La transcétolase (TK, EC 2.2.1.1) est une enzyme catalysant la formation de cétoses de configuration D-thréo à partir d'aldéhydes α-hydroxylés (2R), par formation stéréospécifique d'une liaison C-C. L'objectif de ces travaux est d'inverser l'énantiosélectivité de cette enzyme par ingénierie afin d'obtenir des cétoses L-érytho (recherchés pour leurs applications potentielles dans les domaines pharmaceutique et/ou nutritionnel) à partir d'aldéhydes α-hydroxylés (2S). Dans ce but, une TK thermostable (mTKgst) issue de la bactérie thermophile Geobacillus stearothermophillus a d'abord été identifiée et produite. L'étude de sa structure tridimensionnelle a permis d'identifier deux résidus du site actif ayant un rôle potentiel dans l'inversion de son énantiosélectivité : Leu382 et Asp470. Des banques demTKgst mutées ont alors été créées, selon deux stratégies : rationnelle et semi-rationnelle. La première a consisté à muter les deux résidus sélectionnés par mutagenèse par saturation de site, tandis que la seconde a consisté à modifier deux séquences de cinq résidus contigus à aux positions clés, selon la mutagenèse par cassette. Afin d'identifier les mTKgst mutées d'intérêt, un test de criblage à haut-débit a été mis au point, basé sur le suivi pH-métrique de la réaction en présence de rouge de phénol. A l'issue du criblage, le variant mTKgst-L382D/D470S a été mis en évidence. Son activité vis-à-vis d'un aldéhyde modèle de configuration (2S) a été augmentée d'un facteur 5 par rapport à l'enzyme sauvage et la perte de l'énantiosélectivité vis-à-vis desaldéhydes (2R) a été confirmée.

La transcétolase (TK, EC 2.2.1.1) est une enzyme catalysant la formation de cétoses de configuration D-thréo à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2R), par formation stéréospécifique d’une liaison C-C. L’objectif de ces travaux est d’inverser l’énantiosélectivité de cette enzyme par ingénierie afin d’obtenir des cétoses L-érytho (recherchés pour leurs applications potentielles dans les domaines pharmaceutique et/ou nutritionnel) à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2S). Dans ce but, une TK thermostable (mTKgst) issue de la bactérie thermophile Geobacillus stearothermophillus a d’abord été identifiée et produite. L’étude de sa structure tridimensionnelle a permis d’identifier deux résidus du site actif ayant un rôle potentiel dans l’inversion de son énantiosélectivité : Leu382 et Asp470. Des banques demTKgst mutées ont alors été créées, selon deux stratégies : rationnelle et semi-rationnelle. La première a consisté à muter les deux résidus sélectionnés par mutagenèse par saturation de site, tandis que la seconde a consisté à modifier deux séquences de cinq résidus contigus à aux positions clés, selon la mutagenèse par cassette. Afin d’identifier les mTKgst mutées d’intérêt, un test de criblage à haut-débit a été mis au point, basé sur le suivi pH-métrique de la réaction en présence de rouge de phénol. A l’issue du criblage, le variant mTKgst-L382D/D470S a été mis en évidence. Son activité vis-à-vis d’un aldéhyde modèle de configuration (2S) a été augmentée d’un facteur 5 par rapport à l’enzyme sauvage et la perte de l’énantiosélectivité vis-à-vis desaldéhydes (2R) a été confirmée. / Transketolase (TK, EC 2.2.1.1) catalyzes the formation of D-threo ketoses from (2R)-α-hydroxyaldehydes by the stereospecific formation of a C-C bond. Our aim was to invert the enantioselectivity of TK by protein engineering in order to obtain L-erytho ketoses (sought after for their potential pharmaceutical and/or nutritional applications) from (2S)-α-hydroxyaldehydes. For that purpose, a thermostable TK from thermophilic bacterium Geobacillus stearothermophilus (mTKgst) has been identified and overexpressed. After the study of the 3D-structure of mTKgst, two residues located in its active site (Leu382 and Asp470) were selected as mutation targets for the inversion of the enzyme’s enantioselectivity. Both rational and semi-rational approaches were considered for the construction of the mutant mTKgst libraries. In the former, the two residues were modified by site-saturation mutagenesis. In the latter, short sequences of five amino acids, neighboring target ones, were modified using a cassette mutagenesis technique. A novel continuous pH-based assay has been developed for the high-throughput screening of the mTKgst libraries, using phenol red as pH indicator. The screening revealed mTKgst-L382D/D470S as the top mutant, showing a 5-fold activity improvement towards a model (2S)-hydroxyaldehyde and the loss of enantioselectivity towards the (2R)-aldehyde.

La transcétolase thermostable de Geobacillus stearothermophilus (TKgst, EC 2.2.1.1) permet de synthétiser efficacement à haute température des cétoses à 4, 5 et 6 atomes de carbone de configuration d-thréo (3S, 4R), par formation stéréosélective d’une liaison C-C, à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2R) à courte chaîne. L’objectif de ces travaux est d’utiliser la TKgst à 60°C pour gagner en efficacité et étendre son spectre de substrats à de nouveaux donneurs et accepteurs par Evolution dirigée, selon une approche semi-rationnelle, basée sur la mutagenèse par saturation de site. Ainsi, à l’issue du criblage des banques générées, les TKgst mutées les plus performantes (L382D/D470S, L191I, L382F/F435Y, R521Y/H462N et R521V/S385D/H462S) ont été sélectionnées pour leurs activités spécifiques supérieures à celle de la TKgst sauvage (gain de 3,3 à 5) vis-à-vis d’aldéhydes α-hydroxylés (2S) et d’aldéhydes α-hydroxylés (2R) à longue chaîne polyhydroxylée (C5-C6). La TKgst sauvage, ainsi que ces TKgst mutées performantes ont permis d’obtenir, à 60°C, onze cétoses, dont neuf de configuration l-érythro (3S, 4S) à 5 à 6 atomes de carbone et de configuration d-thréo (3S, 4R) de 4 à 8 atomes de carbone d’intérêt biologique, avec de très bons rendements, quatre étant inaccessibles avec les TKs microbiennes utilisées jusqu’alors. D’autres TKgst mutées ont par ailleurs conduit à une amélioration significative de l’activité de la TKgst vis-à-vis d’aldéhydes aliphatiques et aromatiques, mais également vis-à-vis d’un nouveau substrat donneur, l’acide pyruvique et d’analogues, ouvrant le champs des applications aux 1-désoxycétoses. De plus, ces travaux ont permis de développer un procédé multi-enzymatique innovant et éco-comptatible, dans lequel les substrats donneurs et accepteurs de la TKgst sont générés par voie enzymatique, via l’utilisation d’une transaminase ou d’une d-aminoacide oxydase et d’une aldolase, à partir de composés naturels et peu coûteux. Cette stratégie pourra être appliquée aux TKgst mutées, afin d’accéder efficacement et à moindre coût, à d’autres cétoses rares hautement valorisables. / Thermostable transketolase from Geobacillus stearothermophilus (TKgst, EC 2.2.1.1) catalyzes efficiently the synthesis of d-threo (3S, 4R) ketoses having 4, 5 and 6 carbon atoms, by the stereoselective formation of a new C-C bond, from short chain (2R)-α-hydroxylated aldehydes. The aim of this work is to use TKgst at 60°C, in order to increase reaction rates and to broad its substrate scope to new donors and acceptors by Directed Evolution, according to a semi-rationnal approach, based on site saturation mutagenesis. Thus, the screening of the libraries led to TKgst variants (L382D/D470S, L191I, L382F/F435Y, R521Y/H462N and R521V/S385D/H462S) having significantly improved specific activities towards (2S)-α-hydroxylated aldehydes and (2R)-α-hydroxylated aldehydes having a long polyhydroxylated chain (C5-C6), compared to wild type TKgst (3,3 to 5-fold increased activity). Wild-type TKgst as well as these TKgst variants were used, at 60°C, to obtain eleven, including nine l-erythro (3S, 4S) ketoses having 5 and 6 carbon atoms and d-threo (3S, 4R) ketoses having from 4 to 8 carbon atoms of biological interest, with good yields, four being inaccessible using common TK sources. Besides, other TKgst variants led to significantly improved activities towards hydrophobic aldehydes and towards a new donor substrate, pyruvic acid and derivatives, extending TKgst product scope to 1-deoxyketoses. In addition, a multienzymatic innovative and environmentally friendly process, in which TKgst substrates are generated through enzymatic pathways, using a transaminase or a d-aminoacid oxidase and an aldolase, from non-expensive and natural compounds was developed, in the presence of wild-type TKgst and will be able to be applied to TKgst variants, in order to synthesize efficiently and at lower cost, other highly valuable rare ketoses.