qualitative and quantitative expression of the above mentioned immunomarkers than HTx patients with no angiopraphic or postmortem signs of this phenomenon. The investigation time included the first 14 months after HTx. The use of these immunomarkers made possible the selective representation of the terminal vascular system to answer the question, as to whether there existed an intramyocardial morphological correlate to GVD of epicardial coronary arteries and whether histomorphometric evaluation of small vessels permits early diagnosis of GVD after HTx. In addition, demographic data, as well the number and grade of rejection episodes of the studied patients, were reviewed in order to ascertain whether there might be an association of these characteristics with GVD. The material studied consisted of paraffin-embedded right ventricular rejection control samples from routine postoperative diagnostic management, which were used to reveal acute rejection episodes. After morphological evaluation of histological slices with regard to the appearence and severity of acute rejection, immunohistochemical staining was performed and finally a quantitative investigation was done. According to the results of this study, quantitative histomorphometric investigations of intramyocardial blood vessels in right ventricular rejection control samples permit the early diagnosis of GVD after HTx and completes the present diagnostic tools. But further prospective clinical studies are necessary to confirm these results.

Thema: „Einfluß der zyklischen mechanischen Dehnung auf humane Gefäßzellen aus der Tunica media von der Vene, Arterie und Aorta“ Autor(en): Neubert D. [1],Mohr F.W.[2], Dhein S.[2] Institut(e): [1]Sana Kliniken Leipziger Land, Gefäßchirurgie, Borna, Germany, [2]Universität Leipzig, Herzzentrum, Klinik für Herzchirurgie, Leipzig, Germany Fragestellung: Verhalten humaner glatter Gefäßmuskelzellen unter der zyklischen mechanischen Dehnung im Zellkulturexperiment. Methodik: Es wurden erstmalig Veränderungen der Proteinexpressionen von α-SM Aktin, Prolyl- 4-Hydroxylase, Decorin und Kollagen I unter statischen Bedingungen und zyklischer mechanischer Dehnung beobachtet. Hierzu wurden die Zellen mittels Gewebeverdau aus nativen humanen Arterien, Aorta und Venen gewonnen. Die Experimente wurden mit Hilfe einer „Flexercell strain unit“ durchgeführt und die Zellkulturen unter Zellkulturbedingungen auf „Bioflex“-kollagenbeschichtete Platten einer Dehnung von 10%, 0.5 Hz, 24 und 96 Stunden ausgesetzt. Die Proteinanalyse erfolgte mittels Western Blot. Ergebnis: Es läßt sich folgern, dass eine abnehmende und fehlende zyklische mechanische Dehnung eine Phänotypänderung der arteriellen Gefäßzellen aus der Tunica media von kontraktilen hin zum sekretorischen und proliferativen Typ bewirkt. Konträr verhält es sich unter Vorliegen einer zyklischen mechanischen Dehnung wie der pulsatilen Wanddehnung. Hierbei wird in den arteriellen Gefäßzellen der kontraktile Phänotyp ausgebildet. In den Gefäßzellen der Venen konnte unter Zellkulturdehnung eine starke Zunahme der extrazellulären Matrix und die Begünstigung des sekretorischen und damit proliferativen Typs beobachtet werden. Schlussfolgerung: Bei fortschreitender Arteriosklerose einhergehend mit der Abnahme der Wandelastizität und dadurch reduzierter pulsatiler Stimuli ist eine zunehmende Zellproliferation und Synthese von extrazellulärer Matrix zu erwarten, welche folgend die Progredienz stenotischer Gefäßveränderungen bewirken würde. In diesem Kontext begünstigen möglicherweise die medizinischen minimalinvasiven Behandlungen mit Stentgraftmaterialien die Gefäßwandhyperplasie mit Ausbildung von Restenosen. In der Gefäßchirurgie häufig beobachteten Stenosierungen im Bereich der Gefäßnaht könnten durch den Verlust der Wandelastizität und hierdurch Reduktion der Wanddehnung im Bereich der Nahtlinie erklärt werden. Unter Annahme einer geringeren Gefäßwandelastizität bei erhöhten Gefäßwandtonus wären Beobachtungen zu protektiven Massnahmen wie auch medikamentöse Behandlungen im frühen Stadium der pAVK wie zum Beispiel durch Abnahme des peripheren Gefäßtonus mit peripheren Vasodilatatoren sinnvoll. Die unter Zellkulturdehnung beobachtete starke Zunahme der extrazellulären Matrix der glatten Muskelzellen der Vene sollte eine Erklärung für die höhere Stenoseneigung durch Gefäßwandhyperplasie und Hypertrophie in arterialisierten Venen sein. Der regulatorische Einfluß des pulsatilen Stimulus findet im Zusammenhang mit dem Verständnis des humanen Gefäßsystems und dessen Erkrankungen einschließlich der Reaktion in vivo auf medizinische Eingriffe noch wenig Anerkennung.

Axolotl uniquely generates blastema cells as a pool of progenitor/stem cells to restore an entire limb, a particular property that other organisms, such as humans, do not have. What underlies these differences? Is the main difference that cells residing at the amputation plane (in the stump) undergo reprogramming processes to re-enter the embryonic program, which allows developmental patterning to start, or are there fundamental differences? There is also a significant debate about whether regeneration occurs via stem cell differentiation or by dedifferentiation of mature limb tissue. The aim of my thesis was to address following questions: Are the cells in the blastema reprogrammed or differentiated to regenerate? Are the blastema cells genetically reactivated de novo during regeneration? How does the amputated limb exactly know which part of the limb needs to be regenerate? Using a novel technique of long-term genetic fate mapping, my team demonstrated that dedifferentiation in regenerated axolotl muscle tissue does not occur. Instead, PAX7+ satellite cells indeed play an important role during muscle regeneration in the axolotl limb. Surprisingly, this is in contrast to the newt, which regenerates muscle cells through a dedifferentiation process. Therefore, there is a fundamental difference that underlies the regenerative mechanism ((Sandoval-Guzman et al., 2014) [KR1]). This demonstrates that there is an unexpected diversity and flexibility of cellular mechanims used during limb regeneration, even among two closely related species. Finally, if one salamander species uses a mammalian regenerative strategy (Cornelison and Wold, 1997; Collins et al., 2005) involving stem cells and another uses a dedifferentiative strategy, this raises the question of whether there are other fundamental aspects of regeneration that could also be anomalous. This hypothesis is promising since there could be more than one possible mechanism to induce mammalian regeneration. The process of limb regeneration in principle seems to be more similar to those of limb development as historically assumed. We showed molecularly that embryonic players are reused during regeneration by reactivating the position- and tissue-specific developmental gene programs by using the newly isolated Twist sequences as early blastema cell markers ((Kragl et al., 2013) [KR2]). To gain insights into the molecular mechanisms of the P/D limb patterning in general, it was crucial to study the early patterning events of the resident progenitor/stem cells by using the specific blastema cell marker HoxA as a positional marker along the proximo-distal axis. Our HOXA protein analysis using high molecular and cellular resolution as well as transplantation assays demonstrated for the first time that axolotl limb blastema cells acquire their positional identity in a proximal to distal sequence. We found a hierarchy of cellular restrictions in positional identities. Amputation at the level of the upper arm showed that the blastema harbors cells, which convert to lower arm and hand. We observed ((Roensch et al., 2013) [KR3]) for the first time that intercalation- the intermediate element (lower arm) arises later from an interaction between the proximal and distal cells identities- does not occur. Intercalation, which has been an accepted model for a long time, is not the patterning mechanism underlying normal (without any manipulation) limb regeneration that is unique to axolotl. We further demonstrated, using the Hox genes as markers that positional identity is cell-type specific since their effects were confirmed to be present in the lateral plate mesoderm- derived cells of the limb. As our knowledge about limb blastemas expands concerning cell composition and molecular events controlling patterning, the similarity to development is becoming more and more clear. My work has resolved many ambiguities surrounding the molecularly identification of different types of blastema cells and how P/D limb patterning occurs during regeneration in comparison to development. It has highlighted the importance of combining high-resolution methods, such as in situ hybridizations, single-cell PCR (sc-PCR) of individual dissociated blastema cells and genetic labeling methods with grafting experiments to map cell fates in vivo. In addition to understanding the processes of regeneration, another long-term goal in the regenerative medicine field is to identify key molecules that trigger the regeneration of tissues. Recently, my colleague Takuji Sugiura (Sugiura et al., 2016) observed that an early event of blastema formation is the secretion of molecules like MLP (MARCKS-like protein), which induces wound-associated cell cycle re-entry. Such findings further increase the enthusiasm of biologists to understand the underlying principles of regeneration. By building our knowledge of the molecules and pathways that are involved in tissue regeneration, we increase the possibility of identifying a way to ‘activate’ regenerative processes in humans and thus reach the final goal of regenerative medicine, which is to use the concepts of cellular reprogramming, stem cell biology and tissue engineering to repair complex body structures.

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Axolotl uniquely generates blastema cells as a pool of progenitor/stem cells to restore an entire limb, a particular property that other organisms, such as humans, do not have. What underlies these differences? Is the main difference that cells residing at the amputation plane (in the stump) undergo reprogramming processes to re-enter the embryonic program, which allows developmental patterning to start, or are there fundamental differences? There is also a significant debate about whether regeneration occurs via stem cell differentiation or by dedifferentiation of mature limb tissue. The aim of my thesis was to address following questions: Are the cells in the blastema reprogrammed or differentiated to regenerate? Are the blastema cells genetically reactivated de novo during regeneration? How does the amputated limb exactly know which part of the limb needs to be regenerate? Using a novel technique of long-term genetic fate mapping, my team demonstrated that dedifferentiation in regenerated axolotl muscle tissue does not occur. Instead, PAX7+ satellite cells indeed play an important role during muscle regeneration in the axolotl limb. Surprisingly, this is in contrast to the newt, which regenerates muscle cells through a dedifferentiation process. Therefore, there is a fundamental difference that underlies the regenerative mechanism ((Sandoval-Guzman et al., 2014) [KR1]). This demonstrates that there is an unexpected diversity and flexibility of cellular mechanims used during limb regeneration, even among two closely related species. Finally, if one salamander species uses a mammalian regenerative strategy (Cornelison and Wold, 1997; Collins et al., 2005) involving stem cells and another uses a dedifferentiative strategy, this raises the question of whether there are other fundamental aspects of regeneration that could also be anomalous. This hypothesis is promising since there could be more than one possible mechanism to induce mammalian regeneration. The process of limb regeneration in principle seems to be more similar to those of limb development as historically assumed. We showed molecularly that embryonic players are reused during regeneration by reactivating the position- and tissue-specific developmental gene programs by using the newly isolated Twist sequences as early blastema cell markers ((Kragl et al., 2013) [KR2]). To gain insights into the molecular mechanisms of the P/D limb patterning in general, it was crucial to study the early patterning events of the resident progenitor/stem cells by using the specific blastema cell marker HoxA as a positional marker along the proximo-distal axis. Our HOXA protein analysis using high molecular and cellular resolution as well as transplantation assays demonstrated for the first time that axolotl limb blastema cells acquire their positional identity in a proximal to distal sequence. We found a hierarchy of cellular restrictions in positional identities. Amputation at the level of the upper arm showed that the blastema harbors cells, which convert to lower arm and hand. We observed ((Roensch et al., 2013) [KR3]) for the first time that intercalation- the intermediate element (lower arm) arises later from an interaction between the proximal and distal cells identities- does not occur. Intercalation, which has been an accepted model for a long time, is not the patterning mechanism underlying normal (without any manipulation) limb regeneration that is unique to axolotl. We further demonstrated, using the Hox genes as markers that positional identity is cell-type specific since their effects were confirmed to be present in the lateral plate mesoderm- derived cells of the limb. As our knowledge about limb blastemas expands concerning cell composition and molecular events controlling patterning, the similarity to development is becoming more and more clear. My work has resolved many ambiguities surrounding the molecularly identification of different types of blastema cells and how P/D limb patterning occurs during regeneration in comparison to development. It has highlighted the importance of combining high-resolution methods, such as in situ hybridizations, single-cell PCR (sc-PCR) of individual dissociated blastema cells and genetic labeling methods with grafting experiments to map cell fates in vivo. In addition to understanding the processes of regeneration, another long-term goal in the regenerative medicine field is to identify key molecules that trigger the regeneration of tissues. Recently, my colleague Takuji Sugiura (Sugiura et al., 2016) observed that an early event of blastema formation is the secretion of molecules like MLP (MARCKS-like protein), which induces wound-associated cell cycle re-entry. Such findings further increase the enthusiasm of biologists to understand the underlying principles of regeneration. By building our knowledge of the molecules and pathways that are involved in tissue regeneration, we increase the possibility of identifying a way to ‘activate’ regenerative processes in humans and thus reach the final goal of regenerative medicine, which is to use the concepts of cellular reprogramming, stem cell biology and tissue engineering to repair complex body structures.