O aumento na prevalência da tuberculose (TB), a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e o efeito devastador da coinfecção pelo HIV têm enfatizado a urgente necessidade no desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. A análise completa da seqüência genômica do M. tuberculosis H37Rv mostrou a existência de genes envolvidos na via de biossíntese de aminoácidos aromáticos, a via do chiquimato, e evidências experimentais indicam que esta via é essencial para o M. tuberculosis e apresenta-se ausente no homem. Os produtos dos genes que são essenciais para o crescimento dos microrganismos fazem deles alvos atrativos para a ação de drogas, pois a inibição de sua função pode matar o bacilo. Previamente, nosso grupo relatou a clonagem do gene aroE de M. tuberculosis e a expressão do seu produto na forma solúvel, a enzima chiquimato desidrogenase (MtbSD), que catalisa o quarto passo na via do chiquimato. Neste trabalho apresentamos, no primeiro artigo, intitulado “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, a purificação da MtbSD solúvel e ativa por cromatografia líquida, o seqüenciamento do Nterminal, a espectrometria de massas, a determinação do estado oligomérico por cromatografia em gel filtração, a estabilidade térmica, a determinação de parâmetros cinéticos aparentes em estado estacionário para as reações direta e reversa, a constante de equilíbrio aparente e energia de ativação para a reação química catalisada pela MtbSD. No segundo artigo, intitulado “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, descrevemos os parâmetros de velocidade inicial na reação direta, os estudos de inibição pelos produtos, os efeitos isotópicos cinéticos primários do deutério, os efeitos isotópicos cinéticos do solvente, os efeitos isotópicos cinéticos múltiplos, proton inventory, o efeito de pH na química ácido/base para a ligação e catálise dos substratos, e a estrutura 3D da MtbSD obtida in silicon pela modelagem por homologia. Esses resultados servem como base para os estudos cinéticos e estruturais que podem auxiliar no desenho racional de inibidores a serem testados como agentes antimicobacterianos. / The increasing prevalence of tuberculosis (TB), the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and the devastating effect of coinfection with HIV have highlighted the urgent need for the development of new antimycobacterial agents. Analysis of the complete genome sequence of M. tuberculosis H37Rv shows the presence of genes involved in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, the shikimate pathway, and experimental evidence showed that this pathway is essential for M. tuberculosis and it is absent in humans. The gene products that are essential for the growth of the microorganisms make them attractive drug targets since inhibiting their function may kill the bacilli. Our group has previously reported the cloning of M. tuberculosis aroE gene and the expression of the product in the soluble form, the shikimate dehydrogenase (MtbSD) enzyme, that catalysis the fourth reaction in the shikimate pathway. Currently, in the first manuscript “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, we present the purification of soluble and active MtbSD, N-terminal sequencing, mass spectrometry, assessment of the oligomeric state by gel filtration chromatography, thermal stability, determination of apparent steady-state kinetic parameters for both forward and reverse directions, apparent equilibrium constant, and energy of activation for the enzyme-catalyzed chemical reaction. In the second manuscript “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, we describe the kinetic mechanism, initial velocity patterns in the forward direction, product inhibition studies, primary deuterium kinetic isotope effects, solvent kinetic isotope effects, multiple isotope effects, proton inventory, pH rate profile and the MtbSD 3D structure obtained in silicon by homology modeling. These results should be useful as a solid base for structural and kinetic studies, which can aid in the rational design of inhibitors to be tested as antimycobacterial agents.

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

A tuberculose (TB) é uma séria doença infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis, e constitui um importante problema de saúde pública em todo o mundo. Novas drogas e vacinas de segunda geração são urgentemente necessárias para o controle da TB, mas a complexa biologia de M. tuberculosis tem dificultado o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. A manipulação genética de M. tuberculosis também é complicada, mas, atualmente, técnicas novas e mais eficientes de troca alélica permitem o estudo detalhado de diversos genes micobacterianos. No presente trabalho, os genes da corismato mutase (CM) e fosforilase de nucleosídeos purínicos (PNP) de M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis foram estudados. A CM catalisa a conversão de corismato em prefenato na rota de biossíntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina e tirosina em bactérias, fungos e plantas. Dois genes de CMs monofuncionais (aroQ e *aroQ) foram identificados, clonados, expressos e bioquimicamente caracterizados em ambas as espécies de micobactérias. Esses genes também foram investigados usando uma metodologia de recombinação homóloga e ensaios de atividade promotora. Os resultados indicam que os genes aroQ são provavelmente essenciais ao crescimento in vitro de M. tuberculosis e M. smegmatis, enquanto uma linhagem mutante para o gene *aroQ de M. smegmatis pôde ser obtida. A PNP catalisa a interconversão e reciclagem de bases, nucleosídeos e nucleotídeos purínicos na via de salvamento das purinas. A construção de mutantes para o gene deoD (que codifica a PNP) de M. tuberculosis e M. smegmatis, usando um método eficiente de troca alélica em duas etapas, não foi possível. Assim, sugere-se que, nas condições testadas, o gene deoD seja essencial ao crescimento in vitro dessas micobactérias. A identificação de genes essenciais é de fundamental importância, pois indica tanto a relevância biológica dos mesmos como, no caso de M. tuberculosis, que seus produtos constituem alvos moleculares interessantes para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. / Tuberculosis (TB), a serious infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, still remains a public health problem in the world. New drugs and second generation vaccines are urgently required to control TB, but the complex biology of M. tuberculosis has hindered the development of novel therapeutic tools. Genetic manipulation of M. tuberculosis is also difficult, but currently new, more efficient gene replacement techniques have allowed detailed studies of many mycobacterial genes. In the present work, the chorismate mutase (CM) and purine nucleoside phosphorylase (PNP) genes from M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis were studied. CM catalyzes the rearrangement of chorismate to prephenate in the biosynthetic pathway that forms phenylalanine and tyrosine in bacteria, fungi, and plants. Two monofunctional CM genes (aroQ and *aroQ) were identified, cloned, expressed, and biochemically characterized in both mycobacteria. Those genes were also investigated by homologous recombination methods and promoter activity assays. AroQ genes seem to be essential for the growth of M. tuberculosis and M. smegmatis, while an *aroQ mutant strain could be generated in M. smegmatis. PNP promotes the interconversion and recycling of purine bases, nucleosides, and nucleotides in the purine salvage pathway. Construction of deoD (which codes for PNP) deletion mutants of M. tuberculosis and M. smegmatis using an efficient two-step gene replacement technique was not possible. Thus, it is suggested that deoD is also essential for mycobacterial growth under the conditions tested. The identification of essential genes is of great importance, both because it indicates their biological significance, and because, with pathogens like M. tuberculosis, these may also indicate attractive molecular targets for the development of new antimycobacterial drugs.

aumento do número de casos de tuberculose e o surgimento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistentes a múltiplas drogas, entre elas a isoniazida (INH) representa um sério problema de saúde pública. A enzima InhA, ou 2-trans-Enoil-ACP (CoA) redutase de MTB, catalisa a redução NADHdependente de ácidos graxos α,β-insaturados, precursores dos ácidos micólicos (importantes componentes do envelope celular do MTB). Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas à resistência in vivo à INH devido a uma menor afinidade pela molécula de NADH, sugerindo que o mecanismo de resistência deva estar relacionado com interações específicas entre a enzima e o cofator. Para verificar os eventos moleculares associados à afinidade da enzima pelo ligante e identificar os aspectos moleculares relacionados com a resistência, foram realizados estudos de simulação por dinâmica molecular (DM) dos sistemas InhA-NADH (espécie selvagem wt e mutantes) completamente solvatados.Todos os sistemas enzimáticos apresentaram grande flexibilidade durante as trajetórias por DM. Apesar da flexibilidade, no complexo wt InhA-NADH, a molécula de NADH permanece firmemente ligada ao sítio da enzima numa conformação estendida. Nos complexos mutantes I21V e I16T, onde as mutações ocorrem na alça rica em glicina, as interações entre enzima e cofator são menos efetivas, permitindo que a porção pirofosfato do NADH experimente importantes mudanças conformacionais e se afaste de sua região de ligação, indicando, provavelmente, um estágio inicial da dissociação do ligante. No mutante I47T, a substituição da Ile por Thr causa uma contração no sítio de ligação do NADH, que é refletida no rearranjo conformacional do NADH e na expulsão de moléculas de água importantes para a associação do cofator O mutante S94A apresentacomportamento muito semelhante à enzima selvagem, como esperado a partir dos experimentos cristalográficos. As afinidades das enzimas pelo NADH foram avaliadas por experimentos de docking molecular, onde as estruturas instantâneas geradas durante as trajetórias da DM foram utilizadas como forma de considerar explicitamente a flexibilidade da macromolécula. Os resultados do docking molecular mostraram que todos os mutantes apresentam menor afinidade pelo NADH, exceto o mutante S94A, cuja energia livre de ligação do NADH foi estatisticamente igual à observada para a enzima selvagem. Os resultados apresentados neste trabalho devem contribuir para o entendimento do mecanismo molecular específico de resistência à INH, que é crucial para o desenvolvimento de novos fármacos para o controle da tuberculose. / The increasing prevalence of tuberculosis in many areas of the world, coupled with the rise in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MTB) strains presents a major threat to global health. InhA, the enoyl-ACP reductase from MTB, catalyzes the NADH-dependent reduction of long chain trans-2-enoyl-ACP fatty acids, an intermediate in mycolic acids biosynthesis. Mutations in the structural gene for InhA are associated with isoniazid resistance in vivo due to a reduced affinity for NADH, suggesting that the mechanism of drug resistance may be related to specific interactions between enzyme and cofactor within the NADH binding site. In order to compare the molecular events underlying this ligand affinity in the wild type and S94A, I21V, I16T and I47T clinical mutant enzymes, and to identify the molecular aspects related to resistance, molecular dynamics (MD) simulations of fully solvated NADH-InhA (wt and mutants) systems were performed.All InhA-NADH systems showed a large flexibility during the MD trajectories. Although very flexible, in the wt InhA-NADH complex, the NADH molecule keeps its extended conformation firmly bounded to the enzyme’s binding site. In the I21V and I16T mutant complexes, where mutated residues were located in the glycine rich loop, interactions between enzyme and cofactor became more labile, and the NADH pyrophosphate moiety undergoes to considerable conformational changes, becoming more hydrated and moving apart from its binding site, probably indicating the initial phase of ligand expulsion. In the I47T mutant, the substitution of an Ile residue for Thr causes a binding site contraction with conformational changes of the NADH molecule and expulsion of water molecules important for cofactor binding to the enzyme. The S94A mutant showed to be very similar to the wt enzyme, in agreement to crystallographic experiments observations. The enzyme-ligand affinities were evaluated by molecular docking experiments which were performed in the trajectory ensembles of MD snapshots asa way to explicit consider the macromolecular flexibility. All mutant enzymes had lower affinities for the NADH molecule, except the S94A mutant, whose free energy of NADH binding was statistically similar to that of the wild type enzyme. This results presented here should contribute to our understanding of specific molecular mechanisms of drug resistance, which is crucial for designing more potent antimycobacterial agents for controlling tuberculosis.

A enzima indol-3-glicerol fosfato sintase (IGPS) catalisa a formação irreversível do anel do composto 1-o-carboxifenilamino desoxiribulose-5-fosfato (CdRP), através de uma decarboxilação e de uma desidratação, liberando o composto indol-3-glicerol fosfato (IGP), o quinto passo na via de biossíntese do triptofano. Neste trabalho, é descrita a clonagem, expressão, purificação e caracterização cinética da IGPS, além da identificação de um intermediário reacional. Para a realização destes estudos, o substrato da enzima (CdRP) foi sintetizado quimicamente, purificado e caracterizado espectroscopicamente e espectrometricamente. A fluorescência do CdRP mostrou-se dependente de pH, possivelmente devido ao efeito de transferência intramolecular de prótons no estado excitado (ESIPT). Efeitos de temperatura foram analisados, indicando uma energia de ativação de 8.4 kcal mol-1 para a reação catalisada pela IGPS. Efeitos isotópicos de solvente mostraram que a transferência de próton é apenas modestamente limitante para a reação, e estudos de inventário de prótons demonstraram que apenas um próton é responsável pelo efeito isotópico de solvente observado. Perfis de pH foram realizados para avaliar a presença de catálise ácido-base, mostrando que um resíduo desprotonado de pKa aparente igual a 6.0 é necessário para a catálise e que um resíduo com pKa aparente igual a 6.8 é necessário para a ligação do CdRP. Sugerimos que ambos os pKa estejam reportando para um mesmo resíduo, que poderia ser um glutamato conservado em todas as IGPS caracterizadas até o presente. Um modelo é proposto para explicar o ESIPT, assim como uma seqüência cinética baseada nos perfis de pH. Para identificar possíveis intermediários reacionais, a técnica de ESI-MS foi empregada para estudar a reação catalisada pela IGPS, e um intermediário químico foi interceptado e caracterizado. / The enzyme indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS) catalyzes the irreversible ring closure of 1-o-carboxyphenylamino deoxyribulose-5-phosphate (CdRP), through a decarboxylation and a dehydration, releasing indole-3-glycerol phosphate (IGP), the fifth step in the biosynthesis of tryptophan. In the present work, we describe cloning, expression, purification, and kinetic characterization of IGPS. In order to perform kinetic studies, CdRP was chemically synthesized, purified, and espectroscopically and spectrometrically characterized. CdRP fluorescence was pH-dependent, probably owing to excited-state intramolecular proton transfer (ESIPT) effect. Temperature effects were analyzed, indicating an activation energy of 8.4 kcal mol-1 for the IGPS catalyzed reaction. Solvent isotope effects showed that a proton transfer is only modestly limiting for the reaction, and proton inventory studies pointed to a single proton responsible for the observed solvent isotope effect. pH-rate profiles were carried out to probe for acid/base catalysis, showing that a deprotonated residue with an apparent pKa of 6.0 is required for catalysis and a deprotonated residue with an apparent pKa of 6.8 is necessary for CdRP binding. It was suggested that both apparent pKa report on the same residue, which might be a glutamate conserved amongst all IGPS characterized so far. A model is proposed to explain the ESIPT, and a kinetic sequence is suggested based on the pH-rate profiles. ESIMS was employed to identify possible chemical intermediates of the IGPS catalyzed reaction, and one chemical intermediate was intercepted and characterized.

As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose. / The shikimate pathway is an attractive target for the development of antitubercular agents because it is essential in Mycobacterium tuberculosis but absent in humans. Mycobacterium tuberculosis aroE-encoded shikimate dehydrogenase (MtbSD) catalyzes the forth reaction in the shikimate pathway. Three-dimensional structure studies, pH-rate profiles and site-directed mutagenesis studies involving many shikimate dehydrogenases have suggested participation of Lysine-69 and Aspartate-105 (M. tuberculosis numbering) in catalysis and/or substrate binding. Importantly, investigation of the kinetic properties of mutant enzymes can bring important insights about the role of these residues for the MtbSD enzyme. Mutagenesis was performed using a PCR-amplification technique for the following mutant proteins: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Screening of experimental conditions has been performed to obtain the expression of the MtbSD mutant proteins in the soluble fraction. In addition, an improved purification protocol was used to obtain homogeneous wild-type MtbSD and K69A mutant enzymes. We have carried out steady-state kinetic assays and spectrofluorimetric measurements for the wild type and the K69A enzymes. Results indicate that the conserved Lysine-69 residue in MtbSD plays a catalytic role and is not involved in substrate binding. Enzyme kinetics, site-directed mutagenesis and structural studies provide a framework on which to base the rational design of new and effective agents to treat tuberculosis.

Para auxiliar no controle da tuberculose são necessários novos métodos de detecção de Mycobacterium tuberculosis que sejam rápidos, específicos e de aplicabilidade em laboratórios de saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento. Vários métodos moleculares de detecção e identificação de micobactérias em amostras clínicas têm sido desenvolvidos. Com o objetivo de padronizar e aplicar essas metodologias em laboratório foi desenvolvido um protocolo baseado na amplificação de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) e na detecção colorimétrica em microplacas. Uma região interna do elemento de inserção IS6110, específico do complexo M. tuberculosis, foi selecionada como alvo para amplificação por PCR com primers biotinilados. Uma sonda complementar a uma região interna do fragmento foi fixada em microplacas onde, posteriormente, foi hibridizado o produto amplificado. A detecção através de hibridização foi feita utilizando um conjugado estreptavidina peroxidase. A eficácia da técnica foi testada em amostras clínicas pulmonares de pacientes com suspeita de infecção e sem tratamento prévio para tuberculose. O padrão ouro no diagnóstico de infecção por M. tuberculosis foi a associação da baciloscopia com a cultura a partir da amostra clínica dos pacientes selecionados. Foram testadas 303 amostras de escarro induzido de 303 pacientes com suspeita de TB pulmonar, dos quais 69 apresentaram resultado positivo e 234 negativo para TB. A sensibilidade e especificidade obtidas foram 88% e 98% e os Valores Preditivos Positivo (VPP) e Negativo (VPN) foram 92% e 97%, respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que a técnica desenvolvida no presente estudo pode ser uma importante ferramenta no diagnóstico de tuberculose e poderia ser utilizada como um teste complementar no diagnóstico da doença. / New methods to detect Mycobacterium tuberculosis rapidly, accurately and that are feasible to apply in laboratories of developing countries are necessaries. Several methods for direct detection and identification of mycobacteria in clinical samples have been developed. With the aim to standardize the application of such methods in laboratory, we developed a molecular method for DNA extraction and PCR detection using a microwell plate hybridization assay. An internal region of the repetitive element, specific of M. tuberculosis complex, called IS6110 was selected as a target for amplification using specific biotinylated primers. The detection of amplified fragments was performed using microwell plates. An aminated DNA fragment complementary to an internal region of the amplified fragment was used as a probe. The biotinylated amplified products were added to the plate and identified with the use of streptavidin conjugated to horseradish peroxidase. The efficacy of the method was tested to detect pulmonary tuberculosis in patients suspected of TB infection with no previous treatment. As gold standard, the bacteriological criteria was used. Three hundred and three induced sputum samples from 303 pulmonary TB suspects were evaluated, of which 69 showed positive result and 224 negative for TB. The sensitivity and specificity obtained were 88% and 98% and Positive and Negative Predictive Values were 92% and 98%, respectively. The obtained results demonstrated that the PCR detection using a microwell plate hybridization assay may be an important tool for the diagnosis of tuberculosis and suggest that it could be used as a complementary diagnostic method.

Submitted by Barroso Patrícia (barroso.p2010@gmail.com) on 2013-04-04T20:10:18Z No. of bitstreams: 1 BATISTA, MC.pdf: 1852522 bytes, checksum: bed699e8555a1c9a88ac11e384126fe6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-04T20:10:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BATISTA, MC.pdf: 1852522 bytes, checksum: bed699e8555a1c9a88ac11e384126fe6 (MD5) Previous issue date: 2011 / A tuberculose continua sendo um grave problema social e de saúde pública. O diagnóstico da tuberculose, em seus estágios iniciais, e da tuberculose, infecção latente, pode contribuir para o controle da doença. Novos métodos, conhecidos como IGRA, detectam a infecção tuberculosa latente, medindo interferongama em resposta à liberação de antígenos presentes no complexo Mycobacterium tuberculosis, mas ausente na vacina BCG e em micobactérias saprófitas. Estudos vêm demonstrando uma possível superioridade na especificidade desses testes em relação ao teste tuberculínico (PPD). O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de citocinas de indivíduos com diagnóstico de Tuberculose infecção latente e os antígenos de Mycobacterium tuberculosis no QuantiFERON®-TB Gold Test In Tube- Cellestis Limited, Carnegie, Austrália (QFT-IT). Os níveis plasmáticos das citocinas interferon-gama (IFN-), foram avaliados com o método ELISA do kit QuantiFERON®-TB Gold Test In Tube, enquanto que os de fator de necrose tumoral (TNF), fator de transformação do crescimento beta (TGF-β) e interleucina-12/23 (IL-12/23) foram quantificados pelo método de ELISA (Duo-Set-R&D Systems-USA) nos grupos estudados. Cerca de 30% dos indivíduos do grupo controle foram responsivos, produzindo IFN-, quando estimulados com os antígenos específicos do Mycobacterium tuberculosis (Mtb). No grupo latente, 29% dos indivíduos ficaram abaixo do cut-off do kit QFT-IT. Indivíduos do grupo tuberculose em tratamento responderam menos aos antígenos de Mtb, quando comparados com grupo sem tratamento. A produção de TGF-β foi elevada em todos os grupos. Em indivíduos com tuberculose sem tratamento, a produção mostrou-se elevada em relação ao grupo de indivíduos com tuberculose em tratamento. Os níveis de TNF dos indivíduos com tuberculose sem tratamento foram menores em comparação aos grupos controle e latente, ratificando dados anteriores sobre a importância desta citocina na formação e manutenção do granuloma. Observou-se também que a resposta a fitohemaglutinina (PHA) não difere significativamente entre os grupos, porém o grupo latente apresentou resposta mais baixa. A citocina IL-12/23 não foi detectada nos grupos estudados. O índice de estímulo entre o TST e o QFT-IT mostrou uma concordância moderada (0,6) pelo índice kappa. Os resultados obtidos sugerem que, em nossa população vacinada e endêmica, esses antígenos não são bons preditores de doença, portanto mais estudos são necessários para avaliar a resposta celular utilizando o QFT-IT em nossa população. / Universidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências da Saúde

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:13:41Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69483.pdf: 23322936 bytes, checksum: da546ea400de59d62ce689a1527ed801 (MD5) 69483.pdf.txt: 321680 bytes, checksum: 6370ce3e181189c675b71fee7ec4e25c (MD5) 69483.pdf.jpg: 1479 bytes, checksum: bb823fd956b9bef3d685e4e511e60e9a (MD5) Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A tuberculose (TB) é a principal causa de morbi-mortalidade por doença infecciosa no mundo. A cada ano ocorrem cerca de 9 milhões de novos casos com aproximadamente 2 milhões de mortes, sendo que, somente 1 em cada 10 indivíduos desenvolvem a doença. Fatores genéticos do hospedeiro podem influenciar no controle da susceptibilidade à doença. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a caracterização de polimorfismos genéticos associados à imunopatogênese da TB. Para tanto, foram incluídos 172 pacientes com TB pulmonar ativa e 173 indivíduos controle sadios. Foi realizada a extração de DNA em todos os participantes deste estudo e os polimorfismos foram caracterizados para: NOS2A (-954G\2192C), IFNG (+874T\2192A), receptor de vitamina D (VDR) (TaqI, FokI, BsmI e ApaI) e proteína transportadora da vitamina D (DBP) (HaeIII e StyI). Não foi possível determinar nenhuma associação com o desenvolvimento da TB em relação aos polimortismos genéticos descritos neste estudo No entanto, quando ajustamos a casuística em relação ao sexo e raça podemos verificar que o polimorfismo no gene VDR determinado pela enzima de restrição TaqI foi associado com o desenvolvimento da TB em nossa população. Apesar de não observarmos significância estatística em relação aos outros polimorfismos deste gene VDR (FokI, BsmI e ApaI), foi possível obervar que cinco das dezesseis possíveis combinações genéticas foram consideradas raras, sendo seis delas encontrados em cerca de 74,8%, tanto nos pacientes com TB quanto nos indivíduos controle. Apesar de não terem sido observadas diferenças estatísticas nos polimorfismos dos genes avaliados neste estudo, estes devem ser considerados de extrema importância na compreensão da ação do sistema imune bem como a expressão de seus produtos no desenvolvimento da TB, em células infectadas ou não pelo Mtb. Desta forma, análises funcionais em relação a estes genes e seus produtos estão em andamento para tentarmos esclarecer esta associação e possivelmente assegurar seu papel no desenvolvimento da tuberculose em nossa população / Tuberculosis (TB) is the main cause of morbid-mortality by an infection disease worldwide. Each year 9 million new cases occur with approximately 2 million deaths, and among them, only 1 in each 10 persons will develop the disease. Host genetic factors can influence the control of the disease susceptibility, thus, the objective of this study was to characterize the genetic polymorphisms associated with the immunopathogenesis of TB. We included 172 active TB patients and 173 health control individuals. The DNA extraction was carried out in all the participants of this study and the polymorphisms were characterized for: NOS2 (-954G→C), IFNG (+874T→A), vitamin D receptor (VDR) (TaqI, FokI, BsmI e ApaI) and vitamin D binding protein (DBP) (HaeIII and StyI). It was not possible to demonstrate any association with the development of the TB regarding the genetic polymorphisms described in this study. However, when we adjusted the cases and healthy controls by matching sex and race we could verify statistical significance in the TaqI restriction site in the VDR gene, meaning that this restriction site may be associated with TB susceptibility in our population. Besides the lack of association among the other polymorphisms sites in theVDR gene (FokI, BsmI e ApaI), we could observe that five of sixteen genotype combinations were rare, although, six of them were found in aproximatelly 74,8% of TB cases and control individuals. Regardless of statistical differences among the evaluated polymorphisms in this study not being observed, those genes must be considered of extreme importance to understand the immune system actions as well as its product expression on TB development, in cells infected or not by Mtb. Thereby, studies in our population are in progress to try to identify the functional role of IFNG, NOS2A, VDR e DBP SNPs since their secreted products are relevant to the innate and adaptive immune response against Mycobacterium tuberculosis.

MOTA, A. P. P. Atividade antimicobacteriana do óleo essencial da casca de Cinnamomum zeylanicum e do trans-cinamaldeído e suas associações com rifampicina e isoniazida. 2017. 80 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-03-22T11:57:20Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_appmota.pdf: 2911137 bytes, checksum: 560bee89cb214ddef450e401f61fb281 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-03-22T11:57:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_appmota.pdf: 2911137 bytes, checksum: 560bee89cb214ddef450e401f61fb281 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T11:57:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_appmota.pdf: 2911137 bytes, checksum: 560bee89cb214ddef450e401f61fb281 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / The World Health Organization (WHO) has estimated that 10.4 million new cases of tuberculosis (TB) occurred worldwide in 2015, with a steady increase in resistance cases. Considering TB control difficulties, it is necessary to discover new drugs, especially for resistant strains, and it is believed that medicinal plants, through their essential oils (EOs), are one of the alternatives for bioprospecting active substances, such as the EO extracted from the bark of Cinnamomum zeylanicum (EOCzey), popularly known as cinnamon, and trans-cinnamaldehyde (TCin), its compound, which has several therapeutic properties, such as antimicrobial, anti-inflammatory, and hypoglycemic action, among others. In this context, the present study evaluated the antimycobacterial action of EOCzey and TCin on sensitive and resistant clinical isolates (CI) of M. tuberculosis, as well as the effects of the associations between EOCzey and TCin and the drugs rifampicin (RIF) and isoniazid (INH) on the standard M. tuberculosis H37Rv strain. The Resazurin Microtiter Assay (REMA) technique was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of the compounds tested on nine M. tuberculosis CIs. The effects of the EOCzey / RIF, EOCzey / INH, TCin / RIF and TCin / INH associations on the standard M. tuberculosis H37Rv strain were evaluated according to the checkerboard method, determining the Fraction Inhibitory Concentration Index (FICi), in which the synergistic effect was observed with FICi values ≤ 0.5, additive effect with FICi >0.5 and ≤ 1 and antagonism with FICi >1.0. It was observed that EOCzey and TCin were able to inhibit the growth of all nine sensitive and resistant CIs with MIC values ranging from 9.75 μg / mL to 39 μg / mL. All four associations tested resulted in synergistic and additive effects, with no antagonistic effect. Both EOCzey / RIF and EOCzey / INH associations showed FICi values of 0.375 and 0.5, whereas the TCin / RIF and TCin / INH associations showed FICi values of 0.31, 0.375 and 0.5. / A Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou a ocorrência de 10,4 milhões casos novos de tuberculose (TB) no mundo em 2015 com um aumento contínuo dos casos de resistência. Com a difilcudade de controle TB, existe a necessidade da descoberta de novos fármacos, especialmente sobre cepas resistentes e acredita-se que as plantas medicinais, através dos óleos essenciais (OEs), sejam uma das alternativas para bioprospecção de substâncias ativas, como o OE extraído da casca de Cinnamomum zeylanicum (OECzey), popularmente conhecida com canela, e o trans-cinamaldeído (TCin), seu composto, que possuem diversas propriedades terapêuticas, como ação antimicrobiana, anti-inflamatória, hipoglicemiante, entre outras. Nesse contexto, o presente estudo avaliou a ação antimicobacteriana do OECzey e do TCin sobre isolados clínicos (ICs) de M. tuberculosis, sensíveis e resistentes, como também os efeitos das associações entre o OECzey e TCin com os fármacos rifampicina (RIF) e isoniazida (INH) sob a cepa padrão M. tuberculosis H37Rv. Utilizou-se a técnica Resazurin Microtiter Assay (REMA) para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos compostos testados sobre nove ICs de M. tuberculosis. Os efeitos das associações OECzey/RIF, OECzey/INH, TCin/RIF e TCin/INH sobre a cepa padrão M. tuberculosis H37Rv foram avaliadas de acordo com método Checkerboard, determinando-se o Índice de Concentração Inibitória Fracionada (IFIC), no qual efeito sinérgico foi observador com valores de IFIC ≤ 0,5, efeito aditivo com IFIC > 0,5 e ≤ 1 e antagonismo com IFIC > 1,0. Observou-se que OECzey e o TCin foram capazes de inibir o crescimento de todos os nove ICs, sensíveis e resistentes, com valores de CIM variando entre 9,75 μg/mL a 39 μg/mL. Todas as quatro associações testadas resultaram em efeito sinérgico e aditivo, com ausência efeito antagônico. Ambas associações OECzey/RIF e OECzey/INH apresentaram valores de ICIF de 0,375 e 0,5, enquanto que nas associações TCin/RIF e TCin/INH os valores de IFIC foram 0,31, 0,375 e 0,5.