Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης, μέλη της υπερ-οικογένειας των ιοντικών διαύλων ενεργοποιούμενων από προσδέτη, είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά οι νικοτινικοί υποδοχείς διακρίνονται σε νευρικούς και μυϊκούς υποδοχείς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στα περιφερειακά γάγγλια και σε συγκεκριμένα τμήματα του εγκεφάλου, καθώς και σε μη νευρικούς ιστούς όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών, όπου ενέχονται στη διαβίβαση της νευρικής ώσης στους μυς και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών. Επιπλέον από το φυσιολογικό του ρόλο, ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης αποτελεί στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, με σημαντικότερο και καλύτερα μελετημένο το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών με μυασθένεια (~80%) ανιχνεύονται στο ορό αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (αντί-υποδοχέα αντισώματα) τα οποία οδηγούν στην ελάττωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη. Η μείωση του αριθμού των υποδοχέων προκαλεί αδυναμία δέσμευσης της ακετυλοχολίνης από τη μετασυναπτική μεμβράνη, αναστολή της σύσπασης του μυ και εκδήλωση μυϊκής κόπωσης και αδυναμίας, συμπτώματα χαρακτηριστικά της μυασθένειας. Οι υποδοχείς της μετασυναπτικής μεμβράνης δύνανται να ελαττωθούν μέσω δράσης του συμπληρώματος, αντιγονικής τροποποίησης ή λειτουργικής παρεμπόδισης. Οι σύγχρονες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της αναοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες. Για την προσέγγιση αυτή απαραίτητη είναι η απόκτηση ενός ανοσοπροσροφητή με διαμόρφωση που να προσομοιάζει αυτή του αντιγόνου-στόχου. Ωστόσο, η απόκτηση μεγάλων ποσοτήτων του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης καθίσταται εξαιρετικά δύσκολη εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του, του υδρόφοβου χαρακτήρα του και της αδυναμίας απομόνωσης του σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές. Για τους λόγους αυτούς, η έρευνα προσανατολίζεται στην μελέτη των εξωκυτταρικών περιοχών (ΕΚΠ) του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα στις οποίες προσδένεται η πλειονότητα των αυτοαντισωμάτων των μυασθενών. Η καθήλωση ανασυνδυασμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ, δ και ε του υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών εκφρασμένων στο ετερόλογο σύστημα Pichia pastoris είχε περιγραφεί και προηγουμένως από το εργαστήριό μας. Ωστόσο, αν και η χρήση των πρωτεϊνών αυτών ως ανοσοπροσροφητών κατάφερε την αφαίρεση ενός ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, δεν επετεύχθη η ικανοποιητική απομάκρυνσή τους. Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό των συνδεδεμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ ή ε και δ του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στο σύστημα έκφρασης P. pastoris. Στοχεύοντας στη δημιουργία ενός βελτιωμένου ανοσοπροσροφητή, πραγματοποιήθηκε η σύνδεση όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων του υποδοχέα χρησιμοποιώντας έναν πεπτιδικό συνδέτη. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ, κατασκευάστηκαν σε μία προσπάθεια μίμησης της διαμόρφωσης ολόκληρου του υποδοχέα σε ένα μοναδικό πολυπεπτίδιο. Τα πενταμερή, θεωρητικά φέρουν το σύνολο των αντιγονικών επιτόπων που αναγνωρίζουν τα αντισώματα αλλά και τις διεπιφάνειες των υπομονάδων που πιθανολογείται ότι είναι επίσης ανοσογόνες. Παράλληλα, μελετήθηκαν και τα διμερή α1-β ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ, τα οποία προέκυψαν ως ενδιάμεσα στάδια στην κατασκευή των πενταμερών και φέρουν την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή αλλά με ιδιαίτερα χαμηλό επίπεδο έκφρασης. Επιπλέον η ανοσοπροσροφητική τους ικανότητα ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων όχι μόνο δεν βελτιώθηκε αλλά παρουσιάστηκε μειωμένη σε σχέση με τις επιμέρους υπομονάδες. Αντίθετα, όσο αφορά στη χρήση συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, το διμερές α1-β ΕΚΠ φαίνεται να τηρεί ένα σύνολο προϋποθέσεων έναντι των πενταμερών β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ, β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ που το καθιστούν καλό υποψήφιο ανοσοπροσροφητή. Σε αυτές συγκαταλέγονται το σχετικά υψηλό επίπεδο παραγωγής του από το ετερόλογο σύστημα έκφρασης του P. pastoris καθώς και το γεγονός ότι απομονώνεται σε καθαρή μορφή. Σε ότι αφορά το ανοσοπροσροφητικό του προφίλ, φέρει την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα και τα απομακρύνει εξίσου αποδοτικά όσο και το μείγμα των μεμονωμένων α1 και β ΕΚΠ. Επιπλέον, το α1-β ΕΚΠ ως ένα πολυπεπτίδιο, υπερτερεί έναντι των μεμονωμένων α1 ΕΚΠ και β ΕΚΠ καθώς ο χαρακτηρισμός του όσο αφορά τις δοκιμασίες με στόχο την έγκριση για κλινική χρήση αναμένεται να είναι ευκολότερος έναντι των δύο πρωτεϊνών. Τέλος, η υψηλή χωρητικότητά του ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων μπορεί να εξασφαλίσει χαμηλό κόστος παραγωγής, έναν παράγοντα σημαντικό για την εφαρμογή της αντιγονοειδικής θεραπευτικής προσέγγισης σε μεγάλη κλίμακα. Ο επιτυχής χαρακτηρισμός του α1-β ΕΚΠ σχετικά με παραμέτρους σταθερότητας, τοξικότητας και ασφάλειας θα μπορούσε να σηματοδοτήσει την έναρξη των κλινικών δοκιμών για τη χρήση του ως ανοσοπροσροφητή στην εφαρμογή της νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη μυασθένεια σε ανθρώπους. / Myasthenia gravis is an antibody mediated autoimmune disease that affects the neuromuscular junction. The muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is the main antigen in myasthenia gravis. Circulating antibodies against the acetylcholine receptor are the main pathogenic factors, causing loss of the available functional receptors at the neuromuscular junction with the consequent impairment of signal transduction. Muscle nicotinic acetylcholine receptors are transmembrane proteins formed by 5 homologous subunits: two α subunits and three β, γ (in the embryo and replaced by ε in the adult) and δ. Typically, each subunit consists of an N-terminal extracellular domain (ECD), a transmembrane region and a cytoplasmic loop. The ECDs carry most of the epitopes for MG autoantibodies ,with subunit α baring the main immunogenic region. Current MG treatments include the use of anticholinesterase drugs, immunosuppressants or immunomodulators, plasmapheresis and thymectomy with none of these approaches being specific. The selective removal of anti-AChR antibodies from the blood of MG patients with an extracorporeal technique similar to plasmapheresis could be a therapeutic option. In our laboratory, we aim to develop this method using recombinant extracellular domains (ECDs) of the AChR subunits (α, β, γ, δ and ε) as immunoadsorbents immobilized on CN-Br Sepharose. We have previously described the expression of the individual ECDs in P. pastoris system and their characterization. The aim of this dissertation was to study and characterize the linked ECDs of the α, β, γ, δ and ε subunits expressed in the yeast P. pastoris system. In an attempt to improve immunoadsorption efficiency we expressed the AChR subunits linked with a flexible peptide linker 24 amino acids long. More specifically we designed and characterized two pentameric constucts namely β-δ-α1-γ-α1 ECD & β-δ-α1-ε-α1 ECD to mimic the whole pentameric extracellular domain of the AChR in a native conformation. We also examined two dimeric constructs (α1-β ECD & β1-α ECD) since these subunits carry the majority of MG epitopes. Regarding the pentamers, they were successfully expressed in the P.pastoris system but with the expression yield being relatively low. Furthermore their immunoadsorbing ability was limited in comparison with the mixture of all five ECDs. This fact, combined with their small expression yield, poses a serious obstacle for their use in therapy. On the other hand, both expression yield and antibody binding of the α1-β dimer were satisfactory, at least as good as the mixture of individual α and β ECDs. In addiction, the high capacity of thee α1-β ECD in combination with its expression yield suggests that few milligrams of protein could be sufficient for the clearance of the plasma from an average titer patient. Such a quantity could be easily obtained, allowing the large scale application of the method, while reducing the cost. Therefore, the α1-β dimer constitutes a suitable candidate to be used as efficient immunoadsorbent in the development of a specific therapy against MG. Further characterization of the α1-β ECD, with respect to stability, toxicity and safety aspects, could mark the initiation of animal studies. The successful completion of these studies is crucial for the advancement into clinical trials, for the use of the α1-β ECD as immunoadsorbent in the antigen-specific therapy for myasthenia gravis.

Η βαριά μυασθένεια (MG) αποτελεί μια αυτοάνοση νόσο η οποία χαρακτηρίζεται από μυϊκή αδυναμία. Η παθολογία της νόσου προκαλείται από την παρουσία αυτοαντισωμάτων που στοχεύουν πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης (NMJ). Πιο συγκεκριμένα, αντιγονικούς στόχους αποτελούν ο AChR, σε ποσοστό 80-85% των ασθενών, η MuSK σε ποσοστό 5-7% και η LRP4 σε ποσοστό 2-3%. Παρά την εκτεταμένη έρευνα, το ποσοστό των οροαρνητικών μυασθενών (SN-MG), δηλαδή ασθενών που δεν φέρουν αντισώματα για κανένα από τα ήδη γνωστά αντιγόνα, αποτελεί ένα σοβαρό κενό για την πλήρη κατανόηση της νόσου. Το γεγονός αυτό πιθανώς οφείλεται στην ύπαρξη άγνωστων μέχρι σήμερα αντιγόνων ή/και στη χαμηλή ευαισθησία των τεχνικών ανίχνευσης που είναι διαθέσιμες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο την ανάπτυξη ευαίσθητων διαγνωστικών τεχνικών για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι των αντιγόνων LRP4 και MuSK συνεισφέροντας στη μείωση των SN-MG. Η ανίχνευση των αντι-LRP4 αντισωμάτων πραγματοποιείται από την ευαίσθητη αλλά μόνο ποιοτική CBA τεχνική. Η ανάπτυξη μιας τεχνικής (RIPA, ELISA) για την ποσοτικοποίηση αυτών των αντισωμάτων είναι απαραίτητη για την παρακολούθηση της νόσου. Αντιθέτως, σε ότι αφορά στην MuSK-MG, πολύτιμη είναι η ανάπτυξη μιας ευαίσθητης τεχνικής όπου η MuSK θα βρίσκεται στην φυσική της διαμόρφωση (όπως στο CBA), σε αντίθεση με τις μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενες τεχνικές (RIPA). Με αυτό τον τρόπο θα είναι δυνατός ο εντοπισμός χαμηλής συγκέντρωσης αντι-MuSK αντισωμάτων ή αντισωμάτων που απαιτούν τη σωστά δομημένη πρωτεΐνη για να ανιχνευθούν. Η ανάπτυξη μιας ποσοτικής και ευαίσθητης διαγνωστικής μεθόδου ανίχνευσης αντισωμάτων προϋποθέτει την παραγωγή, απομόνωση και καθαρισμό ενός πολύ καλά δομημένου και ακέραιου αντιγόνου. Η ανθρώπινη LRP4 είναι μια μεγάλη διαμεμβρανική πρωτεΐνη (212 kDa) με πολύπλοκες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις. Η πολυπλοκότητα της συγκεκριμένη πρωτεΐνης καθιστά ιδιαίτερα δύσκολη την παραγωγή της σε ετερόλογα συστήματα έκφρασης. Συνεπώς, επιπλέον από την μοριακή κατασκευή για την έκφραση της διαμεμβρανικής LRP4, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες έκφρασης της εξωκυττάριας περιοχής (ΕΚΠ) της, καθώς και λειτουργικών τμημάτων αυτής. Τα συστήματα έκφρασης που χρησιμοποιήθηκαν επιλέχθηκαν με γνώμονα τους μεταμεταφραστικούς μηχανισμούς που διαθέτουν, καθώς και με την ικανότητα τους να εκφράσουν μεγάλες ποσότητες των επιθυμητών πρωτεϊνών. Πιο συγκεκριμένα, για την έκφραση ολόκληρης της LRP4 (1905aa) καθώς και της LRP4-ΕΚΠ (21-1725aa) πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκαν τα ευκαρυωτικά συστήματα έκφρασης των κυττάρων εντόμων (Sf9) επιμολυσμένα με βακιλοϊό και των θηλαστικών κυττάρων (HEK293), αντίστοιχα. Τα παραπάνω συστήματα έκφρασης είναι ικανά να εκφράσουν σωστά δομημένες πρωτεΐνες, με πλήρως λειτουργική δομή, αλλά συνήθως σε μικρές ποσότητες. Για την έκφραση των μικρότερων αλλά λειτουργικών τμημάτων της LRP4 χρησιμοποιήθηκαν τα συστήματα έκφρασης του ζυμομύκητα P. pastoris και των βακτηρίων E.Coli (BL21). Χαρακτηριστικό των συγκεκριμένων συστημάτων έκφρασης είναι οι μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης που μπορούν να παράξουν. Υπολείπονται όμως στο επίπεδο μεταμεταφραστικών μηχανισμών καθιστώντας δυσκολότερη την έκφραση πολύπλοκων πρωτεϊνικών μορίων. Τα τμήματα της LRP4 όπου τα επίπεδα έκφρασης και καθαρότητας επέτρεπαν την ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων, χρησιμοποιήθηκαν με στόχο την ανίχνευση αντι-LRP4 αντισωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, το LRP4-ΕΚΠ χρησιμοποιήθηκε ως καθηλωμένο αντιγόνο για την ανάπτυξη έμμεσης ELISA, εφαρμογή της οποίας επιβεβαίωσε μόνο το 14% των θετικών για LRP4 αντισώματα MG ασθενών (προηγουμένως ελεγμένοι με CBA). Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μιας ακόμα έμμεσης ELISA με τα τμήματα της LRP4 (785-1093aa, 1093-1439aa και 1004-1306aa) που εκφράστηκαν στο σύστημα έκφρασης των βακτηρίων ως καθηλωμένα αντιγόνα. Με την τεχνική αυτή επιβεβαιώθηκε πάλι περίπου το 10% των LRP4-MG. Ωστόσο, έπειτα από ιωδίωση του τμήματος 21-737aa της LRP4 που εκφράστηκε στον ζυμομύκητα P. pastoris αναπτύχθηκε μια τεχνική RIPA, η εφαρμογή της οποίας ανίχνευσε το 41,2% των θετικών MG για LRP4 αντισώματα. Συνεπώς η RIPA είναι η περισσότερο ευαίσθητη από τις διαγνωστικές τεχνικές που αναπτύχθηκαν. Οι προσπάθειες για την αύξηση της ευαισθησίας των διαγνωστικών εργαλείων που έχουν κατασκευασθεί συνεχίζονται, με στόχο τον ποσοτικό προσδιορισμό των LRP4 αντισωμάτων σε όλους τους LRP4-MG ασθενείς. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε έλεγχος τριπλά αρνητικών ορών μυασθενών με την MuSK-CBA τεχνική που αναπτύχθηκε. Πιο συγκεκριμένα, ελέγχθηκαν 633 SN-MG από 13 χώρες. Από τα αποτελέσματα βρέθηκε πως το 13% των SN-MG φέρει αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης MuSK. Η ειδικότητα της μεθόδου επιβεβαιώθηκε έπειτα από έλεγχο ορών υγιών δοτών και ασθενών με άλλες νευρολογικές νόσους εκ των οποίων βρέθηκαν θετικοί σε ποσοστό 1,9% και 5,1% αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι με τη συγκεκριμένη τεχνική ανιχνεύθηκε σημαντικός αριθμός διπλά θετικών ορών (AChR/MuSK και LRP4/MuSK) υποδηλώνοντας πως το συνολικό ποσοστό των πααραπάνω είναι τελικά μεγαλύτερο από αυτό που θεωρείται μέχρι σήμερα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε συλλογή και εκτίμηση των κλινικών χαρακτηριστικών των MuSK-CBA θετικών ασθενών. Συνοπτικά, το 27% των SN-MG με οφθαλμική MG (i.e. αποκλειστική εμφάνιση οφθαλμικών συμπτωμάτων) φέρουν αντισώματα έναντι της MuSK. Επιπρόσθετα, το 23% των προσφάτως ανιχνευμένων MuSK-MG εμφανίζει υπερπλασία του θύμου. Τα ποσοστά αυτά είναι πολύ υψηλότερα από εκείνα που έχουν περιγραφεί για τους RIPA θετικούς MuSK-MG ασθενείς. Η φαρμακευτική αγωγή που λαμβάνουν οι μυασθενείς εξαρτάται από το είδος των αντισωμάτων που φέρουν. Επιπρόσθετα, η πορεία της MG φαίνεται να σχετίζεται σε πολλές περιπτώσεις με την συγκέντρωση των αντισωμάτων αυτών. Συνεπώς η ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων όπως αυτών που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή μπορεί να οδηγήσουν σε καλύτερη και γρηγορότερη αντιμετώπιση της νόσου, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής των MG ασθενών. / Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease characterized by the presence of antibodies against the muscle components of the neuromuscular junction. The main antigen targets are the AChR, MuSK and LRP4. Antibodies against these three antigens are detected in 80-85%, 5-7% and ~2-3% of the MG patients, respectively. Despite the extensive research that has been done in the field of MG, there is a significant number of patients that do not have any detectable antibodies against the known antigens. These patients are known as seronegative MG patients (SN-MG). SN-MG presents a serious gap in the understanding of the etiology and pathogenic mechanisms of the disease. This is likely due to the presence of unknown antigens and / or the lack of sensitivity of the commercially available diagnostic assays, unable to detect antibodies at low concentrations. The aim of this thesis was to develop very sensitive diagnostic assays for the detection of anti-LRP4 and anti-MuSK antibodies among the previously SN-MG patients, for the minimization of SN-MG. The detection of anti-LRP4 antibodies is currently undertaken only by the sensitive but qualitative CBA technique. The development of a quantitative technique (RIPA, ELISA) for the quantification of these antibodies is essential for disease monitoring. Regarding the detection of anti-MuSK antibodies, the development of a more sensitive technique, from those used until now (RIPA), is necessary. Α diagnostic assay in which MuSK will be in native form (as in CBA), will give us the opportunity to detect not only low concentration anti-MuSK antibodies but also antibodies which require the native structured protein. The development of a quantitative and sensitive diagnostic method detecting anti-LRP4 antibodies requires the expression, isolation and purification of an intact antigen (LRP4 in our case). Human LRP4 is a large protein (212 kDa) with many post-transcriptional modifications. Because of the complexity of LRP4, the over-expression of this protein in heterologous expression systems is particularly difficult. For this reason, in addition to the intact LRP4, constructs of the whole extracellular domain (ECD) as well as of functional domains of LRP4-ECD were designed to be expressed in different expression systems. In order to improve the quantity and quality of the expressed recombinant proteins we used various expression systems the selection of which was based on the post-transcription mechanisms available as well as the ability to express large amount of recombinant proteins. More specifically, for the expression of the high complexity intact LRP4 (1905aa) and LRP4-ECD (21-1725aa) proteins, the eukaryotic baculovirus expression system and HEK293 mammalian cells were used, respectively. These expression systems are capable of expressing functional and properly structured proteins but usually in poor yields. On the other hand, for the expression of the smaller and less complex functional domains of LRP4-ECD, the P. pastoris and E. Coli expression systems were used. The latter are able to express large amounts of target proteins but lacking the complicated post-transcription mechanisms. Only few of the designed constructs were expressed at an acceptable level of yield in order to be used for the development of a diagnostic assay. More specifically, efforts were made to develop an indirect ELISA using the LRP4-ECD as an immobilized antigen. Using this technique was achieved the identification of only 14% of the anti-LRP4 positive MG sera (identified by CBA). In addition, the expressed in E. Coli domains of LRP4 (785-1093aa, 1093-1439aa, 1004-1306aa) used for the development of another indirect ELISA, identified the ~10% of LRP4-MG. However, using the expressed in P. pastoris LRP4 domain (21-737aa), a RIPA technique was developed identifying the 41.2% of LRP4-CBA positive MG sera. From the developed assays, RIPA seems to be the most sensitive one. Nevertheless efforts focused on the sensitivity improvements of the developed quantitative assays continue, aiming the quantification of the anti-LRP4 antibodies in LRP4-MG sera. In the second part of this thesis we applied a CBA for the detection of MuSK antibodies undetectable by RIPA. We tested 633 triple-SN-MG patients' sera from 13 countries, and detected 13% of these sera as MuSK-positive. MuSK antibodies were found, at significantly lower frequencies, in 1.9% of healthy controls and 5.1% of patients with other neuroimmune diseases. Interestingly, we also detected a significant number of double positives (AChR/MuSK-MG, LRP4/MuSK-MG), suggesting their overall rate is more frequent than previously described. Moreover, the clinical data of the newly diagnosed MuSK-MG patients were collected and evaluated. Importantly, we found that 27% of SN-MG patients with ocular MG (i.e. MG with only ocular symptoms present) were MuSK antibody positive, whereas 23% of the newly identified MuSK-MG patients had thymic hyperplasia suggesting thymic abnormalities; these percentages are much higher than those described earlier for classical MuSK-MG. The treatment of MG depends on the type of the circulating autoantibodies. Moreover, the course of the disease is associated with the antibody titer. Therefore, the development of diagnostic tools like these mentioned above can lead to a faster and better disease treatment, improving the quality of MG patients’ life.

Ο μυϊκός νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης (nAChR), είναι ένα πενταμερές κανάλι ιόντων νατρίου, το οποίο εδράζεται στους σκελετικούς μύες στη νευρομυϊκή σύναψη και μετατρέπει τις νευρικές ώσεις σε μυϊκές συσπάσεις. Το κανάλι αυτό γίνεται στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος, που παράγει στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας αντισώματα εναντίον του. Η συχνότητα της ασθένειας αυτής στο γενικό πληθυσμό είναι 125-400 περιπτώσεις/εκατομμύριο, με αναλογία ανδρών/γυναικών ασθενών 1:2. Τα πρώτα συμπτώματα της νόσου είναι διπλωπία και βλεφαρόπτωση που εξελίσσονται σε γενική μυϊκή αδυναμία και εύκολη κόπωση έως παράλυση των άκρων ή ακόμα και των αναπνευστικών μυών. Οι καθιερωμένες σήμερα θεραπείες της βαριάς μυασθένειας περιλαμβάνουν χορήγηση αντιχολινεστερασικών, ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, θυμεκτομή, πλασμαφαίρεση, καθώς και ενδοφλέβια χορήγηση ανθρωπίνων ανοσοσφαιρινών σε μεγάλες δόσεις. Όμως κοινός παρονομαστής όλων αυτών των θεραπειών είναι η έλλειψη εκλεκτικότητας καθώς και οι παρενέργειες. Τα παραπάνω προβλήματα έχουν κάνει φανερή την ανάγκη για εξεύρεση νέων και πιο εξειδικευμένων θεραπειών, όπως θεραπείες στις οποίες τα παθολογικά αυτοαντισώματα θα αφαιρούνται εκλεκτικά από την κυκλοφορία. Η μελέτη που έγινε στοχεύει στην εκλεκτική αφαίρεση των παθολογικών αντισωμάτων από το αίμα μυασθενών, με μυϊκούς nAChRs ή τμήματα αυτών, που είτε θα χορηγούνται ενδοφλεβίως, είτε θα βρίσκονται ομοιοπολικά προσδεμένα σε στήλες χρωματογραφίας από όπου θα περνά ο ορός. Στο πρώτο μέρος της μελέτης δημιουργήθηκαν παρασκευάσματα που περιείχαν το μυϊκού τύπου nAChR από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica (Τ. nAChR). Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε Τ. nAChR ο οποίος ήταν διαλυμένος σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), σε PBS/Χολικό νάτριο 2% (PBS/Χ.Ν.2%) καθώς επίσης και ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG), με στόχο την παράταση του χρόνου ημιζωής στον οργανισμό και τη μείωση της αντιγονικότητας. Τα παρασκευάσματα συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητά τους να δεσμεύουν το μονοκλωνικό αντίσωμα mAb35 (ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που προσδένεται σε μυϊκούς nAChRs) καθώς και I125-α-μπουγκαροτοξίνη (I125-α-Bgt) (πρωτεΐνη-συστατικό του δηλητηρίου του φιδιού Bungarus multicinctus και ανταγωνιστής ακετυλοχολίνης, ραδιοσημασμένη με I125), σε διάφορα χρονικά διαστήματα από την παρασκευή τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τη μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης έχει το παρασκεύασμα στο οποίο ο Τ. nAChR είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν τα ποσοστά του mAb35, τα οποία δεσμεύτηκαν in vivo σε αρουραίους από τα ίδια παρασκευάσματα με Τ. nAChR. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι μόνο ο Τ. nAChR που ήταν διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2% μπόρεσε να δεσμεύσει ποσοτικά το mAb35. Τέλος έγιναν πειράματα βιοκατανομών, του Τ. nAChR ραδιοσημασμένου με I125-α-Bgt, στα παραπάνω παρασκευάσματα, σε αρουραίους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μέγιστο χρόνο ζωής in vivo έχει ο ενσωματωμένος υποδοχέας σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν εξωκυτταρικά τμήματα του ανθρωπίνου μυϊκού nAChR (ECDs), εκφρασμένα στο ζυμομύκητα Pichia pastoris και σε κύτταρα εντόμων High Five (από τις ωοθήκες του εντόμου Trichoplusia ni). Τα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητα να δεσμεύουν αντισώματα από ορούς μυασθενών χρησιμοποιώντας τη ραδιοανοσολογική μέθοδο. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με ορούς 5 ασθενών, έδειξαν ότι το High Five α1 ECD δεσμεύει υπερδιπλάσια ποσοστά αυτοαντισωμάτων σε σχέση με το Pichia pastoris α1 ECD. Από τα πειράματα αυτά φαίνεται πως το High Five α1 ECD πλεονεκτεί του Pichia pastoris α1 ECD ποιοτικά. Συνολικά από τη μελέτη που έγινε, προέκυψε μια σειρά από συμπεράσματα. Κατ’ αρχήν αποδείχθηκε ότι nAChRs, όπως ο Τ. nAChR, μπορούν να ενσωματωθούν σε πολλά διαφορετικά παρασκευάσματα όπως σε PBS, PBS/Χ.Ν.2% και λιποσώματα, τα οποία επηρεάζουν τις ιδιότητές τους, όπως την ικανότητα δέσμευσης mAb35 και I125-α-Bgt και το χρόνο ημιζωής στον οργανισμό. Όπως αποδείχθηκε ο Τ. nAChR μπορεί να δεσμεύει mAb35 σε οποιαδήποτε από τα παραπάνω παρασκευάσματα in vitro, ενώ in vivo μπορεί να το δεσμεύει όταν είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης φάνηκε ότι μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής in vivo έχει ο Τ. nAChR ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Τέλος αποδείχθηκε ότι ανασυνδυασμένα ECDs της ανθρώπινης α1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR, δεσμεύουν αυτοαντισώματα από τον ορό μυασθενών και ότι η ικανότητα δέσμευσης των τμημάτων αυτών, επηρεάζεται από το σύστημα στο οποίο εκφράζονται. Η πληροφορία αυτή πρέπει να ληφθεί υπόψη στη κατασκευή ανοσοπροσροφητικών στηλών για τη θεραπεία της βαριάς μυασθένειας. / The muscle nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is a pentameric cation channel, which is located at the neuromuscular synapse and converts neuronal impulses into muscle contractions. In myasthenia gravis patients, this particular channel is targeted by the immune system, which produces antibodies against it. The incidence of the disease is about 125-400 cases per million. The first symptoms of the disease are diplopia and blepharoptosis, which may shift to general weakness and fatigability. The established therapies for myasthenia gravis, include administration of acetylcholinesterase inhibitors, immunosuppresive drugs, thymectomy, plasmaphaeresis and administration of intravenous immunoglobulins (IVIGs). Unfortunately all these therapies are not specific and have many serious side effects. This has made clear the need for more specific therapies, in which pathological autoantibodies will not be produced or will be removed selectively. This project aims at the specific aphaeresis of pathological autoantibodies from the patients’ blood by using the muscle nAChR or extracellular domains (ECDs) of its subunits. These molecules will either be administered i.v. or will be covalently conjugated on chromatography beads, forming a column by which the serum could pass and be cleaned from autoantibodies. In the first part of this project, formulations of nAChR, from the electric organs of fish Torpedo californica (T. nAChR), were prepared. Particularly T. nAChR was diluted in PBS and PBS/Sodium Cholate 2% (PBS/S.Ch.2%) and incorporated into liposomes coated by polyethylenoglycol (PEG) chains in different percentages, in order to achieve longer half-life in vivo. Their ability to bind mAb35 (a monoclonal antibody that binds muscle nAChRs) and I125-α- bungarotoxin (I125-labeled toxin from the poison of the snake Bungarus multicinctus, a well studied nAChR antagonist) were compared. The results showed that T. nAChR has the best binding capacity in vitro in the PBS/S.Ch.2%. Apart from the in vitro mAb35 binding measurements, in vivo binding experiments were also performed, using Lewis rats. Results indicate that only T. nAChR in the PBS/S.Ch.2% formulation binds mAb35 quantitatively in vivo. Finally, the biodistribution of T. nAChR in several formulations was also studied in rats. T. nAChR formulations were radiolabelled using I125-α-bungarotoxin and administered i.v. The results indicate that T. nAChR has the longest half-life time when incorporated into PEG-coated liposomes. In the second part of this project, ECDs of human muscle nAChR α1 subunit, expressed in the yeast Pichia pastoris and High Five insect cells were used. Pichia pastoris and High Five α1 ECDs were measured and compared for their ability to bind autoantibodies from myasthenic patients’ sera using radioimmunoassay. The results from 5 patients’ sera indicate that High Five α1 ECD binds more than twice more autoantibodies than Pichia pastoris α1 ECD. In conclusion, it was proved that nAChRs can be incorporated to many different formulations, like PBS, PBS/S.Ch.2% and liposomes, which affect its binding capacity and half-life time. It was shown that Τ. nAChR, when incorporated into any of the above formulations, can bind mAb35 in vitro, while in vivo only in PBS/S.Ch.2% formulation. In addition, it was proved that Τ. nAChR has longer half-life time in vivo when incorporated in PEG-coated liposomes. In the last part of the project, it was shown that ECDs of human nAChR α1 subunit binds autoantibodies from myasthenia gravis patient’s serum and their binding capacity is strongly affected by the expression system.

Würzburg, Univ., Diss., 2001. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2001

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs), μέλη της υπερ-οικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων ιοντικών καναλιών (LGICs), είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά, διακρίνονται σε μυϊκού και νευρικού τύπου υποδοχείς. Οι μυϊκού τύπου nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα των ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις των σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μύες. Αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες που σχηματίζουν ένα κανάλι, με στοιχειομετρία (α1)2βγδ στα έμβρυα ή (α1)2βεδ στους ενήλικες. Κάθε υπομονάδα αποτελείται από: (α) ένα αμινο-τελικό εξωκυτταρικό τμήμα (ECD) μήκους ~210–220 αμινοξέων (β) τέσσερις μικρές (15–20 αμινοξέα μήκος η καθεμιά) υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές (M1–M4) και δύο μικρές υδρόφοβες θηλιές, μεταξύ των M1–M2 και M2–M3 (γ) μια υδρόφιλη κυταρροπλασματική θηλιά που ποικίλει σε μέγεθος (100–150 κατάλοιπα) και αμινοξική σύσταση μεταξύ των υπομονάδων, ανάμεσα στην Μ3 και Μ4 περιοχή, και (δ) ένα μικρό (4–28 αμινοξέα) υδρόφιλο καρβοξυ-τελικό άκρο εξωκυτταρικά. Οι μυϊκού τύπου nAChRs εκτός από την φυσιολογική τους δράση εμπλέκονται και στην αυτοάνοση νόσο μυασθένεια (myasthenia gravis-MG). Τα αυτοαντισώματα των μυασθενικών προσδένονται στην εξωκυτταρική περιοχή του AChR και η πλειοψηφία τους φαίνεται να στοχεύει την α1 υπομονάδα και συγκεκριμένα την κύρια ανοσογόνο περιοχή της-MIR. Επιπλέον, στην εξωκυτταρική περιοχή της α1 υπομονάδας εντοπίζεται και η περιοχή που συμμετέχει στον σχηματισμό της θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και άλλων χολινεργικών προσδετών. Το α1 ECD του ανθρώπινου nAChRs έχει ήδη εκφραστεί, απομονωθεί και χαρακτηριστεί από υπερκείμενο καλλιέργειας του ζυμομύκητα Pichia pastoris ως μονομερές, υδατοδιαλυτό και λειτουργικό πρωτεϊνικό μόριο. Η ικανότητά του να προσδένει αντι-AChR αυτοαντισώματα βρέθηκε μέτρια, και για τον λόγο αυτό στην παρούσα εργασία εκφράστηκε σε ένα ανώτερο εξελικτικά σύστημα από αυτό του Pichia pastoris, με σκοπό την έκφραση μορίων με καλύτερη αναδίπλωση, που να προσομοιάζουν περισσότερο με την φυσική τους διαμόρφωση, καθώς επίσης και την παραγωγή ικανοποιητικής ποσότητας πρωτεΐνης, ώστε να είναι εφικτή η δομική της μελέτη. Ως ετερόλογο σύστημα έκφρασης, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα εντόμων του είδους Trichoplusia ni (High Five), τα οποία ήταν σταθερά μετασχηματισμένα ως προς το ανασυνδιασμένο α1 ECD πολυπεπτίδιο. Αναλυτικότερα, το ECD της α1 υπομονάδας εκφράστηκε στα δύο συστήματα και στην συνέχεια καθαρίστηκε και απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας και μοριακής διήθησης. Το High Five α1 ECD εκφράστηκε ως υδατοδιαλυτό μόριο σε ικανοποιητική ποσότητα ενώ η χρωματογραφία μοριακής διήθησης και οι μελέτες δυναμικής σκέδασης του φωτός έδειξαν επιπλέον πως εκφράζεται ως μονομερές. Ορισμένοι χολινεργικοί προσδέτες προσδένονται στο High Five α1 ECD, επιβεβαιώνοντας πως η διαμόρφωσή του προσομοιάζει με του ανθρώπινου nAChR. Με πειράματα ELISA και ραδιοανοσολογικού προσδιορισμού, προέκυψε πως το High Five α1 ECD δεσμεύει μεγαλύτερο ποσοστό αντι-nAChR μονοκλωνικών αντισωμάτων και αυτοαντισωμάτων από τον ορό μυασθενικών, συγκριτικά με το Pichia pastoris α1 ECD. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής, το ανασυνδυασμένο α1 ECD του ανθρώπινου nAChR, εκφρασμένο σε κύτταρα εντόμων High Five, προσομοιάζει περισσότερο με την φυσική διαμόρφωση του nAChR. Επιπλέον, το ετερόλογο σύστημα έκφρασης των High Five κυττάρων είναι αποδοτικά καλύτερο σε σύγκριση με αυτό του ζυμομύκητα Pichia pastoris. Αυτό, καθιστά το High Five α1 ECD καταλληλότερο για δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, που θα βοηθήσουν στην επίλυση της τρισδιάστατης δομής του υποδοχέα, αλλά και για την ανάπτυξη μιας ειδικής αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), members of the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGICs), are transmembrane glycoproteins (Mr ~290 kDa). According to their topology and their pharmacological properties, nAChRs are divided into muscle-type and neuronal-type nAChRs. The muscle-type AChRs are located in fish electric organs as well as in the neuromuscular junction, where they transmit electrical signals from the nervous system to the vertebrate skeletal muscles. They consist of five homologous subunits forming a channel with stoichiometry (α1)2βγδ in embryos or (α1)2βεδ in adults. A nAChR subunit consists of: (a) a N-terminal extracellular domain (ECD) which is ~210–220 amino acids long; (b) four short (15–20 amino acids long) hydrophobic transmembrane segments (M1–M4) and two small hydrophilic loops, linking segments M1–M2 and M2–M3; (c) a hydrophilic cytoplasmic loop varying in size (100–150 residues) and sequence among different type of subunits, which located between M3 and M4 segment, and (d) a C-terminal short (4–28 amino acids) hydrophilic extracellular segment end. Muscle type nAChRs are also involved in the autoimmune disease myasthenia gravis (MG). Αutoantibodies in MG bind to the extracellular domain of the AChR and their majority target the α1 subunit and more specific the major immunogenic region (MIR). Moreover, the ECD of the α1 subunit bears the binding sites for acetylcholine and other cholinergic ligands. The human nAChR α1 subunit ECD has been expressed, isolated and characterized in the yeast Pichia pastoris as a monomer, water-soluble and functional molecule, with a medium ability to bind antibodies against AChR. In this project, the human nAChR α1 subunit ECD was expressed in an evolutionary higher protein expression system compared to Pichia pastoris system, in order to express molecules with better conformation, close to that of the native protein and to produce considerable amounts of protein for structural studies. In more details, we have used insect cells from the species Trichoplusia ni (High Five), which were stably transformed with the α1 ECD polypeptide. The α1 ECD of the human muscle nAChR, was expressed in both systems and was isolated and purified by affinity chromatography and fast protein liquid chromatography analysis (FPLC). The recombinant High Five α1 ECD was expressed as a water-soluble molecule in sufficient quantities. FPLC and dynamic light scattering analysis determined it to be monomer. Several cholinergic ligands were found to bind to High Five α1 human ECD confirming the native-like conformation of the protein. High Five α1 ECD was subsequently found to bind better conformation-dependent anti-nAChR mAbs than the Pichia pastoris α1 human ECD, as determined by ELISA and radioimmunoassay analysis. The binding of High Five α1 human ECD to anti-nAChR autoantibodies from MG patients, was also found to be better than the Pastoris pastoris α1 human ECD. These results indicate that the recombinant α1 human ECD, expressed in High Five cells, has a more native-like conformation than Pichia pastoris α1 ECD, being suitable for high resolution structural studies, in order to reveal the structure of the human nAChR and for the development of an antigen specific therapy for MG.

Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης είναι ο σημαντικότερος στόχος στην αυτοάνοση νόσο βαριά μυασθένεια. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (85%) ανιχνεύονται αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε διαταραχή της μεταγωγής του κινητικού ερεθίσματος. Σε αυτή την μελέτη στόχος είναι η κατασκευή και έκφραση των εξωκυτταρικών περιοχών των υπομονάδων α και β του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε κύτταρα εντόμων μετά από επιμόλυνση με βακιλοϊό. Στα ίδια πλαίσια πραγματοποιήθηκε η σύνδεση των υπομονάδων α και β με πεπτιδικό συνδέτη για την δημιουργία του συγκαταμερούς β-α. Τα ανασυνδυασμένα αυτά πεπτίδια απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν σε διαλυτή μορφή. Σε επόμενο στάδιο έγινε η ακινητοποίηση τους σε υπόστρωμα σεφαρόζης και ο έλεγχος της ικανότητας πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορό μυασθενών με απώτερο στόχο τηv χρήση τους ως πιθανοί ανοσοπροσροφητές σε μια καινούρια θεραπευτική προσέγγιση για την μυασθένεια. / Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease caused in the majority of patients (85%) by autoantibodies against the human muscle acetylcholine receptor (AChR),a post-synaptic ligand-gated ion-channel located at the neuromuscular junction.Autoantibodies against the AChR cause loss of the available and functional AChRs leading to muscle weakness and fatigability.An attractive therapeutic approach is the extracorporeal specific removal of the pathogenic autoantibodies using AChR-based immunoadsorbents. In this study, the N-terminal extracellular domains (ECD) of AChR the subunits α1 and β1 were cloned into baculovirus expression vectors and heterologously expressed using insect SF9 cells.Additionally, the two subunits were linked by the use of a flexible peptide linker to form the β1-α1 concatamer.The recombinant proteins were expressed as soluble polypeptides, purified and characterized.Furthermore, they were immobilised on sepharose beads in order to test them as immunoadsorbents using sera from MG patients. They were all found to bind anti-AChR autoantibodies, albeit to varying degrees. They, thus, pose as potential candidates for the therapeutic antigen-specific clearance of MG sera.

Submitted by Tarcisio Albertin Dos Reis (ta.reis@unesp.br) on 2018-08-06T20:30:51Z No. of bitstreams: 1 Mestrado ultima versão.pdf: 801214 bytes, checksum: edb9c814c46ecb1d03d1e2a67318e15a (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-08-08T16:30:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 reis_dc_me_bot.pdf: 801214 bytes, checksum: edb9c814c46ecb1d03d1e2a67318e15a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T16:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 reis_dc_me_bot.pdf: 801214 bytes, checksum: edb9c814c46ecb1d03d1e2a67318e15a (MD5) Previous issue date: 2018-07-16 / Objetivo: avaliar, por meio de uma revisão sistemática, a efetividade da plasmaférese no pré-operatório de timectomia em pacientes com miastenia gravis (MG). Métodos: Foram pesquisadas as bases Medline, Embase, Lilacs, Scopus e Central para busca de estudos experimentais e observacionais que avaliaram a plasmaférese no pré-operatório de timectomia em pacientes com MG. Grupo com plasmaférese (PPG) e grupo sem plasmaférese (NPPG). Os desfechos avaliados foram: crise miastênica, mortalidade, pneumonia, sangramento, uso de ventilação mecânica, tempo de permanência hospitalar e em unidade de terapia intensiva (UTI). Utilizou-se para metanálise o software RevMan 5.3 fornecido pela Colaboração Cochrane. Resultados: O número total de pacientes avaliados em seis estudos selecionados foi de 323 (143 PPG e 180 NPPG). A plasmaférese pré-operatória não diminuiu a crise miastênica (RR 0,36, IC 95% 0,08 a 1,66; I2 = 44%; 5 estudos, 243 pacientes). Também não houve alteração na mortalidade (RR 0,7, IC 95% 0,11 a 4,62; I² = 0%; 3 estudos, 172 pacientes) ou taxa de pneumonia (RR 0,28, IC 95% 0,07 a 1,09; I2 = 27%; 5 estudos, 272 pacientes). Os pacientes do grupo NPPG sangraram menos em comparação com o grupo PPG (diferença média 34,34 ml, IC 95% 24,93 a 43,75; I² = 0%). Foi avaliada a necessidade de ventilação mecânica em três estudos (213 pacientes) e a permanência hospitalar e em UTI em dois (121 pacientes), que não foram adequados para realizar a metanálise devido à alta heterogeneidade nesses desfechos. A análise dos subgrupos mostrou que a realização da plasmaférese no pré-operatório de pacientes com doença grave (Osserman III e IV) diminuiu a crise miastênica no pós-operatório (RR 0,12, IC 95% 0,02 a 0,65; I² = 63%). Conclusão: A plasmaférese pode reduzir as crises miastênicas pós-operatória em pacientes com doença grave (Osserman III e IV), mas pode produzir pouca ou nenhuma diferença em pacientes com doença de expressão clínica leve (Osserman II). / Objective: to evaluate, through a systematic review, the efficacy of plasmapheresis in the preoperative thymectomy in patients with myasthenia gravis (MG). Methods: Medline, Embase, Lilacs, Scopus and Central databases were searched for experimental and observational studies that evaluated plasmapheresis in the preoperative period of thymectomy in MG patients. Plasmapheresis group (PPG) and without plasmapheresis group (NPPG). The outcomes evaluated were: myasthenic crisis, mortality, pneumonia, bleeding, use of mechanical ventilation, length of hospital stay and intensive care unit (ICU) stay. The RevMan 5.3 software provided by the Cochrane Collaboration was used for meta-analysis. Results: The total number of patients evaluated in six included studies was 323 (143 PPG and 180 NPPG). Preoperative plasmapheresis did not decrease the myasthenic crisis (RR 0.36, 95% CI 0.08 to 1.66, I2 = 44 %; 5 studies, 243 patients). There was also no change in mortality (RR 0.7, 95% CI 0.11 to 4.62, I² = 0%; 3 studies, 172 patients) or pneumonia (RR 0.28, 95% CI 07 to 1.09, I2 = 27%; 5 studies 272 patients). Patients in the NPPG group bleed less in comparison to the PPG group (mean difference 34.34 ml, 95% CI 24.93 to 43.75, I² = 0%). We evaluated the need for mechanical ventilation in three studies (213 patients) and hospital and ICU stay evaluated in two studies (121 patients), but they were not adequate to perform the meta-analysis due to the high heterogeneity among these outcomes. Subgroup analysis showed that the preoperative plasmapheresis performed in patients with severe disease (Osserman III and IV) decreased the myasthenic crisis postoperatively (RR 0.12, 95% CI 0.02 to 0.65, I² = 63 %). Conclusion: Plasmapheresis may reduce postoperative myasthenic crisis in patients with severe disease (Osserman III and IV), but may produce little or no difference in patients with mild clinical expression disease (Osserman II).

No description available.

Autoimmunity is a failure to tolerate circulating or cell surface expressed self antigens,leading to activation of the immune system and attack of self tissues. Muscle-specific kinase (MuSK) myasthenia gravis (MG) is a disease caused by antibodies to MuSK and hallmarked by fatigable muscle weakness. MuSK is a tyrosine kinase that interacts with low-density lipoprotein receptor-related protein 4 (LRP4), resulting in maintenance of the high density of acetylcholine receptors (AChRs) at the neuromuscular junction; this high density is essential for efficient transmission of signals from nerve to muscle, and MuSK antibodies impair this transmission. MuSK antibodies are predominantly IgG4, a subclass that does not induce immunological damage. Thus how these antibodies cause neuromuscular junction dysfunction is not clear. Potential mechanisms of the MuSK antibodies were explored in in vitro experiments. Plasmas from fourteen MuSK-MG patients were studied. IgG antibodies and IgG subclass profiles were measured with flow cytometry. Total IgG, Fabs, IgG4 and IgG1-3 subclass antibodies were prepared and purified; these were used to investigate the effects on MuSK surface expression, binding of LRP4 to MuSK, and agrin-LRP4-MuSK-induced AChR clustering in C2C12 mouse myotubes. No evidence for MuSK endocytosis by MuSK IgG, IgG1-3 or IgG4 antibodies was found. The predominant IgG4 subclass, and the monovalent IgG Fabs, blocked binding between LRP4 and MuSK but both IgG4 and IgG1-3 subclass antibodies were equally able to disperse pre-formed and newly-induced AChR clusters in C2C12 myotubes. The block of LRP4-MuSK interaction by IgG4 antibodies is likely to be a major pathogenic mechanism in MuSK-MG, which may lead to disrupted signal transduction, reduced AChR aggregation and neuromuscular transmission failure at the neuromuscular junction. In addition, MuSK IgG1-3, until now described as nonpathogenic, may also contribute to the reduced AChR density and neuromuscular dysfunction in MuSK-MG. These results provide new evidence concerning the pathogenic antibodies and their mechanisms in MuSK-MG.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.