No / TCDD-inducible poly-ADP-ribose polymerase (TIPARP; also known as PARP7 and ARTD14) is a mono-ADP- ribosyltransferase that has emerged as an important regulator of innate immunity, stem cell pluripotency, and transcription factor regulation. Characterizing TIPARP’s catalytic activity and identifying its target proteins are critical to understanding its cellular function. Here we describe methods that we use to characterize TIPARP catalytic activity and its mono-ADP-ribosylation of its target proteins.

Essential genes are involved in control of the basic metabolism of their host. These genes encode elements involved is such crucial processes as DNA replication, transcription, translation or biosynthesis of important molecules. What makes essential genes unique is the fact that they cannot be lost from the genome. If any of them becomes inactivated it would result in inevitable death of an organism. Because of their role they can be efficiently used to control the survival of genetically modified organisms. Specific regulatory mechanisms can be applied to modulate the activity of essential genes, which prevents an organism from growing at determined conditions. Such mechanisms are called “kill switches” and have been developed in recent years as a response to significant development in the field of molecular biology. Proteins encoded by psychrophilic organisms are characterized by decreased resistance to thermal denaturation. This is believed to be a result of adaptation to low-temperature environment, where mutations that destabilize the protein structure are not selected against. For these reasons they often cannot perform their functions at moderate temperatures, which are typical for mesophilic organisms. At the same time psychrophilic proteins do not display any inhibition at permissive conditions. Use of psychrophilic alleles of essential genes has been proposed as a method of rendering modified organisms incapable of surviving at elevated temperatures. This allows generation of attenuated strains of pathogenic bacteria or generally safe versions of laboratory organisms. A temperature-sensitive organism can be created by substituting a single essential gene in mesophilic organism with its psychrophilic homologue. This can be facilitated by using the host’s native recombination system or through the use of plasmid based allele shuffling mechanisms. The objective of this work was to analyze a number of psychrophilic alleles of various essential genes for their ability to cause temperature-sensitive phenotype in mesophilic bacterium Francisella novicida. The special attention has been placed on investigating psychrophilic alleles of bacterial DNA ligase. Furthermore a selected psychrophilic strain has been characterized as a potential source of multiple temperature-sensitive alleles of essential genes. Finally the secondary focus was to develop a simple and robust mechanism allowing efficient exchange of alleles of essential genes in the mesophilic host. / Graduate

published_or_final_version / abstract / Physiology / Doctoral / Doctor of Philosophy

The kinetic mechanism of activation of the NAD-malic enzyme by fumarate and the transition state structure for the oxidation malate for the NAD-malic enzyme reaction have been studied. Fumarate exerts its activating effect by decreasing the off-rate for malate from the E:Mg:malate and E:Mg:NAD:malate complexes. The activation by fumarate results in a decrease in K_imalate and an increase in V/K_malate by about 2-fold, while the maximum velocity remains constant. A discrimination exists between active and activator sites for the binding of dicarboxylic acids. Activation by fumarate is proposed to have physiologic importance in the parasite. The hydride transfer transition state for the NAD-malic enzyme reaction is concerted with respect to solvent isotope sensitive and hydride transfer steps. Two protons are involved in the solvent isotope sensitive step, one with a normal fractionation factor, another with an inverse fractionation factor. A structure for the transition state for hydride transfer in the NAD-malic enzyme reaction is proposed.

Cytoplasmic 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase from swine kidney was purified to specific activity of 1.2 U per mg protein, by chromatographic techniques. Native molecular weight of enzyme was estimated at 45,000. Enzyme was inhibited by sulfhydryls, diuretics, and various fatty acids. Substrate studies indicated NAD+ specificity and ability to catabolize prostaglandins, except prostaglandin B and thromboxane B. Initial velocity studies gave intersecting plots conforming to a sequential mechanism. 15-keto-prostaglandin exhibited linear noncompetitive production inhibition with respect to either prostaglandin or NAD+; NAD yielded linear competitive production inhibition with respect to NADH. Results, and those of dead-end inhibition and alternated substrate studies, are consistent with an ordered Bi-Bi mechanism: NAD+ is added first, then prostaglandin; then 15-keto-rostaglandin is released, then NADH.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les NAD(P)H déshydrogénases de type II (Ndh-II) sont des enzymes de faible poids moléculaire capables doxyder le NAD(P)H et de transférer les électrons à un groupement quinone (plastoquinone ou ubiquinone). On les appelle « de type II » par opposition aux déshydrogénases de type I qui correspondent au complexe I mitochondrial. Chez Arabidopsis thaliana, des protéines Ndh-II ont été identifiées sur les faces interne et externe de la membrane interne mitochondriale, sur la membrane des peroxysomes, et au niveau de la membrane thylacoïdale du chloroplaste. Au niveau de la chaîne de transport délectrons mitochondriale, les protéines Ndh-II constituent une voie alternative aux complexes I et II pour lapport des électrons au pool dubiquinones. Cette voie alternative permettrait une adaptation de la chaîne de transport délectrons en fonction du métabolisme de lalgue. Au niveau de la chaîne de transport délectrons chloroplastique, les protéines Ndh-II participeraient à plusieurs mécanismes dadaptation de la chaîne à la quantité et à la qualité de la lumière disponible : transitions détats, transport cyclique délectrons autour du photosystème II. Leur fonction serait de catalyser la réduction non-photochimique du pool de plastoquinones. En 2005, sept open reading frame correspondant à des NAD(P)H déshydrogénases de type II hypothétiques (NDA1 à NDA7) ont été identifiées dans le génome nucléaire de Chlamydomonas. Ces séquences étaient cependant largement incomplètes du fait de régions non séquencées dans le génome de Chlamydomonas. Les données récoltées au cours de ce travail ont permis lobtention dune version complète de la séquence codante des gènes NDA de Chlamydomonas. Ces analyses ont démontré que le gène putatif NDA4 correspondait, en fait, à des régions internes non attribuées au gène NDA2. Chez Arabidopsis thaliana et Solanum tuberosum, une corrélation entre le positionnement phylogénétique des gènes NDH-II et la localisation subcellulaire de la protéine correspondante a été mise en évidence. Lanalyse phylogénétique des séquences des protéines Nda de Chlamydomonas montre que les gènes NDA1, 2 et 3 seraient proches phylogénétiquement et seraient à positionner dans le clade des protéines Ndh-II mitochondriales des plantes supérieures. A linverse, la protéine Nda5 serait dorigine cyanobactérienne et se positionne dans le même clade que les protéines identifiées dans le chloroplaste des plantes supérieures. Les protéines Nda6 et 7 sont très proches du point de vue de la séquence, suggérant une duplication récente des gènes NDA6 et 7. Ces deux protéines se positionnent dans un nouveau clade, apparemment intermédiaire entre le domaine eucaryote et le domaine procaryote. Une étude dexpression des gènes NDA de Chlamydomonas a permis de mettre en évidence lexpression apparemment majoritaire du gène NDA2. Pour étudier la fonction spécifique de NDA2, nous avons inactivé lexpression de ce gène par RNA interférence afin détudier le phénotype des mutants obtenus. Contrairement aux prédictions in silico, il est apparu que la protéine Nda2 se localise au niveau du chloroplaste. Létude de la fluorescence chlorophyllienne de deux mutants montre que la capacité de ces mutants à réduire de manière non-photochimique le pool de plastoquinones est largement diminuée. Dautre part, les mutants sont largement affectés dans leur capacité à modifier la distribution de lénergie dexcitation entre les deux photosystèmes (transition détat) lorsque la respiration mitochondriale est inhibée. Il est connu que les transitions détat sont initiées par des changements de létat rédox du pool de plastoquinones, qui est lui-même dépendant de létat rédox de la cellule. Dans ce cadre, nous proposons que la protéine Nda2 pourrait servir de « senseur » du métabolisme cellulaire de lalgue et permettrait dadapter les flux délectrons chloroplastiques en réponse aux changements du contexte énergétique cellulaire.

Les recherches menées au sein de notre laboratoire ont montré que la Nicotinamide Phosphoribosyltransférase (Nampt) est surexprimée lors de l’activation de plusieurs cellules immunes. Cette surexpression est surprenante si l’on considère que cette enzyme intervient dans le métabolisme de base de toute cellule (immune et non immune) en participant à la synthèse du cofacteur NAD. Au cours de ce travail, nous avons essayé de comprendre quelle est la contribution de cette enzyme aux fonctions immunes. Puisque les souris génétiquement invalidées pour le gène de la Nampt meurent à un stade embryonnaire précoce nous avons invalidé ce gène de façon conditionnelle uniquement dans les lymphocytes T et B. Nos résultats suggèrent que la délétion de la Nampt dans les cellules T et B compromet leur survie. De plus, nous avons testé l’effet d’un inhibiteur spécifique de la Nampt sur la sécrétion de TNF par des macrophages et des cellules dendritiques. Nos résultats montrent que l’inhibition de la Nampt s’accompagne d’une diminution du taux de NAD intracellulaire et, parallèlement, d’une réduction de la quantité de TNF synthétisé. De même, nous avons montré qu’en augmentant le taux de NAD cellulaire il est possible d’augmenter la quantité de TNF produit, ce qui laisse supposer que la capacité de la cellule à synthétiser du TNF serait directement liée à son contenu en NAD. Cette régulation semble impliquer une étape post-transcriptionnelle puisque l’ARNm du TNF ne paraît pas être affecté par ces traitements. Puisque le taux de NAD peut influencer directement l’activité d’enzymes NAD-dépendantes, et en particulier l’activité des enzymes de la famille des sirtuines, nous nous sommes demandés si une sirtuine était impliquée dans la synthèse du TNF. Une approche pharmacologique et une approche génétique nous ont permis de montrer que SIRT6 serait capable d’augmenter la production de TNF à une étape traductionnelle. Cette conclusion semble être confirmée par le fait que des cellules dendritiques dérivées de souris invalidées pour le gène SIRT6 produisent moins de TNF en réponse à un stimulus microbien par rapport à des cellules sauvages. En conclusion nos observations suggèrent la Nampt, en affectant le niveau intracellulaire de NAD, joue un rôle important dans le contrôle de la production du TNF par les cellules de système immunitaire

Thesis (M.S.)--Rutgers University, 2009. / "Graduate Program in Microbiology and Molecular Genetics." Includes bibliographical references (p. 49-53).

Thesis (Ph. D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from PDF title page (viewed Feb. 4, 2010). Additional advisors: Subramaniam Ananthan, David E. Graves, Craig D. Smith, Sadanandan E. Velu. Includes bibliographical references.