O tratamento com antimicrobianos é a principal estratégia de controle da tuberculose (TB). Entretanto, o aumento do número de casos de TB com cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente aos antimicrobianos cria um cenário que dificulta a cura do paciente e o controle da doença. Embora várias mutações em loci específicos tenham sido identificadas como base de resistência, outros mecanismos, como o sistema de efluxo, podem contribuir para a resistência e o estabelecimento dessas mutações. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes aos principais antimicrobianos do esquema básico (isoniazida, INH; e rifampicina, RIF) e de multirresistência (ofloxacina, OFX; e amicacina, AMK). Três clássicos inibidores de bombas de efluxo - EPI - (verapamil, VP; tioridazina, TZ; e clorpromazina, CPZ) foram selecionados para detectar o efluxo. Primeiramente, foram analisadas três cepas MDR, duas pré-XDR e a cepa sensível de referência H37Rv. Foi utilizada a metodologia de checkerboard combinada com o tetrazolium microplate-based assay para analisar a interação entre os EPIs com os fármacos. Foi observado que os EPIs diminuem efetivamente a resistência aos antibióticos utilizados, com reduções de 4 a 64 vezes. Para avaliar a atividade do efluxo em tempo real foi utilizado o método fluorimétrico com o brometo de etídio (BrEt), em presença dos EPIs. Foi demonstrado que todas as cepas apresentaram efluxo intrínseco, porém a acumulação e o efluxo do BrEt foi mais evidente na cepa pre-XDR com resistência adicional a AMK. A quantificação transcricional do RNAm dos genes de bombas de efluxo (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) e do regulador transcricional whib7, quando as cepas foram expostas às concentrações subinibitórias dos antibióticos, foi analisada por RT-qPCR. Houve um aumento do nível transcricional de todos os genes em uma cepa MDR e na cepa Pre-XDR com resistência adicional a OFX, quando expostas a pelo menos um dos fármacos envolvidos na resistência. / Treatment with antimicrobials is the main TB control strategy. However, the increase in the number of TB cases with Mycobacterium tuberculosis strains resistant to antimicrobial creates a scenario that hinders patient's healing and disease control. Although several genetic mutations in specific loci involved in drug resistance have been identified as base of resistance, other mechanisms such as efflux system may contribute to resistance and to the establishment of these mutations. The main goal of this study was to assess the overall contribution of efflux mechanism in M. tuberculosis clinical isolates resistant to the main first line drugs (isoniazid, INH; and rifampicin, RIF) and second line (ofloxacin, OFX; and amikacin, AMK). Three classical inhibitors of efflux pumps -EPI- (verapamil, VP; thioridazine, TZ; and chlorpromazine, CPZ) were selected to detect the efflux. Firstly, we analyzed three MDR strains, two Pre-XDR and an H37Rv reference susceptible strain. We used the checkerboard method combined with the tetrazolium microplate-based assay to analyze the interaction between EPIs and drugs. It was observed that EPIs effectively reduce the MIC of antibiotics, with four-fold to 64-fold reduction. Efflux activity was evaluated in real-time by fluorimetric method with ethidium bromide (EtBr), in the presence of EPIs. All strains showed intrinsic efflux, however the accumulation and efflux of EtBr was evident most in the pre-XDR strain with additional resistance to AMK. The quantification of mRNA transcriptional level of efflux pump genes (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) and the transcriptional regulator, whib7, when strains were exposed to antibiotics subinibitory concentrations was examined by RT-qPCR. There was an increase in the transcriptional level of all genes in a MDR strain and pre-XDR strain with additional OFX resistance, when exposed to at least one of the drugs involved in resistance, INH, RIF or OFX. However, there was no correlation between the reduction of antibiotic resistance levels with the EPI and the expression of genes encoding the pumps. Finally, in order to demonstrate the time to detection (TTD) of the bacterial growth in the antimicrobial environment in presence and absence of EPI, were applied BACTECTM MGITTM system 960 and Epicenter V5.53A equipped with software TB eXiST. Were used the MDR strains, a pre-XDR strain with additional resistance to AMK, and a monorresistant to OFX strain. In general, strains have showed a slower grew in the presence of VP, TZ and/or CPZ when combined with INH or RIF. This suggests that efflux is essential for the strain to grow faster in the presence of certain antibiotics. In addition, the efflux can act synergistically with the presence of mutations in order to reduce the biological cost of the bacteria and promoting growth at high drug concentrations. In conclusion, the described results demonstrated that the efflux system plays an important role in resistance to antibiotics used in the treatment of TB, and that the use of efflux inhibitors may potentiate the antimicrobial activity.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Estimause que um terco da populacao mundial esteja infectado pelo bacilo. Sabe-se que 10% dos adultos infectados pelo M. tuberculosis adoecerao, 5% logo apos a primoinfeccao e os outros 5% por reativacao do bacilo ou nova exposicao. O risco de adoecimento e maior nos dois primeiros anos apos a infeccao, e aproximadamente 90% dos casos de adoecimento dos contatos ocorre neste periodo. O presente estudo prospectivo teve como objetivo avaliar as caracteristicas epidemiologicas e demograficas dos contatos de pacientes com tuberculose e analisar os fatores de risco para infeccao latente e progressao para o adoecimento por tuberculose acompanhada por um periodo de dois anos no Instituto Clemente Ferreira em São Paulo. Foram analisados 339 contatos dos 140 casos indices. Realizaram a prova tuberculinica (PT) 233 adultos e 106 criancas. A taxa de ILTB entre os contatos foi de 64% e existiu uma forte associacao entre infeccao latente e a positividade da baciloscopia do caso indice. Nao se observou correlacao entre a incidencia de infeccao latente ou adoecimento entre os contatos com os outros fatores estudados (grau de convivencia, grau de parentesco, doencas associadas, tempo de contato com o caso indice bacilifero, tabagismo e etilismo). O tratamento da infeccao latente pelo Mtb foi fator de maior relevancia na progressao para tuberculose ativa entre contatos. A taxa de adoecimento entre todos os contatos foi de 5% e de 8,3% entre os reatores a prova tuberculinica. Entre todos os contatos que receberam tratamento profilatico nenhum adoeceu. Dos 87 contatos que nao receberam tratamento preventivo, 21% adoeceram. Das 11 criancas em que nao foi indicado o tratamento da infeccao latente, tres adoeceram. Entre os contatos adultos dos 76 que nao receberam tratamento para ILTB, 15 adoeceram. O tratamento da tuberculose latente e o diagnostico precoce da tuberculose ativa sao fundamentais para bloquear a transmissao que sustenta a epidemia da TB dessa forma instituir o tratamento precoce da doenca. Neste estudo observamos que 100% daqueles que receberam quimioprofilaxia nao adoeceram o que reforca a importancia do acompanhamento dos contatos e tratamento da infeccao latente nessa populacao / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327744.pdf: 3387181 bytes, checksum: f953d00b12dd357296a0d6cf6ed03852 (MD5) Previous issue date: 2014 / Este trabalho teve como objetivo principal a síntese e caracterização de 22 chalconas derivadas do 4-carboxibenzaldeído, e avaliação da sua atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. As chalconas foram sintetizadas através do método de condensação de Claisen-Schmidt, utilizando quatro condições reacionais distintas. Todas as chalconas foram caracterizadas através de espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, ponto de fusão e espectros de massa (EM). As chalconas obtidas por via ácida (VA) forneceram primeiramente produtos esterificados, que foram hidrolisados para obter as chalconas com carboxila livre, que foram confirmadas pelo ponto de fusão. Entre as 22 chalconas obtidas, 13 são inéditas Q1VA, Q2VA, Q5VA, Q18VA, Q16VB, Q17VB, Q20VB, Q22VB, Q26VB, Q7VBR, Q3MC, Q4MC e Q9MC. As chalconas Q22VB e Q26VB foram as que apresentaram melhor atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. O composto Q23VB, análogo ao composto (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) anteriormente publicado pelo grupo e que tem alta atividade frente a estas enzimas, não teve atividade significativa.<br> / Abstract : This work aimed to the synthesis and characterization of 22 chalcones derived from 4 - carboxybenzaldehyde , and evaluation of their biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The chalcones were synthesized by the method of Claisen -Schmidt condensation using four different reaction conditions . All chalcones were characterized by nuclear magnetic resonance spectra ( NMR) 1H and 13C NMR , melting point and mass spectra ( MS). The chalcones obtained via acid (VA) provided first esterified product , which was hydrolyzed to obtain chalcones with free carboxyl , which was confirmed by melting point. Among the 22 chalcones obtained , 13 are new Q1VA , Q2VA , Q5VA , Q18VA , Q16VB , Q17VB , Q20VB , Q22VB , Q26VB , Q7VBR , Q3MC , Q4MC and Q9MC . The Q22VB and Q26VB chalcones showed the best biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The compound Q23VB , analogous to compound (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) previously published by the group and has high activity against these enzymes had no significant activity.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000042.pdf: 1706671 bytes, checksum: dc956801bf26bdb2686d937802c8fb3f (MD5) Previous issue date: 2008 / O diagnóstico da tuberculose (TB) se baseia em dados clínicos e epidemiológicos associados aos métodoslaboratoriais (baciloscopia, cultura de materiais biológicos e TTI - Teste Tuberculínico Intradérmico) e radiografia de tórax. Em crianças, por serem paucibacilares e muitas vezes apresentarem reações cruzadas ao TST, devido à vacinação recente com BCG e à exposição à micobactérias ambientais, existem dificuldades maiores para obter esse diagnóstico. Diante disso, métodos imunológicos têm sido propostos. Dentre eles, destacam-se os baseados em antígenos recombinantes específicos do complexo M. tuberculosis: o ESAT-6 (early secretory antigen target 6) e o CFP- 10 (culture filtrate protein 10), que são potentes indutores de IFN- . Baseado nisso, o nosso estudo teve como objetivos: avaliar os níveis de IFN- , produzidos por células sanguíneas induzidos por ESAT-6, CFP-10 e PPD in vitro, através de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), em pacientes pediátricos e determinar a sensibilidade e a especificidade dos ensaios definindo qual o teste mais apropriado para o diagnóstico. Foram selecionadas, no Hospital das Clínicas e no Instituto Professor Fernando Figueira-PE, crianças com idade de 3 a 15 anos, de ambos os sexos, e de acordo com os fatores de inclusão foram distribuídas em grupos de TB doença (n = 21) e TB latente (n = 17). O grupo controle negativo (n=21) foi formado por crianças com ausência de sinais e sintomas de TB e sem história de contato com adulto bacilífero. Os níveis de IFN- contra os antígenos ESAT-6, CFP-10 e PPD in vitro foram quantificados e a curva ROC (receiving operating characteristics) foi utilizada para avaliar a capacidade desses antígenos de diagnosticar TB infantil (latente e/ou doença). O único antígeno que demonstrou essa capacidade foi o ESAT-6 (P 0,05), tanto para TB latente (AAC

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:12:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 156.pdf: 1949313 bytes, checksum: a974aa632b3267e55b2211756c219777 (MD5) Previous issue date: 1999 / Aborda as conseqüências sobre a saúde dos profissionais de enfermagem e medicina decorrentes do distanciamento entre o trabalho prescrito e o trabalho real. Analisa as dificuldades vivenciadas por estes profissionais no âmbito hospitalar frente ao recrudescimento da tuberculose e suas relaçoes com a organizaçao e o processo de trabalho. Trata-se de um estudo de caso, desenvolvido no serviço de tisiopneumologia de um hospital público universitário, localizado no Município do Rio de Janeiro. O referencial teórico-metodológico baseia-se em conceitos da saúde do trabalhador e da ergonomia contemporânea. O foco de discussao centra-se nas situaçoes de exposiçao ocupacional ao agente etiologico da tuberculose. A abordagem do campo orientou-se pela metodologia da Análise Ergonômica do Trabalho (AET), com ênfase na análise de demanda e da atividade. Observa-se que as condiçoes do ambiente de trabalho possuem determinantes relacionados aos aspectos organizacionais. A unidade de internaçao e o setor de broncoscopia foram identificados como as principais áreas do serviço que oferecem maior risco de exposiçao ocupacional ao Mycobacterium tuberculosis. Dentre os casos de tuberculose ocorridos em profissionais de saúde do hospital, estas foram as áreas do serviço que concentraram maior número de casos. Verificou-se que no serviço de tisiopneumologia as condiçoes do ambiente e a forma pela qual o serviço está organizado constituem os principais condicionantes das situaçoes de exposiçao ocupacional ao M. tuberculosis. Considera-se premente a necessidade de reestruturaçao tanto das instalaçoes físicas, como dos procedimentos assistenciais. No que diz respeito à estrutura física, ressalta-se a necessidade de maior número de áreas de isolamento. Quanto aos aspectos assistenciais, destaca-se a necessidade dos profissionais envolvidos tornarem-se mais sensíveis à problemática da tuberculose hospitalar, no sentido de agilizar a identificaçao de pacientes bacilíferos e ainstituir medidas de proteçao nos casos suspeitos até confirmaçao laboratorial.

FIÉVEZ, Aline Mireille da Cunha. Avaliação da reação em cadeia da polimerase (PCR) e métodos convencionais no diagnóstico de micobacteriose extrapulmonar exceto renal. 2006. 100 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-20T12:48:33Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_amcfievez.pdf: 695266 bytes, checksum: e437ff57b2a73b87f5c90be990554ed3 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T13:34:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_amcfievez.pdf: 695266 bytes, checksum: e437ff57b2a73b87f5c90be990554ed3 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T13:34:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_amcfievez.pdf: 695266 bytes, checksum: e437ff57b2a73b87f5c90be990554ed3 (MD5) Previous issue date: 2005 / In order to focus on the importance of laboratorial diagnosis of extrapulmonary mycobacteria, except renal, we employed the polymerase chain reaction (PCR). Clinical samples (body fluids) were tested by PCR for the presence of Mycobacterium tuberculosis complex (MTB) and nontuberculous mycobacteria (MNTB). We compared the results obtained through the PCR with the ones obtained through conventional microbiological methods. The 114 clinical samples were obtained from internal patients or from or in ambulatorial attendance with clinical suspicion of extrapulmonary tuberculosis, except renal. The samples were collected from 2001 to 2003, and ceded to this research by the Laboratório de Microbiologia do Laboratório Central do Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC-UFC), and by the Laboratório Central de Saúde Pública da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará (LACEN-CE). The direct microscopy and culture were negative in all the samples. The molecular research, for the Mycobacterium genus was positive in 10 samples, and for the Mycobacterium tuberculosis complex was negative in all the samples. / Com o objetivo de enfatizar a importância do diagnóstico laboratorial de micobactérias em sítios extrapulmonares, exceto renal, utilizou-se neste trabalho a reação em cadeia da polimerase (PCR). Na PCR foram empregados iniciadores específicos para a detecção de micobactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB) e não pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MNTB). Foram comparados os resultados obtidos na PCR com os métodos microbiológicos convencionais. Foram analisadas 114 amostras clínicas (líquidos corporais) provenientes de pacientes internados ou em atendimento ambulatorial, com suspeita clínica de tuberculose extrapulmonar, exceto renal. As amostras foram coletadas no período de 2001 a 2003 e cedidas pelo Laboratório de Microbiologia do Laboratório Central do Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC-UFC) e pelo Laboratório Central de Saúde Pública da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará (LACEN-CE). A baciloscopia e a cultura foram negativas em todas as amostras. A pesquisa molecular para o gênero Mycobacterium foi positiva em dez amostras e, para o complexo Mycobacterium tuberculosis, foi negativa em todas as amostras.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-12-05T03:13:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349065.pdf: 2734525 bytes, checksum: af2239d8312ad1a6b66e889ae584f8f7 (MD5) Previous issue date: 2017 / A Tuberculose (TB) é uma doença causada por bactérias pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis. Segundo a Organização Mundial de Saúde, estimou-se que em 2015, 10,4 milhões de pessoas desenvolveram TB mundialmente e 1,4 milhões morreram em decorrência da doença. No Brasil, foram registrados em 2015, 1027 casos de TB resistente aos fármacos. A isoniazida é um dos fármacos mais efetivos no tratamento da TB. Os principais mecanismos de resistência à isoniazida estão relacionados a mutações nos genes que codificam o ativador do fármaco (gene katG) e o alvo deste (gene inhA). Mutações nos genes katG e inhA são responsáveis por aproximadamente 75% dos casos de M. tuberculosis resistentes à isoniazida, no entanto, em 25% dos casos, tais mutações não são encontradas. Acredita-se que a superexpressão de proteínas do tipo bombas de efluxo sejam responsáveis por este percentual. O aumento na atividade de efluxo resulta na redução das concentrações intrabacterianas do fármaco, o que pode propiciar a sobrevivência de uma subpopulação bacteriana exposta ao constante estresse causado pelas concentrações subinibitórias do fármaco. Durante esta exposição, mutantes com alterações gênicas que favoreçam a resistência podem ser selecionados, possibilitando o estabelecimento de uma população resistente que se torna clinicamente significante. Sendo assim, objetivou-se com o presente estudo, avaliar os níveis de expressão dos genes que codificam para bombas de efluxo mmr, jefA, efpA, bacA e drrA em isolados clínicos de M. tuberculosis com diferentes perfis de susceptibilidade à isoniazida. Os isolados foram categorizados em três grupos: 1. isolados susceptíveis à isoniazida; 2. isolados susceptíveis à isoniazida provenientes de pacientes com baciloscopia positiva ao quarto mês de tratamento e 3. isolados com monorresistência primária à isoniazida. Os resultados obtidos por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real foram comparados entre os grupos e em relação à cepa de referência M. tuberculosis H37Rv. Para os genes jefA, efpA e drrA não foi observada diferença significativa nos níveis de expressão entre os grupos. Desta forma, não foi possível estabelecer uma relação entre os níveis de expressão desses genes e o fenótipo de resistência apresentado pelos isolados. Para os genes mmr e bacA foi encontrada relação significativa entre os níveis basais de expressão e o fenótipo de monorresistência à isoniazida. O gene mmr, o qual codifica para proteínas da família Small Multidrug Resistance, apresentou valores de expressão basal aumentados nos isolados com monorresistência primária à isoniazida quando comparados aos isolados susceptíveis, sugerindo que este gene possa estar relacionado com a resistência à isoniazida. Os níveis de expressão basal do gene bacA nos isolados susceptíveis foram superiores aos níveis encontrados nos isolados com monorresistência primária à isoniazida, sugerindo que níveis reduzidos de expressão do gene bacA possam estar relacionados com a resistência à isoniazida. Os níveis de expressão basal de bacA observados em 83,3% dos isolados clínicos, tanto monorresistentes quanto susceptíveis foram menores que os níveis observados na cepa de referência M. tuberculosis H37Rv. O gene bacA codifica para transportadores do tipo ABC e atua na captação de vitamina B12. / Abstract : Tuberculosis (TB) is a disease caused by bacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis Complex. According to the World Health Organization, in 2015, an estimated 10.4 million people developed TB worldwide and 1.4 million died from the disease. In Brazil, 1,027 cases of drug-resistant TB were recorded in 2015. Isoniazid is one of the most effective drugs in the treatment of TB. The major mechanisms of resistance to isoniazid are related to mutations in the genes that encode the drug activator (katG gene) and the drug target (inhA gene). Mutations in katG and inhA genes account for approximately 75% of isoniazid-resistant M. tuberculosis cases; however, in 25% of cases, such mutations are not found. It is believed that overexpression of efflux proteins accounts for this percentage. The increase in efflux activity results in the reduction of intrabacterial drug concentrations, which may lead the survival of a bacterial subpopulation exposed to constant stress of subinhibitory drug concentrations. During this exposition, mutants with alterations in genes that favor resistance can be selected, allowing the establishment of a resistant population that becomes clinically significant. Therefore, the aim of this study was to evaluate the expression levels of efflux pumps genes mmr, jefA, efpA, bacA and drrA in clinical isolates of M. tuberculosis with different isoniazid susceptibility profiles. The isolates were divided into three groups: 1. isoniazid-susceptible isolates, 2. isoniazid-susceptible isolates from patients with positive bacilloscopy after four months of treatment, and 3. isoniazid-resistant isolates. The results obtained using the Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction technique were compared between the groups and in relation to the reference strain M. tuberculosis H37Rv. For the jefA, efpA and drrA genes, no significant difference in expression levels was observed between groups. Therefore, it was not possible to establish a relationship between the expression levels of these genes and the resistance phenotype of the isolates. For the mmr and bacA genes, a significant relationship was found between the expression levels and the isoniazid-monoresistant phenotype. The mmr gene, which encodes proteins from the Small Multidrug Resistance family, presented increased baseline expression values in isolates with primary isoniazid monoresistance, when compared to susceptible isolates, suggesting that this gene may be related to isoniazid resistance. Basal expression levels of the bacA gene in susceptible isolates were higher than levels found in isolates with primary isoniazid monoresistance, suggesting that reduced levels of the bacA gene may be related to isoniazid resistance. The basal expression levels of bacA observed in 83.3% of clinical isolates, both isoniazid-monoresistant and susceptible, were lower than the levels observed in the reference strain M. tuberculosis H37Rv. The bacA gene codes for ABC type transporters and acts on the uptake of vitamin B12.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6777_Tese SAV 04-10-13.pdf: 4494409 bytes, checksum: 06e58e07b25332ca734da704af738a2c (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Introdução: Baseado na hipótese de que a variabilidade genética de Mycobacterium tuberculosis (MTB) pode influenciar a virulência e a gravidade da doença os perfis genéticos de isolados clínicos de MTB foram avaliados para detectar associação entre diversidade genética e gravidade da doença. Objetivos: Analisar características genéticas de isolados de MTB e verificar sua possível associação com a gravidade da TB pulmonar. Métodos: Estudo retrospectivo, caso controle, conduzido em Vitória-ES, utilizando isolados de MTB (2003 a 2006, n=214) de pacientes com TB pulmonar, cavitária (127) e não cavitária (87). Realizou-se genotipagem por meio de RFLP-IS6110, Spoligotyping, MIRU-VNTR 24 loci, e a análise de deleções e inserções, como RDRio, RD174 utilizando PCR multiplex, bem como a detecção do Ag85C103. Realizou-se análise estatística, para verificação dos padrões de distribuição das variáveis, seguida de análises bivariadas para verificação de associações entre elas, empregando-se os teste exato de Fisher ou Chi-quadrado, ambos com 95% de intervalo de confiança e nível de significância (&#61554;) < 0,05. Resultados: Após a regressão logística, as variáveis que contribuíram no modelo explicativo da doença foram baciloscopia (ORajust = 5,96; IC= 2,58-13,73) e produção de escarro (ORajust = 4,55; IC= 1,28-16,12). Não houve associação estatisticamente significativa com o restante das variáveis.A família LAM foi a mais frequente entre os dois grupos analisados, representando 65 (62%) dos isolados no grupo cavitário e 40 isolados (38%) do grupo não cavitário. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos em relação à deleção RDRio (p=0,65) e com relação à deleção RD174 (p=0,65). Dentre os 205 isolados analisados, 25 (12%) isolados do grupo não cavitário e 43 (21%) do grupo cavitário, estavam em cluster. não houve diferença estatisticamente significativa entre a quantidade de clusters e os grupos analisados (p= 0,4). Conclusões: Foi determinado o perfil genotípico dos isolados de pacientes com doença pulmonar, cavitária e não cavitária. Não houve associação entre a presença de cavidade e os genótipos encontrados. Não houve associação do genótipo com nenhum dos marcadores moleculares avaliados. Palavras Chaves: Mycobacterium tuberculosis, genotipagem molecular, RFLP- IS6110, MIRU-VNTR 24 loci , Spoligotyping.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-03-26T19:48:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Luiz Guilherme Schimidt Castellani.pdf: 1781231 bytes, checksum: 875aa69391e57600531cb990b00dd009 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-04-07T18:30:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Luiz Guilherme Schimidt Castellani.pdf: 1781231 bytes, checksum: 875aa69391e57600531cb990b00dd009 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T18:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Luiz Guilherme Schimidt Castellani.pdf: 1781231 bytes, checksum: 875aa69391e57600531cb990b00dd009 (MD5) Previous issue date: 2013-08 / A resistência a fármacos antituberculose tem constituído uma grande ameaça ao controle da tuberculose em âmbito mundial. A sua detecção precoce permite ao médico instituir um esquema de tratamento mais adequado ao paciente e consequentemente quebrar a cadeia de transmissão dos bacilos. Os testes de sensibilidade a antimicrobianos atuais, embora eficientes, são caros e/ou demorados e/ou trabalhosos. Com base nesta premissa, nos propusemos a desenvolver e padronizar um método fenotípico direto para determinação da sensibilidade do Mycobacterium tuberculosis a antimicrobianos de primeira linha do tratamento da tuberculose. Para o desenvolvimento deste novo teste, utilizaram-se os princípios do método das proporções e do exame de cultura pelo método de Ogawa–Kudoh. O estudo foi dividido em duas fases. A primeira, caracterizada pelo desenvolvimento e padronização do método proposto e a segunda, pela análise da concordância entre o método desenvolvido e o método do MGIT (padrão-ouro). Na primeira fase, foram realizados diversos ensaios para definir: os volumes de absorção e de liberação de líquidos de diferentes tipos de swab, o meio de cultura, as concentrações dos antimicrobianos e o tempo de leitura/interpretação das culturas. Além disso, foi verificado se a amostra deveria ou não ser diluída. Com base nos resultados destes ensaios, padronizou-se o método com: swab comercial, em meio de cultura Ogawa- Kudoh contendo separadamente 0,2 μg/mL de isoniazida, 40,0 μg/mL de rifampicina, 10,0 μg/mL de estreptomicina e 500,0 μg/mL de ácido para-nitrobenzóico. Padronizou-se ainda a inoculação da amostra de escarro de forma direta, ou seja, sem diluir e a leitura/interpretação do resultado do teste no período entre 21 e 28 dias. A análise comparativa entre este método e o teste de sensibilidade a antimicrobianos no sistema MGIT realizada na segunda fase do projeto indicou um índice kappa igual a 1,000, ou seja, uma concordância muito boa em relação ao padrão-ouro. Diante desses resultados promissores, acreditamos que o método desenvolvido apresente um grande potencial para ser utilizado em laboratórios com pouca infra-estrutura, por ser de baixo custo, fácil execução e relativamente rápido. / Drug resistance has become a worldwide threat to tuberculosis control. Its early detection allows the doctor to use more appropriate treatment regimens and thereafter to break the transmission chain of the bacilli. Current drug susceptibility tests, though efficient, are expensive and/or lengthy and/or laborious. Based on that premise, we proposed to develop and standardize a direct phenotypic method to determinate the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to first line drugs used on tuberculosis treatment. To develop this new method, it was used the principles of the proportion method and the Ogawa-Kudoh swab culture method. The study was divided in two phases. The first was characterized by the development and standardization of the proposed method and the second by analyzing the agreement between the developed method and the MGIT method (gold standard). In the first phase, several assays were realized to define: the absorption and liberation volumes of liquids from different kinds of swab, the culture medium, the drugs concentrations and the time to read/interpret the cultures. Besides, it was verified if the sample should or should not be diluted. Based on results, the method was standardized with: commercial swab, Ogawa-Kudoh culture medium containing separately 0,2 μg/mL of isoniazid, 40,0 μg/mL of rifampicin, 10,0 μg/mL of streptomycin e 500,0 μg/mL of para-nitrobenzoic acid. It was also standardized that the sample should not be diluted and the cultures should be read/interpreted between 21 and 28 days. The comparative analyzes between this method and the susceptibility test on MGIT system indicated a kappa index equal to 1,000, which means a perfect agreement to gold standard. Given these promising results, we believe that the developed method presents a great potential to be used in laboratories with little infrastructure, because of its low cost, it is easy to perform and relatively fast.

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Porém sua sensibilidade é baixa, principalmente nas formas paucibacilares da doença. Nesse sentido, novas metodologias que resultem no aumento da sensibilidade da baciloscopia tornam-se absolutamente necessárias. Neste estudo, nos propusemos a aprimorar e padronizar o sistema de filtração BacFil e avaliar sua performance e acurácia em amostras paucibacilares (lavado broncoalveolar). Para alcançar esses objetivos desenvolvemos o estudo em duas fases. Na primeira fase, foram realizados ensaios para definir: 1) utilização de membranas brancas para visualização de BAAR corados por Auramina-O; 2) aumento do volume de NALC, utilização de pérolas de vidro no processo de digestão das amostras e mudança no sistema do suporte do pré-filtro; 3) meios de fixação da membrana de filtração na lâmina de microscopia; 4) limite de detecção da técnica; 5) aumento do volume de NaOCl e a influência desse aumento na visualização de BAAR na membrana. Verificou-se que: a membrana de policarbonato branca tem a mesma eficiência da membrana de policarbonato preta na visualização de BAAR fluorescentes; o método modificado utilizando maior concentração de NALC, pérolas de vidro e sistema de pré-filtro baseado em orifícios obteve 98% de passagem das amostras pelo sistema; a melhor forma de fixação da membrana na lâmina foi obtida por intermédio da utilização de fita dupla face; o limite de detecção da técnica de filtração utilizando o sistema BacFil versão 6.0 foi de 2 a 9 BAAR por mililitro de suspensão bacteriana com D.O de 0,250 ± 0,01 a 625nm; o aumento da concentração de NaOCl para 10% ajuda na passagem de um maior volume de amostra pelo sistema, porém ocasiona a diminuição da quantidade BAAR na membrana de filtração após o período necessário para todo o processo. Na segunda fase foi avaliado acurácia da técnica padronizada em 101 amostras de lavado broncoalveolar (LBA) de pacientes com suspeita de TB provenientes do Hospital Universitário Cassiano Antônio de Moraes. Observou-se que a sensibilidade da técnica de filtração (BacFil versão 6.0) foi de 76% e especificidade de 95%. A sensibilidade obtida foi significativamente maior do que a observada na baciloscopia após centrifugação que foi de 59% (p = 0,001). No entanto, constatou-se uma diminuição de especificidade na técnica de filtração (95%) em relação a técnica de 8 centrifugação (99%). Concluímos que as modificações realizadas nos sistema de filtração permitiu sanar os problemas técnicos apresentados nas versões anteriores e aumentar a sensibilidade da baciloscopia de amostras paucibacilares (lavado broncoalveolar) para o diagnóstico da TB pulmonar. / The smear microscopy is the main diagnostic method of tuberculosis (TB) due to its low cost, fastness and easy execution. However, its sensitivity is low especially in the paucibacillary forms of the disease. Therefore, new methods that enhance the sensitivity of smear microscopy are required. In this study, we proposed to improve and standardize the BacFil filtration system and to evaluate its performance and accuracy in bronchoalveolar lavage (BAL). To achieve these goals we developed a study in two stages. In the first stage we conducted assays to define: 1) use of polycarbonate white membranes to visualize fluorescent AFB stained by Auramine- O; 2) increase the volume of NALC, addition of glass beads in the digestion procedures and changes in the prefilter support; 3) ways to fixate the membrane on the microscopy slides; 4) the detection limit of the technique; 5) increased concentration of NaOCl and its influence to visualize AFB on the filtration’s membrane. It was verified that: the polycarbonate white membrane has the same efficiency of the polycarbonate black membrane to visualize fluorescent AFB; the modified digestion method using higher volume of NALC and glass beads plus prefilter support system based on holes allowed 98% of the samples to pass trough the filtration system; the best way to fixate the membrane on the slides was with double-side tape; the detection limit of the technique using the BacFil system version 6.0 was 2 to 9 AFB per milliliter of a bacterial suspension with O.D. = 0,250 ± 0,01; the use of NaOCl 10% (v/v) helps the passage of a higher volume of samples through the system, however it causes AFB loss on the filtration membrane after the time needed to finish all the process. In the second stage it was evaluated the accuracy of the standardized technique in 101 BAL of patients with suspected TB coming from Hospital Universitário Cassiano Antônio de Moraes. We observed a higher sensitivity of filtration technique using the BacFil version 6.0 system (76%) when compared to the concentrated smear microscopy (59%), and this difference is statistically significant (p = 0,001). However, it was detected a lower specificity of the filtration technique (95%) in comparison with centrifuged smear microscopy (99%). We concluded that the modifications made on the filtration system allowed us to solve the techinicals issues reported in previous versions, and to enhance the sensitivity of smear microscopy in paucibacillary samples (BAL) for the TB diagnosis.