La présente étude évalue la capacité de EPA:DHA 6:1, une formulation d’omega-3 capable d’induire la formation continue de monoxyde d’azote par la NO synthase endothéliale, à prévenir l’hypertension et la dysfonction endothéliale induites par l’angiotensine II (Ang II) chez le rat. L’hypertension induite par l’Ang II est associée à une dysfonction endothéliale caractérisée par une altération des composantes de la relaxation et une augmentation des réponses contractiles dépendantes de l’endothélium. L’Ang II augmente le stress oxydant vasculaire et l’expression de NADPH oxydase, COXs, eNOS, et AT1R, alors que SKCa et connexin 37 sont sous-exprimés. EPA:DHA 6:1 prévient l’hypertension, la dysfonction endothéliale et la surexpression des protéines cibles. En conclusion, la consommation chronique de EPA:DHA 6:1 prévient l’hypertension et la dysfonction endothéliale induites par l’Ang II chez le rat, probablement en prévenant le stress oxydant dû à la NADPH oxydase et aux cyclooxygénases. / EPA:DHA 6:1 has been shown to be a superior omega-3 formulation inducing a sustained endothelial NO synthase-derived formation of nitric oxide. This study examined whether chronic intake of EPA:DHA 6:1 prevents hypertension and endothelial dysfunction induced by angiotensin II (Ang II) in rats. Ang II-induced hypertension was associated with endothelial dysfunction characterized by blunted components of relaxation and increased endothelium-dependent contractile responses. Ang II increased the vascular oxidative stress, and the expression of NADPH oxidase subunits, COXs, eNOS, and AT1R whereas SKCa and connexin 37 were down-regulated. Intake of EPA:DHA 6:1 prevented the Ang II-induced hypertension and endothelial dysfunction, and improved expression of target proteins. In conclusion, chronic intake of EPA:DHA 6:1 prevented the Ang II induced hypertension and endothelial dysfunction in rats, most likely by preventing NADPH oxidase and cyclooxygenase-derived oxidative stress.

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De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN. / It is well accepted that renin-angiotensin system (RAS) activation plays an important role in the development of hypertension and diabetic nephropathy (DN). With the discovery of angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) and recognition of MAS as the receptor of Angiotensin 1-7 (Ang 1-7), new players in RAS, ACE2/Ang 1-7/MAS axis, have been identified to counteract the effect of ACE/Ang II/ AT1 axis. Evidence implicates the intrarenal RAS’s contribution to DN. Previous studies from our laboratory using transgenic mice overexpressing rat Angiotensinogen (Agt) in their renal proximal tubular cells (RPTCs) have demonstrated the importance of the intrarenal RAS in renal damage and the induction of hypertension. We also recently observed that renal ACE2 expression and urinary Ang 1–7 were lower in type 1 diabetic Akita mice and that treatment with RAS blockers normalized ACE2 expression and prevented hypertension development in these Akita mice. In the diabetic milieu, both glycemia and angiotensin II (Ang II) can induce reactive oxygen species (ROS) generation, which contributes to kidney injury. To explore the relationship among ROS, ACE2 and DN, we created Akita transgenic mice overexpressing catalase (Cat) in RPTCs by crossbreeding type I diabetic Akita mice with our established transgenic mice overexpressing rat Cat in RPTCs. In another study, Akita mice were treated with Ang 1-7 or combination of Ang 1-7 and its antagonist, A779, to investigate the relations between Ang 1-7 action, systolic hypertension (sHTN), oxidative stress, kidney injury, ACE2 and Mas receptor expression. Our results showed that overexpression of Cat attenuated renal oxidative stress; prevented hypertension; ameliorated glomerular filtration rate, albuminuria, kidney hypertrophy, tubulointerstitial fibrosis, and tubular apoptosis; and suppressed profibrotic and proapoptotic gene expression in RPTCs of Akita Cat-Tg mice compared with Akita mice. Furthermore, overexpression of Cat in RPTCs of Akita mice normalized renal ACE2 expression and urinary Ang 1–7 levels. On the other hand, Ang 1-7 administration prevented systemic hypertension, normalized urinary albumin/creatinine ratio and attenuated glomerular hyperfiltration without affecting blood glucose levels in Akita mice. Furthermore, Ang 1-7 treatment also attenuated oxidative stress and the expression of NADPH oxidase 4, Agt, ACE, transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and collagen IV, and increased the expression of ACE2 and Mas receptor in Akita mouse kidneys. These effects were reversed by co-administration of A779. These data demonstrated that Cat overexpression prevents hypertension and progression of nephropathy and highlight the importance of intrarenal oxidative stress and ACE2 expression contributing to hypertension and renal injury in diabetes. Furthermore, our data suggest that Ang 1-7 plays a protective role in hypertension and RPTC injury in diabetes, predominantly through decreasing renal oxidative stress-mediated signaling and normalizing ACE2 and Mas receptor expression. Our results also indicate Ang 1-7 as a potential therapeutic agent for treatment of systemic hypertension and kidney injury in diabetes. Therefore, Ang 1-7 mediates the major protective role of ACE2 in the hypertension and DN.

Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind trotz erheblicher Fortschritte in Diagnostik und Therapie noch immer die häufigste Todesursache in Deutschland. Neben bekannte Risikofaktoren wie Hypercholesterinämie, Hyperlipoproteinämie, Diabetes mellitus, Adipositas, Bewegungsmangel, Stress und hohem Alter wird eine pathophysiologisch erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Ursache für deren Entstehung diskutiert. NAD(P)H-Oxidasen, von denen 7 Isoformen der katalytischen Nox-Untereinheiten bekannt sind, stellen dabei die Hauptquelle für vaskuläre Superoxidanionen und oxidativen Stress dar. In dieser Arbeit konnte die vorrangige Bedeutung eines intrazellulär lokalisierten Nox4-haltigen NAD(P)H-Oxidase-Komplexes für die konstitutive Radikalbildung in primären humanen Endothelzellen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch chronische Applikation der biomechanischen Kräfte Schubspannung und Dehnung oxidativer Stress in humanen Endothelzellen in vitro vermindert werden kann. Die Herabregulation der Superoxidanionen-Bildung sowie die vermehrte Freisetzung von NO durch chronische Applikation biomechanischer Kräfte trägt zur positiven Balance von NO/Superoxidanionen und zum vasoprotektiven Potential physiologischer Schubspannung bzw. Dehnung bei. Durch Nox4-Promotordeletionsanalysen und Mutationsstudien konnte der Transkriptionsfaktor AP-1 als entscheidend für die schubspannungsabhängige Herabregulation von Nox4 identifiziert werden. Durch Stimulation von Endothelzellen bzw. murinen Gefäßringen mit oxidiertem LDL konnte dagegen die vaskuläre ROS-Bildung in vitro und ex vivo induziert werden. Zur weiteren Aufklärung des Mechanismus der LDL-induzierten ROS-Bildung in vivo und des Einflusses von NAD(P)H-Oxidasen wurden C57BL/6 (Wildtyp)- und Nox2-/--Mäuse 10 Wochen lang mit einer fettreichen Diät (Western diet) gefüttert und anschließend der Einfluss dieser Fütterung auf die NAD(P)H-Oxidase-Expression und ROS-Bildung analysiert. In der Aorta thoracalis beider Mausstämme zeigte sich durch das fettreiche Futter ein signifikanter Anstieg der NAD(P)H-Oxidase-Aktivität im Vergleich zum Standardfutter. Durch Western diet-Fütterung wurde die Nox4-mRNA-Expression in der A. thoracalis von Nox2-/--Mäuse und die p22phox-mRNA-Expression in beiden Mausstämmen induziert. Die Analyse weiterer Organe (Herz, Niere) zeigte keine Induktion von NAD(P)H-Oxidase-Untereinheiten durch Western diet-Fütterung. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für eine entscheidende Rolle der Nox4-haltigen NAD(P)H-Oxidase bei der vaskulären Radikalbildung in vitro und in vivo. / Cardiovascular diseases are the most common causes of death in Germany. Beside the known risk factors hypercholesteremia, hyperlipoproteinemia, diabetes mellitus, obesity, sedentary lifestyle, stress and high age, a pathophysiologically increased formation of reactive oxygen species (ROS) are discussed as cause of development of cardiovascular diseases. Nicotine adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase complexes have been identified as main source of oxidative stress and vascular superoxide anions. There are 7 known isoforms of the catalytic Nox subunit of the NADPH oxidase. In this dissertation it was shown that NADPH oxidase subunit Nox4 is the major Nox isoform in human endothelial cells. Nox4 could be localized in the perinuclear space. Overexpression of Nox4 enhanced endothelial superoxide anion formation. Furthermore, a reduction of oxidative stress could be demonstrated by chronic application of the biomechanical forces laminar shear stress and cyclic strain in endothelial cells in vitro. The observed downregulation of superoxide anion formation and upregulation of NO formation by application of biomechanical forces contribute to the positive balance between NO and superoxide anion and the vasoprotective potential of physiological shear stress and cyclic strain. Molecular cloning and functional analysis of the human Nox4 promoter revealed that an AP-1 binding site is essential for downregulation of Nox4 by laminar shear stress. On the other hand stimulation of endothelial cells and murine vessels with oxidized lipids caused an upregulation of vascular ROS production in vitro and ex vivo. In order to examine the mechanism of LDL induced ROS formation and the influence of NADPH oxidase, C57BL/6 (wild-type) and Nox2-/- mice were feed with a diet high in fat and sugar (Western-type diet) for 10 weeks. After feeding, the influence of diet on the expression of NADPH oxidase and ROS production was analyzed in the A. thoracalis. Both mice strains showed a significant upregulation of aortic ROS production in comparison to normal chow. The mRNA expression of aortic Nox4 was induced in Nox2-/- mice. Furthermore, the aortic p22phox mRNA expression was upregulated in both mice strains. The analysis of other organs (heart, kidney) showed no influence of the Western-type diet. In conclusion, the results demonstrate a major role of a Nox4 containing NADPH oxidase in the vascular radical formation in vitro and in vivo.

Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind trotz erheblicher Fortschritte in Diagnostik und Therapie noch immer die häufigste Todesursache in Deutschland. Neben bekannte Risikofaktoren wie Hypercholesterinämie, Hyperlipoproteinämie, Diabetes mellitus, Adipositas, Bewegungsmangel, Stress und hohem Alter wird eine pathophysiologisch erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Ursache für deren Entstehung diskutiert. NAD(P)H-Oxidasen, von denen 7 Isoformen der katalytischen Nox-Untereinheiten bekannt sind, stellen dabei die Hauptquelle für vaskuläre Superoxidanionen und oxidativen Stress dar. In dieser Arbeit konnte die vorrangige Bedeutung eines intrazellulär lokalisierten Nox4-haltigen NAD(P)H-Oxidase-Komplexes für die konstitutive Radikalbildung in primären humanen Endothelzellen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch chronische Applikation der biomechanischen Kräfte Schubspannung und Dehnung oxidativer Stress in humanen Endothelzellen in vitro vermindert werden kann. Die Herabregulation der Superoxidanionen-Bildung sowie die vermehrte Freisetzung von NO durch chronische Applikation biomechanischer Kräfte trägt zur positiven Balance von NO/Superoxidanionen und zum vasoprotektiven Potential physiologischer Schubspannung bzw. Dehnung bei. Durch Nox4-Promotordeletionsanalysen und Mutationsstudien konnte der Transkriptionsfaktor AP-1 als entscheidend für die schubspannungsabhängige Herabregulation von Nox4 identifiziert werden. Durch Stimulation von Endothelzellen bzw. murinen Gefäßringen mit oxidiertem LDL konnte dagegen die vaskuläre ROS-Bildung in vitro und ex vivo induziert werden. Zur weiteren Aufklärung des Mechanismus der LDL-induzierten ROS-Bildung in vivo und des Einflusses von NAD(P)H-Oxidasen wurden C57BL/6 (Wildtyp)- und Nox2-/--Mäuse 10 Wochen lang mit einer fettreichen Diät (Western diet) gefüttert und anschließend der Einfluss dieser Fütterung auf die NAD(P)H-Oxidase-Expression und ROS-Bildung analysiert. In der Aorta thoracalis beider Mausstämme zeigte sich durch das fettreiche Futter ein signifikanter Anstieg der NAD(P)H-Oxidase-Aktivität im Vergleich zum Standardfutter. Durch Western diet-Fütterung wurde die Nox4-mRNA-Expression in der A. thoracalis von Nox2-/--Mäuse und die p22phox-mRNA-Expression in beiden Mausstämmen induziert. Die Analyse weiterer Organe (Herz, Niere) zeigte keine Induktion von NAD(P)H-Oxidase-Untereinheiten durch Western diet-Fütterung. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für eine entscheidende Rolle der Nox4-haltigen NAD(P)H-Oxidase bei der vaskulären Radikalbildung in vitro und in vivo. / Cardiovascular diseases are the most common causes of death in Germany. Beside the known risk factors hypercholesteremia, hyperlipoproteinemia, diabetes mellitus, obesity, sedentary lifestyle, stress and high age, a pathophysiologically increased formation of reactive oxygen species (ROS) are discussed as cause of development of cardiovascular diseases. Nicotine adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase complexes have been identified as main source of oxidative stress and vascular superoxide anions. There are 7 known isoforms of the catalytic Nox subunit of the NADPH oxidase. In this dissertation it was shown that NADPH oxidase subunit Nox4 is the major Nox isoform in human endothelial cells. Nox4 could be localized in the perinuclear space. Overexpression of Nox4 enhanced endothelial superoxide anion formation. Furthermore, a reduction of oxidative stress could be demonstrated by chronic application of the biomechanical forces laminar shear stress and cyclic strain in endothelial cells in vitro. The observed downregulation of superoxide anion formation and upregulation of NO formation by application of biomechanical forces contribute to the positive balance between NO and superoxide anion and the vasoprotective potential of physiological shear stress and cyclic strain. Molecular cloning and functional analysis of the human Nox4 promoter revealed that an AP-1 binding site is essential for downregulation of Nox4 by laminar shear stress. On the other hand stimulation of endothelial cells and murine vessels with oxidized lipids caused an upregulation of vascular ROS production in vitro and ex vivo. In order to examine the mechanism of LDL induced ROS formation and the influence of NADPH oxidase, C57BL/6 (wild-type) and Nox2-/- mice were feed with a diet high in fat and sugar (Western-type diet) for 10 weeks. After feeding, the influence of diet on the expression of NADPH oxidase and ROS production was analyzed in the A. thoracalis. Both mice strains showed a significant upregulation of aortic ROS production in comparison to normal chow. The mRNA expression of aortic Nox4 was induced in Nox2-/- mice. Furthermore, the aortic p22phox mRNA expression was upregulated in both mice strains. The analysis of other organs (heart, kidney) showed no influence of the Western-type diet. In conclusion, the results demonstrate a major role of a Nox4 containing NADPH oxidase in the vascular radical formation in vitro and in vivo.