O RAGE é um receptor transmembrana, imunoglobulina-like que existe em múltiplas isoformas e interage com um amplo repertório de ligantes extracelulares. O RAGE é expresso em níveis baixos na maioria das células, porém o aumento da presença de seus ligantes no domínio extracelular faz com que o RAGE inicie uma cascata de sinalização intracelular complexa, resultando em estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição NF-B, aumento da expressão de citocinas, além da indução de sua própria expressão. O envolvimento do RAGE neste amplo espectro de sinalização vincula este receptor a diversas condições patológicas. Nesta tese utilizamos 3 modelos experimentais que induzem inflamação sistêmica (Leishmania amazonensis, Lipopolissacarídeo e sepse) e 1 modelo experimental que mimetiza a denervação neuronal (modelos experimentais in vivo). Além disso utilizamos diferentes abordagens de bloqueio do RAGE a fim de elucidar a função deste receptor. Com base em nossos resultados os modelos experimentais foram eficientes em induzir o aumento do RAGE e sua sinalização no sistema nervoso central, desencadeando a síntese e liberação de moléculas pró-inflamatórias e o aumento do estresse oxidativo, culminando em neuroinflamação e neurodegeneração. As intervenções de bloqueio do RAGE foram eficientes em inibir as vias de sinalização intracelular mediadas pelo receptor, comprovando a via de ação. Levando em conta nossos principais resultados concluímos que: a) RAGE atua como mediador da perda neuronal em resposta ao insulto inflamatório em diversas estruturas do SNC, b) está presente no corpo dos neurônios dopaminérgicos e envolvido na morte destes neurônios; c) o aumento do RAGE é tempo-dependente e a morte dos neurônios está vinculada a ação deste receptor. / RAGE is a transmembrane, immunoglobulin-like receptor that exists in multiple isoforms and interacts with a broad repertoire of extracellular ligands. RAGE is expressed at low levels in most cells, but the increased presence of its ligands initiates a complex intracellular signaling cascade resulting in oxidative stress, activation of transcription factor NF-B, increased expression of cytokines in addition to concomitant upregulation of RAGE itself. In this thesis we used 3 experimental models which induce systemic inflammation (Leishmania amazonensis, Lipopolysaccharide and sepsis) and 1 experimental model that mimics neuronal denervation (experimental models in vivo). In addition, different approaches to block RAGE were used to elucidate the function of this receptor. Based on our results the experimental models were efficient in inducing the increase of RAGE and its signaling in the central nervous system, triggering the synthesis and release of proinflammatory molecules and the increase of oxidative stress, culminating in neuroinflammation and neurodegeneration. The RAGE blocking interventions were effective in inhibiting receptor-mediated signaling, proving the signaling pathway. Considering our main results, we conclude that: a) RAGE acts as a mediator of neuronal loss triggered by inflammatory insults in various CNS structures; b) RAGE is present in the body of dopaminergic neurons and is involved in the death of these neurons; c) the increase of RAGE is time-dependent, and the neuronal death is dependent on the action of this receptor.

Positron emission tomography (PET) is a non-invasive medical imaging technique that allows visualisation and quantification of biochemical, physiological and pharmacological processes in living subjects. This is achieved through application of radiotracers – compounds labelled with positron emitting radionuclides. Neurodegeneration is the progressive loss of neurons resulting in impairment of brain function leading to cognitive decline and can affect movement. The underlying pathology of many neurodegenerative diseases is misfolding of proteins such as α-synuclein, the key pathological hallmark of Parkinson’s disease. Also implicated in the processes of neurodegeneration is neuroinflammation, which is observed by the activation of microglia – the immune cells of the brain. Activation of microglia is associated with the upregulation of the 18 kDa mitochondrial translocator protein (TSPO). This work has involved the synthesis and characterisation of novel compounds that have the potential for being applied as radiotracers for imaging α-synuclein fibrils (project 1), or TSPO (project 2) via PET. Over the course of project 1 a library of compounds was synthesised based upon structural modifications of a lead structure identified from the literature. These compounds then underwent screening via biophysical methodologies in order to determine their affinity to α-synuclein fibrils. This stage of the work involved the development of a novel biophysical technique – microscale thermophoresis (MST). A general automated radiosynthetic method to afford the [18F]fluoro-derivatives of these compounds has also been developed, and preliminary in vitro autoradiography studies and an in vivo microPET scan has been performed. For project 2, an automated radiosynthetic method was developed to produce [18F]GE387, a lead compound identified through collaboration with GE Healthcare. This radiotracer has then been applied to preliminary in vitro autoradiography and an in vivo microPET study using rats with induced neuroinflammation alongside control rats.

Orientador: Prof. Dr. Daniel Carneiro Carrettiero / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2017. / A doença de Alzheimer (DA), a mais comum dentre as doenças neurodegenerativas, é caracterizada por intenso declínio cognitivo e pela presença de dois marcadores histopatológicos: as placas de proteína beta amiloide e os emaranhados neurofibrilares de proteína Tau hiperfosforilada. Além dos déficits cognitivos, pacientes com DA também apresentam alterações comportamentais e autonômicas, como prejuízo das interações sociais e alterações na termorregulação, respectivamente. Alterações termorregulatórias são bastante relatadas em idosos e estudos mostram que alterações como a redução da temperatura corporal estão entre os fatores de risco que levam ao aumento da fosforilação de Tau e à formação de emaranhados neurofibrilares, podendo contribuir para o desenvolvimento da forma esporádica da DA ¿ a mais prevalente e objeto desse estudo. Em vista disso, nosso objetivo foi explorar o perfil termorregulatório e a interação social em um modelo animal para a DA esporádica, induzido por injeções intracerebroventriculares de estreptozotocina (STZ). Nossos resultados revelam que os animais tratados com STZ demonstram, além de déficits na memória espacial, redução na interação social, mimetizando um sintoma apresentado por pacientes com a DA ¿ a apatia - e, devido a isso, fortalecendo o modelo animal escolhido para esse estudo. Ademais, esses animais demonstram elevação da temperatura corporal, verificado logo no sexto dia após a injeção da droga, e alteração na preferência térmica, caracterizada pela fuga de temperaturas frias. Esses resultados nos possibilitam sugerir a presença de um mecanismo termorregulatório protetor que, de maneira comportamental e autonômica, permite ao animal evitar uma possível hipotermia, que levaria ao aumento nos níveis de Tau hiperfosforilada. / Alzheimer's disease (AD), the most common among the neurodegenerative disorders, is characterized by intense cognitive decline and the presence of two histopathological hallmarks: the plaques of beta-amyloid protein and the neurofibrillary tangles of hyperphosphorylated Tau protein. Besides the cognitive deficits, AD patients also present behavioral and autonomic alterations, as impairment of social interactions and changes in thermoregulation, respectively. Thermoregulatory alterations are densely reported in elderly and studies show that changes like the reduction in core body temperature are among the risk factors that lead to increase in Tau phosphorylation and neurofibrillary tangles formation, contributing to the development of sporadic form of AD the most prevalent and our object of study. Thus, our aim was to explore the thermoregulatory profile and the social interaction in an animal model for sporadic AD, induced by intracerebroventricular injections of streptozotocin (STZ). Our results reveal that animals treated with STZ demonstrate, besides deficits in spatial memory, reduction in social interaction, mimetizing a symptom presented by AD patients the apathy and, due to this, strenghthening the animal model chosen for this study. In addition, these animals demonstrate increased core body temperature, verified right after the sixth day after STZ injection, and altered thermal preference, characterized by cold-avoidance. These results allow us to suggest the presence of a protector thermoregulatory mechanism that, in a behavioral and autonomic way, enable the animal to avoid a possible hypothermia, which could lead to na increase in hyperphosphorylated Tau levels.

Basic science and early clinical trial evidence suggest the safe diuretic drug amiloride, may exert a neuroprotective effect in multiple sclerosis (MS) through blockade of the acid sensing ion channel. Neuroprotective treatments are a key unmet need in multiple sclerosis. Optic neuritis (ON) is a discrete CNS inflammatory event leading to neuro-axonal injury in the optic nerve and retina. The optic nerve is part of the visual system, one of the most functionally and structurally eloquent systems in the central nervous system, which affords a number of unique modalities to assess neurodegeneration and neuroprotection. The visual system can be classified into two parts, the anterior and posterior visual systems, which are defined by the lateral geniculate nucleus, where the two components synapse. The extent of neurodegeneration following ON in the anterior visual system can be imaged in vivo through scanning laser polarimetry (GDx) and optical coherence tomography (OCT). The posterior visual system can be imaged by quantitative and functional magnetic resonance imaging (MRI) of the brain, giving insights into white matter structural integrity and cortical plasticity over time. Combining these modalities in a longitudinal study, allows assessment of the impact of neurodegeneration in the anterior visual system on neurodegeneration downstream in the posterior visual system and on changes in functional connectivity over time in the visual cortex. Furthermore, in the clinical trial setting the neuroprotective effect of any intervention both on direct anterior neurodegeneration and downstream processes can be assessed. The functional relevance of changes in all of these biomarkers can be tested through a number of visual measures, including low contrast visual acuity. In MS, the contribution of transsynaptic neurodegeneration to the global neuronal loss experienced by patients is an area of incomplete understanding. In addition, the role of the visual cortex, through neuroplasticity, in aiding visual recovery from optic neuritis, is unclear. To address these issues, this thesis reports the results of the first clinical trial of amiloride in ON, and shows that despite the pre- and early clinical evidence of neuroprotection of amiloride, no neuroprotective benefit was found. It goes on to explore reasons for this lack of effect including the finding of early retinal neurodegeneration in ON, and the need for early recruitment windows in the future. From there, it makes a detailed assessment of the longitudinal changes in retinal OCT for 12 months following ON, including a novel finding of the temporal evolution of inner nuclear layer swelling, previously reported only cross-sectionally. Next, for the first time macular retinal neurodegeneration is shown to influence diffusion tensor MRI derived measures of white matter integrity in the optic radiations, indicating transsynaptic neurodegeneration. Finally, longitudinal changes in resting state functional connectivity following ON are found in the visual system for the first time. The interaction between this cortical functional, retinal neurodegeneration and visual recovery is probed.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Alzheimer's Disease (AD) is the most important cause of dementia in the world.The involvement of the immune system in the pathogenic process has been shown by several studies including the description of autoantibodies (AAc) directed to targets in the central nervous system.It is not possible yet to further define what their exact involvement in AD is. In this study, using the methodology of Phage Display we sought to identify AAc specific to patients with the disease and to characterize their antigens using bioinformatics tools. We selected 10 patients with AD according to DSM-IV-TR and NINCDS ASRDA criteria and 10 healthy controls matched for age and sex.Using a library of peptides displayed on M13 phages, we performed biopanning, thus selecting 10 peptides recognized by IgG in sera from patients with AD. The probable epitopes were characterized and their involvement with AD was assessed in the literature.We found alignment with Neurexin 3β, PLK4, Neuroserpin, DNAJ, Mint-1/X11, units of the nicotinic acetylcholine receptor, Trombospondin-1, TRAF6, ACE, GDNF α3 receptor, PRUNE2 and CD44. The Phage display technology, combined with bioinformatics tools, has proven to be an interesting research methodology of AAb present in the serum of patients with AD and may provide new insights into disease mechanisms and therapeutic targets. / A Doença de Alzheimer (DA) é a causa mais importante de demência no mundo. O envolvimento do sistema imunológico no processo patogênico tem sido demonstrado em diversos estudos inclusive com a descrição de autoanticorpos (AAcs) presentes no soro dirigidos a alvos no sistema nervoso central. Não é possível definir ainda qual a sua participação exata na DA. Neste estudo, utilizando a metodologia do Phage Display procuramos identificar AAcs específicos de pacientes com a doença e caracterizar seus antígenos utilizando ferramentas de bioinformática. Foram selecionados 10 pacientes com DA segundo os critérios do DSM-IV TR e NINCDS-ASRDA e 10 controles saudáveis pareados por sexo e idade. Utilizando uma biblioteca de peptídeos expostos em fagos M13, foi realizado biopanning selecionando 10 peptídeos reconhecidos por IgGs no soro de pacientes com DA. Os prováveis epítopos foram caracterizados e seu envolvimento com a DA foi avaliado na literatura. Foram encontrados alinhamentos com a Neurexina 3β, PLK4, Neuroserpina, vários membros da família DNAJ, Mint-1/X11, Gene 2 de susceptibilidade para o Autismo, unidades α2, α3, α4 e α6 do receptor nicotínico da acetilcolina, Trombospondina-1, TRAF6, ECA, receptor α 3 do GDNF, PRUNE2 e CD44. A tecnologia de Phage Display, aliada a ferramentas de bioinformática, demonstrou ser interessante metodologia de investigação de AAcs presentes no soro de pacientes com DA podendo fornecer novas pistas sobre mecanismos da doença e alvos terapêuticos. / Mestre em Ciências da Saúde

O RAGE é um receptor transmembrana, imunoglobulina-like que existe em múltiplas isoformas e interage com um amplo repertório de ligantes extracelulares. O RAGE é expresso em níveis baixos na maioria das células, porém o aumento da presença de seus ligantes no domínio extracelular faz com que o RAGE inicie uma cascata de sinalização intracelular complexa, resultando em estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição NF-B, aumento da expressão de citocinas, além da indução de sua própria expressão. O envolvimento do RAGE neste amplo espectro de sinalização vincula este receptor a diversas condições patológicas. Nesta tese utilizamos 3 modelos experimentais que induzem inflamação sistêmica (Leishmania amazonensis, Lipopolissacarídeo e sepse) e 1 modelo experimental que mimetiza a denervação neuronal (modelos experimentais in vivo). Além disso utilizamos diferentes abordagens de bloqueio do RAGE a fim de elucidar a função deste receptor. Com base em nossos resultados os modelos experimentais foram eficientes em induzir o aumento do RAGE e sua sinalização no sistema nervoso central, desencadeando a síntese e liberação de moléculas pró-inflamatórias e o aumento do estresse oxidativo, culminando em neuroinflamação e neurodegeneração. As intervenções de bloqueio do RAGE foram eficientes em inibir as vias de sinalização intracelular mediadas pelo receptor, comprovando a via de ação. Levando em conta nossos principais resultados concluímos que: a) RAGE atua como mediador da perda neuronal em resposta ao insulto inflamatório em diversas estruturas do SNC, b) está presente no corpo dos neurônios dopaminérgicos e envolvido na morte destes neurônios; c) o aumento do RAGE é tempo-dependente e a morte dos neurônios está vinculada a ação deste receptor. / RAGE is a transmembrane, immunoglobulin-like receptor that exists in multiple isoforms and interacts with a broad repertoire of extracellular ligands. RAGE is expressed at low levels in most cells, but the increased presence of its ligands initiates a complex intracellular signaling cascade resulting in oxidative stress, activation of transcription factor NF-B, increased expression of cytokines in addition to concomitant upregulation of RAGE itself. In this thesis we used 3 experimental models which induce systemic inflammation (Leishmania amazonensis, Lipopolysaccharide and sepsis) and 1 experimental model that mimics neuronal denervation (experimental models in vivo). In addition, different approaches to block RAGE were used to elucidate the function of this receptor. Based on our results the experimental models were efficient in inducing the increase of RAGE and its signaling in the central nervous system, triggering the synthesis and release of proinflammatory molecules and the increase of oxidative stress, culminating in neuroinflammation and neurodegeneration. The RAGE blocking interventions were effective in inhibiting receptor-mediated signaling, proving the signaling pathway. Considering our main results, we conclude that: a) RAGE acts as a mediator of neuronal loss triggered by inflammatory insults in various CNS structures; b) RAGE is present in the body of dopaminergic neurons and is involved in the death of these neurons; c) the increase of RAGE is time-dependent, and the neuronal death is dependent on the action of this receptor.

O sistema colinérgico está sabidamente envolvido com processos cognitivos. Em trabalho recente mostramos que a infusão do peptídeo A promoveu neurodegeneração e redução da memória de ratos. O treino semanal dos animais em equipamento de esquiva ativa recuperou o desempenho na tarefa e aumentou a densidade de receptores nicotínicos α7 em áreas relacionadas à memória. No presente trabalho, o antagonismo de α7 com metilicaconitina (MLA), em camundongos, promoveu perda cognitiva, porém a recuperação com o treino foi parcial. A infusão conjunta de βA e MLA causou perda da memória, mas essa não foi revertida com o treino semanal. Os animais com MLA apresentaram aumento da atividade da acetilcolinesterase (AChE) e aumento de BDNF, que poderia ser relacionado à resiliência a injúrias. Porém, animais com A e MLA apresentaram aumento da atividade da AChE e redução de BDNF, sugerindo perda dos mecanismos de neuroproteção deflagrados por α7. Com isso, sugere-se que α7 tenha um papel determinante na recuperação da memória e resiliência tecidual, frente à neurodegeneração. / Cholinergic system plays an important role in cognitive processes. In a recent work we showed that infusion of Aβ promoted neurodegeneration and reduction of memory of rats. Week training of animals in active avoidance shuttle box recovered their performance and increased the density of α7 nicotinic receptors in brain areas related to memory. In the present work, infusion of the α7 antagonist methyllycaconitine (MLA), in mice, caused cognitive impairment, but memory recover with week training was partial. Infusion of βA together with MLA promoted memory loss, but this was not recovered with the week training. MLA infused mice presented increase in acetylcholinesterase (AChE) activity and increase in BDNF, which could be related to resilience to tissue injuries. However, animals infused with βA and MLA showed increase in AChE activity and reduction of BDNF, suggesting loss of neuroprotection mechanisms triggered by α7. It is suggested that α7 has a determinant role in memory recover and brain resilience, in neurodegenerative processes.

A conversão da proteína príon celular (PrPc) em sua isoforma anormal PrPsc está associada a uma série de doenças neurodegenerativas, genericamente designadas por doenças priônicas. Embora a literatura tenha enfatizado o estudo do PrPsc e o mecanismo de propagação das doenças de príon, pouco tem sido feito para o entendimento do papel fisiológico do PrPc. Em 1997 nosso grupo descreveu um receptor/ligante para o PrPc utilizando o princípio da hidropaticidade complementar. Neste trabalho isolamos e identificamos este ligante de PrPc como sendo a STI-1 (Stress Inducible Protein-1). In vitro, a STI-1interage com o PrPc de maneira específica, saturável e com alta afinidade (Kd=8x10-8M). Paralelamente, mostramos que o PrPc se liga ao domínio RNIAEIIKDI da laminina (Ln) (Kd=2x10-8M). O bloqueio de PrPc na superfície de neurônios hipocampais de embriões de ratos e camundongos, reduziu a neuritogênese induzida por Ln. Além disso, neurônios provenientes de animais PrP -/- são incapazes de estender neuritos sobre o peptídeo RNIAEIIKDI, sugerindo que o PrPc é o único receptor celular para este domínio da Ln. Estes dados indicam que a interação PrPc-Ln seja relevante nos fenômenos de adesão e diferenciação neuronais. A caracterização das interações PrPc-Ln e PrPc-STI-1 representa contribuições importantes para a elucidação do papel biológico do PrPc. / Conversion of the cellular prion protein (PrPc) to its abnormal isoform PrPsc is associated with some neurodegenerative and fatal diseases called prion diseases. Although the literature has been emphasizing the mechanism of PrPsc conversion and illness propagation, little attention has been given to the PrPc physiological role. In 1997, our group described a PrPc receptor/ligand based on the complementary hydropathy theory. Herein, we identify the PrPc receptor/ligand as STI-1, the Stress Inducible Protein-1. In vitro studies showed that STI-1 is a specific, saturable and high affinity ligand for PrPc (Kd=8x10-8M). In parallel, we demonstrated that PrPc interacts with RNIAEIIKDI domain of laminin (Ln) (Kd=2x10-8M). The blockage of PrPc, both from embryonic rats and mice hippocampal neuros, inhibited Ln-induced neurite outgrowth. In addition, neurons from PrPc null mice are unable to extend neurites on RNIAEIIKDI, suggesting that PrPc is the unique cellular receptor for this Ln domain. These data indicate that PrPc-Ln interaction is relevant for neuronal adhesion and differentiation. The characterization of PrPc-Ln and PrPc-STl-1 interactions represents important contributions for the elucidation of the PrPc physiological role.

O funcionamento pleno e harmônico de uma célula está intimamente associado à sua capacidade de manter a integridade genômica. Diversos agentes químicos e físicos exógenos, bem como produtos do próprio metabolismo celular, podem interagir com o DNA, causando danos a esta molécula. Em respota a esses eventos, um intrincado mecanismo de resposta a danos ao DNA é ativado, podendo culminar tanto na correção das lesões, como na ativação de programas de morte celular, como a apoptose, sempre com o intuito de preservar a homeostase tecidual. Falhas neste mecanismo estão associadas a um aumento nas taxas de mutação, que apesar de constituírem a base da diversidade genética e evolução das espécies, está intimimamente associado à tumorigênese e ao envelhecimento. Neste trabalho, dividido em duas partes, utilizamos células de glioma humano como modelo de estudo para quimioterapia adjuvante, bem como também utilizamos neurônios humanos obtidos à partir de células-tronco pluripotente-induzidas como modelo de estudo para a neurodegeneração característica da síndrome de Cockayne, uma doença genética na qual os pacientes apresentam deficiências em mecanismos de reparo de DNA, bem como envelhecimento precoce. Na primeira etapa, avaliamos a resposta de células de glioma a cloroquina, um promissor adjuvante no tratamento desta enfermidade, e notamos que a resistência das células a esta droga estava intimamente relacionada ao seu potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser desfeito por meio da inibição da quinase ATR. Apesar da função canônica desta proteína se dar através da regência da resposta a danos ao DNA, notamos que a sua participação como agente promotor de resistência à cloroquina se dava independentemente deste mecanismo. Também notamos que a combinação da cloroquina com a inibição de ATR via silenciamento gênico exercia um potente efeito tóxico sobre as células tumorais tratadas com o quimioterápico Temozolomida. Já na etapa final desta tese, através do emprego da reprogramação celular, obtivemos, pela primeira vez, neurônios humanos de pacientes portadores da síndrome de Cockayne a partir de fibroblastos de pele. Com este modelo de estudo, foi possível observar que esses neurônios apresentavam uma reduzida densidade de puncta sináptica, bem como uma aparente deficiência na sincronia de suas atividades. Por fim, por meio do sequenciamento do RNA destes neurônios, identificamos uma desregulação na expressão de diversas vias relacionadas ao funcionamento e comunicação neural. As implicações para o uso da cloroquina como adjuvante no tratamento de gliomas, bem como as vantagens do uso de neurônios humanos de Cockayne em detrimento aos modelos atualmente disponíveis, também são discutidos. / Genome integrity is constantly threatened by chemical and physical exogenous agents, as well as products of cells own metabolism, and capability of cells to overcome these challenges is essential to achieve homeostasis. In response to DNA lesions, cells activate a dynamic and intricate DNA damage response that ultimately results either in lesion resolution, or in cell death through apoptosis. Regardless the fate chosen, tissue homeostasis is the ultimate goal. Flaws in this mechanism are associated to an increase in mutation rates. Although it constitutes the basis of genetic diversity and evolution, it is also strictly associated to tumorigenesis and aging. In this thesis, separated in two chapters, we used human glioma cells as a model to study adjuvant chemotherapy, and induced pluripotent stem cells-derived human neurons as a model to study neurodegeneration in Cockayne syndrome, a genetic disease in which patients display defects in DNA repair mechanisms, and also premature aging. In the first chapter, we investigated the response of cancer cells to chloroquine, a promising adjuvant drug in glioma therapy, and we noticed that cellsresistance to this drug was strictly associated to its mitochondrial membrane potential values, which could be dismantled through ATR inhibition. Interestingly, we noticed that the ability of ATR to promote resistance of glioma cells to chloroquine was independent of its canonical role in the DNA damage response. We also noticed that combined treatment of chloroquine to ATR inhibition through gene silencing exerted a powerful toxic effect on glioma cells treated with the chemotherapeutic Temozolomide. In the second chapter of this thesis, we employed cell reprogramming technique to obtain, for the first time, human neurons from Cockayen Syndrome patients from skin fibroblasts. With this model, we were able to identify a reduced density of synaptic puncta, as well as reduced synchrony in the activity of the patients neurons. Through RNA sequencing, we noticed several pathways related to synapses and neuronal function deregulated in Cockayne Sydrome patients neurons. Implications for the use of chloroquine as an adjuvant drug in glioma therapy, as well as the advantage of using iduced pluripotent stem cells-derived Cockayne syndrome human neurons (instead of currently available models) to study this disease, are also discussed.

Orientador: Roger Frigério Castilho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T07:07:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_DanielaRodriguesde_D.pdf: 21069496 bytes, checksum: f3406a56ba7ffca25021b4803fc73a92 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A acidemia metilmalônica é uma desordem metabólica hereditária envolvendo uma deficiência na atividade da enzima metilmalonil-CoA mutase, com resultante acúmulo de ácido metilmalônico (MMA) no organismo dos pacientes. Há evidências de comprometimento do metabolismo energético mitocondrial por MMA levando à neurodegeneração. Neste estudo avaliou-se o efeito in vitro de MMA no consumo de oxigênio por mitocôndrias isoladas de cérebro de rato na presença de diferentes substratos para a cadeia respiratória. MMA (1-10 mM) inibiu fortemente a respiração mantida por glutamato ou succinato. Nós confirmamos, por meio de experimentos sobre o transporte mitocondrial de succinato, que o efeito inibitório do MMA na respiração mantida por succinato deve-se à inibição do transportador mitocondrial de dicarboxilatos, impedindo a captação de succinato pela mitocôndria. Medidas do transporte mitocondrial de glutamato revelaram que o efeito do MMA na respiração mitocondrial mantida por glutamato não está relacionado à inibição da captação deste substrato pela mitocôndria. Enquanto o MMA mostrou um fraco efeito inibitório sobre a atividade das enzimas glutamato desidrogenase e aspartato transaminase, a atividade da 'alfa'-cetoglutarato desidrogenase foi significativamente inibida por MMA (Ki = 3,65 mM). Medidas do transporte mitocondrial de 'alfa'-cetoglutarato mostraram que o MMA extramitocondrial pode ser trocado pelo 'alfa'-cetoglutarato intramitocondrial, depletando este substrato da matriz mitocondrial, com consequente inibição da respiração mantida por glutamato. Nós observamos que organelas isoladas de cérebro podem acumular aproximadamente o triplo da concentração de MMA presente no meio extramitocondrial. Em adição, a inibição pelo MMA do consumo de oxigênio por fragmentos de cérebro de rato foi parcialmente prevenida pela presença de malato. Os efeitos in vivo do MMA foram estudados por meio das medidas de respiração e produção de espécies reativas de oxigênio em mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos jovens cronicamente tratados (ip, 15 d) com MMA. Nenhuma diferença foi observada entre as amostras controle e tratadas com MMA, indicando que o tratamento in vivo com MMA não leva à disfunção mitocondrial permanente. Ainda, estudos sobre o efeito do MMA na viabilidade e metabolismo de células neuronais e gliais foram realizados. Na linhagem neuronal tumoral PC12, o MMA diminuiu a viabilidade celular após 24h de tratamento. Os parâmetros de potencial de membrana mitocondrial e respiração foram avaliados após 7h de tratamento com MMA. MMA inibiu a respiração nas células intactas, porém, não alterou a respiração nas células permeabilizadas, nas quais não há restrição de substratos. A viabilidade de células de glioblastoma humano, U-87MG, não foi afetada pelo tratamento com MMA. Já em astrócitos de cérebro de rato em cultura primária exposta ao MMA, a viabilidade e área celular foram reduzidas significativamente e alterações morfológicas também foram notadas. Tais observações nas células gliais primárias sugerem que as células tumorais sejam mais resistentes aos efeitos deletérios do MMA. Em conjunto, estes resultados indicam que o efeito inibitório de MMA no metabolismo oxidativo mitocondrial pode ser atribuído à inibição concomitante de enzimas específicas e transportadores, limitando a disponibilidade de substratos para as vias metabólicas mitocondriais / Abstract: Methylmalonic acidemia is an inherited metabolic disorder involving a deficiency in the activity of the enzyme methylmalonyl-CoA mutase or its cofactor 5'-deoxyadenosylcobalamin that results in an accumulation of methylmalonate (MMA) in the body. There is evidence that MMA impairs mitochondrial oxidative metabolism, leading to neurodegeneration. In this study we evaluated the in vitro effect of MMA on oxygen consumption by isolated rat brain mitochondria in the presence of different respiratory chain substrates. MMA (1-10 mM) strongly inhibited glutamate-supported and succinatesupported respiration. We confirmed that the inhibitory effect of MMA on succinatesupported respiration is due to inhibition of the mitochondrial dicarboxylate transporter by MMA, blocking succinate uptake by mitochondria. Glutamate transport measurements revealed that the MMA effect on glutamate-supported respiration is not due to inhibition of mitochondrial uptake of this substrate. While MMA showed a weak inhibitory effect on glutamate dehydrogenase and aspartate transaminase, _'alfa'-ketoglutarate dehydrogenase activity was significantly inhibited by MMA (Ki = 3.65 mM). 'alfa'-ketoglutarate transport measurements showed that an exchange can take place between extramitochondrial MMA and intramitochondrial 'alfa'-ketoglutarate, depleting this substrate and consequently causing inhibition of glutamate-supported respiration. We observed that isolated brain organelles can accumulate nearly three times the concentration of extramitochondrial MMA. In addition, MMA inhibition of respiration by diced rat brain tissue was partially prevented by malate. MMA effects in vivo were studied by measuring respiration and reactive oxygen species generation in isolated brain mitochondria from young rats chronically injected (ip, 15 d) with MMA. No differences were observed between control and MMA-treated samples, indicating that in vivo MMA treatment does not lead to permanent mitochondrial dysfunction. In addition, a study into the effect of MMA on the viability and metabolism of neuronal and glial cells was carried out. In the PC12 neuronal tumor cell line, MMA decreased cell viability after 24 hours of treatment. Mitochondrial membrane potential and respiration were evaluated after 7 hours of MMA treatment. MMA inhibited respiration in intact cells but did not alter respiration in permeabilized cells, where there is no substrate deprivation. Cell viability of U-87MG human glioblastoma cells was not affected by MMA treatment. However, in cells from a primary culture of rat cerebral astrocytes, viability and cell area were significantly reduced and morphological alterations were also noted. The most evident effects of MMA were observed in primary cells, suggesting that tumor cells are more resistant to the deleterious effects of MMA. Taken together, these results indicate that the inhibitory effect of MMA on mitochondrial oxidative metabolism can be ascribed to the concurrent inhibition of specific enzymes and transporters, limiting the availability of substrates for mitochondrial metabolic pathways / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências