A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.

Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

Stuttgart, Univ., Diss., 2001.

Stuttgart, Univ., Diss., 2002.

O acúmulo de mutações, alterações incorporadas ao patrimônio genético de células somáticas e germinais, pode causar redução de populações naturais que são críticas para a cadeia alimentar, pondo em risco a sobrevivência de determinadas espécies. Embora o dano causado pela contaminação química ocorra em nível molecular, existem efeitos emergentes nas populações, tais como perda da diversidade genética, que não é previsível com base somente no conhecimento dos mecanismos de toxicidade não genéticos. Alguns compostos de origem antrópica tendem a adsorver no material orgânico do sedimento, sendo concentrados ao longo do tempo. Contaminantes ambientais podem ser mais associados com a porção fina dos sedimentos (silte ou argila) do que com a grosseira (areia ou cascalho). O presente estudo avaliou a atividade mutagênica e citotóxica de extratos moderadamente polares de sedimento em três pontos durante 5 coletas realizadas nos anos de 1999 e 2000 no arroio Bom Jardim, que drena a região do Complexo Petroquímico, localizado no município de Triunfo, Rio Grande do Sul. Foi utilizado na avaliação da mutagenicidade e citotoxicidade o ensaio Salmonella/microssoma, método de microssuspensão. A análise de granulometria mostrou um conteúdo de partículas finas em média menor no ponto em frente ao complexo, sendo este também o ponto amostral com menor percentual de material orgânico extraído. Observou-se baixa atividade mutagênica nos diferentes locais estudados, variando de 3,3% até 8,3%, sendo a citototoxicidade o mais importante efeito biológico observado na região, variando de 20% até 40%, somados os resultados dos ensaios em presença e ausência de metabolização externa. Os pontos com maior contaminação estão localizados em frente e a jusante da área industrial, havendo uma distribuição gradativa e sazonal das respostas à medida que o local se aproxima da foz do arroio. Em ensaios com ausência de fração de metabolização hepática, as respostas para mutagênese e citotoxicidade foram mais freqüentes, sendo os danos do tipo erro no quadro de leitura os mais presentes. A determinação da atividade mutagênica e citotóxica em amostras de sedimento mostrou-se importante na determinação da qualidade ambiental, apesar da composição química desta matriz ser bastante complexa. O ensaio Salmonella/microssoma monitorando danos moleculares e, principalmente citotoxicidade, foi uma ferramenta importante no diagnóstico da presença de poluentes. A possibilidade de avaliar danos precoces, através deste ensaio, promove a melhoria da qualidade ambiental e motiva ações de preservação do patrimônio genético da fauna e flora atingidas pela atividade antrópica.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T11:34:47Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15826 bytes, checksum: 80e9778f9db86d01b847c607230b3867 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T11:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15826 bytes, checksum: 80e9778f9db86d01b847c607230b3867 (MD5) Previous issue date: 2002-04-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O elemento transponível impala, isolado do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum, é capaz de sofrer transposição em Penicillium griseoroseum, porém, com uma baixa frequência. Em trabalho anterior, condições de estresse, testadas com o objetivo de aumentar a transposição de impala em P. griseoroseum, foram eficientes, sendo isoladas 691 colônias revertentes, em que o elemento impala havia sofrido transposição. Neste trabalho, foram feitas a caracterização molecular das linhagens revertentes e a avaliação da produção de enzimas pectinolíticas, com o objetivo de testar a eficiência de impala como ferramenta para a etiquetagem e isolamento de genes que codificam pectinases. As análises por hibridização das linhagens revertentes, utilizando como sonda o elemento impala e o gene niaD de A. nidulans, demonstraram que o tratamento por irradiação foi mais eficiente do que o choque térmico para a ativação da transposição em P. griseoroseum. Nas linhagens revertentes obtidas após a irradiação, um maior número de sítios de reinserção de impala foi observado. Entre as linhagens revertentes provenientes do choque térmico, uma apresentou perda total do elemento impala. Das 650 linhagens revertentes analisadas quanto à produção de pectinases, uma linhagem obtida após choque térmico apresentou atividade significativamente inferior de pectina liase quando comparada à linhagem selvagem. A região flanqueadora do novo sítio de inserção do elemento impala foi amplificada por PCR invertido. O fragmento amplificado de 600pb foi clonado e será utilizado como sonda para o isolamento do gene completo em um banco genômico da linhagem selvagem de P. griseoroseum. Este trabalho demonstra, pela primeira vez, que o elemento impala pode ser usado para a etiquetagem de genes no fungo Penicillium griseoroseum. / The tranposable element impala, isolated from the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum, suffers transposition in Penicillium griseoroseum, albeit at low frequency. In a previous work, stress conditions tested to increase impala transposition in P. griseoroseum have been show to be very efficient, resulting in the production of 691 revertant colonies in which impala had suffered transposition. In this work, a molecular characterization of revertant colonies and the analysis of pectinolytic enzyme were done to test impala efficiency as a tool for tagging and isolating pectinase gene. Hybridization analysis of revertant colonies using impala and the niaD gene of Aspergillus nidulans as probes demonstrated that UV treatment was more efficient than thermal shock for the activation of impala transposition in P. griseoroseum. In the revertant colonies obtained after UV irradiation, a larger number of reinsertion sites was observed. Among the revertants produced by thermal shock, one strain showed total loss of impala. Among 650 revertant colonies analyzed for pectinase production, one isolate obtained after thermal shock treatment presented significantly lower pectin lyase activity than the wild type strain. The flanking region of the new insertion site of impala was amplified by inverted PCR. A 600-pb amplified fragment was cloned and will be used as probe for the isolation of the complete gene from a library of the type strain of P. griseoroseum. ixThis work demonstrates for the first time that the element impala can be used for efficient gene tagging in P. griseoroseum.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-24Bitstream added on 2014-06-13T19:04:09Z : No. of bitstreams: 1 marcondes_jpc_dr_botfm.pdf: 345309 bytes, checksum: 8feb5bc849ad4ec9e213cb66ca068172 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os linfomas representam um grupo heterogêneo de tumores que acometem o tecido linfóide nodal e extranodal. O tratamento, baseado na utilização da poliquimioterapia associada ou não à radioterapia, tem proporcionado altas taxas de cura. Entretanto, é sabido que tais terapias podem induzir mutações genéticas que, mais tarde, podem ser responsáveis pelo desenvolvimento de neoplasias secundárias. Assim sendo, o presente estudo objetivou avaliar os efeitos tardios das terapias antineoplásicas para linfomas. Para isso, foram investigados os danos no DNA e a capacidade de reparo da molécula pelo teste do cometa, e a relação entre polimorfismos e expressão de dois genes de reparo do DNA - XRCC1 (codons 280 e 399) e hOGG1 (codon 326) – com os níveis de lesões genotóxicas. A casuística do estudo incluiu 3 grupos de indivíduos: 14 pacientes recém-diagnosticados com linfoma e antes de qualquer tratamento antineoplásístico (grupo pré-terapia); 29 pacientes com história de linfoma e que haviam finalizado o tratamento há no mínimo 2 anos (histopatologicamente negativos para neoplasia; grupo pós-terapia); 29 indivíduos saudáveis pareados por sexo, idade e hábito tabagista (grupo controle). Os resultados mostraram que os pacientes com diagnótico ou história de linfoma (pré e pós-terapia, respectivamente), apresentavam níveis aumentados de danos no DNA quando comparados aos indivíduos saudáveis. Esses dados evidenciam a relação entre a presença da doença e lesões no DNA, e que mesmo com diagnóstico negativo, os indivíduos com história de linfoma apresentam níveis aumentados de genotoxicidade até, em média, sete anos após o término da terapia. A menor capacidade de reparo do DNA observada nos pacientes do grupo pós-terapia, e o menor nível de expressão dos genes XRCC1 e hOGG1 nos pacientes pré e pós-terapia, poderiam ser explicações para tais achados... / Lymphomas are a heterogenous group of malignancies that arise in nodal sites with or without extranodal involvement. The treatment, based on polychemotherapy associated or not with radiotherapy, has provided high cure rates. However, it is known that such therapies can induce genetic mutations that could be related to development of second malignancies. Therefore, the present study aimed to evaluate the late effects of antienoplastic therapies for lymphomas. DNA damage and repair capability as depicted by the comet assay, and the relationship between DNA repair genes polymorphisms (XRCC1 codons 280 and 399, hOGG1 codon 326) or gene expressions and the levels of DNA lesions were investigated. Three groups were included in this study: pre-therapy, with 14 patients newly diagnosed with lymphoma and before any antienoplastic; post-therapy, with 29 patients with history of lymphoma and who had finished treatment at least three years before blood collection (histopathologically negative for neoplasia); control, with 29 healthy subjects matched for age, sex and smoking habit. The results showed that patients from pre- and post-therapy groups presented higher amount of DNA damage than the healthy subjects. These data first indicated that individuals with lymphoma have high frequency of primary DNA lesion in lymphocytes, then, that even with negative histopathological diagnostic, patients with history of lymphoma presented increased DNA damage until the average of 7 years after the end of therapy. The reduced DNA repair capability and the low XRCC1 and hOGG1 expression observed in the post-therapy group could explain such findings. Furthermore, higher DNA repair capability was observed in those subjects with XRCC399arg/arg, XRCC1280arg/his and hOGG1326ser/ser genotypes. In conclusion, our data demonstrated that lymphomas were associated with high level of damage and low DNA repai... (Complete abstract click electronic access below)

O acúmulo de mutações, alterações incorporadas ao patrimônio genético de células somáticas e germinais, pode causar redução de populações naturais que são críticas para a cadeia alimentar, pondo em risco a sobrevivência de determinadas espécies. Embora o dano causado pela contaminação química ocorra em nível molecular, existem efeitos emergentes nas populações, tais como perda da diversidade genética, que não é previsível com base somente no conhecimento dos mecanismos de toxicidade não genéticos. Alguns compostos de origem antrópica tendem a adsorver no material orgânico do sedimento, sendo concentrados ao longo do tempo. Contaminantes ambientais podem ser mais associados com a porção fina dos sedimentos (silte ou argila) do que com a grosseira (areia ou cascalho). O presente estudo avaliou a atividade mutagênica e citotóxica de extratos moderadamente polares de sedimento em três pontos durante 5 coletas realizadas nos anos de 1999 e 2000 no arroio Bom Jardim, que drena a região do Complexo Petroquímico, localizado no município de Triunfo, Rio Grande do Sul. Foi utilizado na avaliação da mutagenicidade e citotoxicidade o ensaio Salmonella/microssoma, método de microssuspensão. A análise de granulometria mostrou um conteúdo de partículas finas em média menor no ponto em frente ao complexo, sendo este também o ponto amostral com menor percentual de material orgânico extraído. Observou-se baixa atividade mutagênica nos diferentes locais estudados, variando de 3,3% até 8,3%, sendo a citototoxicidade o mais importante efeito biológico observado na região, variando de 20% até 40%, somados os resultados dos ensaios em presença e ausência de metabolização externa. Os pontos com maior contaminação estão localizados em frente e a jusante da área industrial, havendo uma distribuição gradativa e sazonal das respostas à medida que o local se aproxima da foz do arroio. Em ensaios com ausência de fração de metabolização hepática, as respostas para mutagênese e citotoxicidade foram mais freqüentes, sendo os danos do tipo erro no quadro de leitura os mais presentes. A determinação da atividade mutagênica e citotóxica em amostras de sedimento mostrou-se importante na determinação da qualidade ambiental, apesar da composição química desta matriz ser bastante complexa. O ensaio Salmonella/microssoma monitorando danos moleculares e, principalmente citotoxicidade, foi uma ferramenta importante no diagnóstico da presença de poluentes. A possibilidade de avaliar danos precoces, através deste ensaio, promove a melhoria da qualidade ambiental e motiva ações de preservação do patrimônio genético da fauna e flora atingidas pela atividade antrópica.