Neuropatia é a complicação mais comum e mais debilitante da Diabetes Mellitus, a longo prazo presente em mais de 50% dos pacientes que possuem a doença. A hiperglicemia induz estresse oxidativo nos neurônios de diabéticos acarretando a ativação de múltiplas vias bioquímicas, as quais são potenciais alvos terapêuticos para a neuropatia diabética. Está claro que compostos carbonil reativos são mediadores glicotóxicos do estresse oxidativo através da formação de produtos finais de glicação avançada como resultado direto da hiperglicemia. Metilglioxal e glicolaldeído são compostos carbonil reativos inevitavelmente produzidos pelo metabolismo, os quais são encontrados em maior quantidade em situações de hiperglicemia. Recentemente, tem sido dada muita atenção para o envolvimento de espécies reativas na toxicidade do metilglioxal e do glicolaldeído, e tem-se demonstrado que essas glicotoxinas têm potencial para induzir estresse oxidativo, parar o crescimento celular e promover morte por apoptose ou necrose. O metilglioxal e o glicolaldeído interagem com grupamentos sulfidril de moléculas de glutationa e de enzimas, inibindo sua atividade; entretanto, os mecanismos moleculares relacionados aos efeitos tóxicos dessas glicotoxinas e as vias pelas quais elas levam a formação de espécies reativas não estão completamente elucidados. Neste estudo nós buscamos esclarecer a relação entre o metabolismo do metilglioxal e do glicolaldeído e a produção de espécies reativas, e investigamos as possíveis rotas de morte celular envolvidas. Utilizamos a linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada, pois este é um modelo neuronal bem caracterizado para estudos de compostos neurotóxicos. Nós avaliamos a produção de espécies reativas induzida por metilglioxal e glicolaldeído através da técnica da diclorofluoresceína, e avaliamos, também, seus efeitos sob o conteúdo de glutationa celular. Além disso, investigamos a ativação das caspase-3, -8 e -9 e a contribuição de diferentes sistemas peroxidases (glutationa-redutase e a tioredoxina-redutase), na defesa neuronal contra essas glicotoxinas. Como resultados encontramos que o tratamento com ambas glicotoxinas rapidamente provocou um aumento na produção de espécies reativas e diminuição do conteúdo de glutationa, com concomitante ativação das caspases-8 e -9 e, posteriormente, também houve ativação da caspase-3 pelo tratamento com metilglioxal. Vimos que a tioredoxina-redutase possui um papel mais importante na defesa celular contra a toxicidade do metilglioxal do que contra o glicolaldeído, enquanto que a glutationa-redutase tem papel semelhante na defesa celular contra ambas glicotoxinas. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo é um importante mecanismo da toxicidade do metilglioxal e do glicolaldeído nas células diferenciadas SHSY5Y e, que enzimas redutoras de grupamentos sulfidril contribuem de diferentes formas na defesa celular contra cada uma dessas glicotoxinas. / Neuropathy is the most common and debilitating complication of Diabetes Mellitus present in more than 50% of the patients with long-standing disease. Hyperglycemia induces oxidative stress in neurons from diabetic patients and results in activation of multiple biochemical pathways. These activated pathways are a major source of damage and are potential therapeutic targets in diabetic neuropathy. A large body of evidence has implicated reactive carbonyl compounds as glycotoxic mediators of oxidative stress by forming advanced glycation endproducts as a direct result of hyperglycemia. Methylglyoxal and glycolaldehyde are reactive carbonil compounds inevitably produced by the metabolism, but they are found in increased rates under hyperglycemia condition. Recently, the attention has been focused on the involvement of reactive species in methylglyoxal and glycolaldehyde toxicities, resulting in oxidative stress and leading to cell growth arrest, apoptotic or necrosis death. These glycotoxins interact with sulfhydryl-groups of glutathione molecules enzymes, inhibiting their activity; however, the molecular mechanism underlying methylglyoxal and glycolaldehyde cytotoxic effects and reactive species generation are not fully understood. In this study we have pursued to establish the role of methylglyoxal and glycolaldehyde metabolisms and reactive species production, and have looked for the possible death routes involved with the toxic effects of these glycotoxins. Here we used the differentiated human neuroblastoma SH-SY5Y cells as neuronal experimental model to investigate the pathological effects of various neurotoxic compounds. We have evaluated the methylglyoxal and glycolaldehyde capacity to reactive species generation by dichlorofluorescein assay and their effects upon cellular glutathione content. Also, we have assessed the caspase-3, -8 and -9 activation and the contribution of different peroxidases systems (glutathione reductase and thioredoxin reductase) in the neuronal defense against methylglyoxal and glycolaldehyde cytotoxicities. We found that both glycotoxins promptly provoke reactive species generation and decrease the cell glutathione content, as well induce caspase-8 and -9 activation. Later caspase-3 activation was found in methylglyoxal treatment. We demonstrate that thioredoxin reductase has a most important role in cell defense against methylglyoxal toxicity than against glycolaldehyde, meanwhile there is no difference in the glutathione reductase role. Our results show that oxidative stress is an important mechanism in the methylglyoxal and glycolaldehyde toxicities and sulfhydryl reductases contributes differently in the cellular defense against these glycotoxins.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The purpose of this study was to investigate if myelinogenesis is related to the mechanism by which diphenyl ditelluride [(PhTe)2] causes toxicity in rat pups. The present study was performed to examine whether the behavioral performance is related to demyelination process induced by (PhTe)2 in rat pups. acetilcholinesterase (AChE) activity was carried out in cerebral cortex of rat pups since studies have demonstrated that demyelinating events interfere with the activity of this enzyme. Rat pups received a single subcutaneous injection of (PhTe)2 (0,25 μmol/kg) or vehicle (canola oil) at 14th post natal day (PND). From day 1 to 7 (PND 15 to 21) after exposure, negative geotaxis, forelimb support and open field tests were performed in pups. Rat pups were euthanized daily (from day 1 to 7) immediately after the behavioral tests. The cerebral density of myelin and histological analysis were performed. The appearance of classic signs of toxicity, behavioral alterations and demyelination of CNS was dependent of the time after (PhTe)2 exposure to rat pups. Neuronal damage, revealed by histological analysis, and the increase in AChE activity occurred at 4th and 5th day after (PhTe)2 exposure, which is coincident with the critical period of demyelination. In conclusion, exposure to (PhTe)2 induced an impairment of developmental behavioral, neurotoxicity and demyelination in the central nervous system of rat pups. / O objetivo geral deste estudo foi investigar se a mielinogênese está envolvida no mecanismo pelo qual o ditelureto de difenila [(PhTe)2] exerce toxicidade em filhotes de ratos. O presente estudo avaliou a performance comportamental durante o desenvolvimento pós-natal está relacionada ao processo de desmielinização induzida por (PhTe)2 em filhotes de ratos Wistar. A atividade da acetilcolinesterase (AChE) foi realizada no córtex cerebral dos filhotes de ratos, uma vez que estudos têm demonstrado que os eventos desmielinizantes podem interferir na atividade desta enzima. Os filhotes de ratos receberam uma única injeção subcutânea de (PhTe)2 (0,25 μmol/kg) ou veículo (óleo de canola) no 14º dia pós-natal (PND). E após a exposição ao (PhTe)2, a performance comportamental dos animais foi avaliada nos testes da geotaxia negativa, da sustentação na barra e do campo aberto, estes ensaios foram realizados do 1º ao 7º dia (PND 15 a 21) após a injeção do composto. Diariamente e imediatamente após estes testes comportamentais, os filhotes foram submetidos à eutanásia (do 1º ao 7° dia), e as amostras de tecidos recolhidas para a quantificação da densidade de mielina encefálica e análises histológicas. O aparecimento de sinais clássicos de toxicidade, alterações comportamentais e desmielinização do sistema nervoso central (SNC) foi dependente do tempo após a exposição ao (PhTe)2 em filhotes de ratos. O dano neuronal, revelado pela análise histológica, e o aumento na atividade da AChE ocorreu nos dias 4 e 5 após a exposição ao (PhTe)2, que é coincidente com o período crítico de desmielinização. Em conclusão, a exposição ao (PhTe)2 induz um prejuízo no desenvolvimento, neurotoxicidade e desmielinização do SNC de filhotes de ratos.

Submitted by Isabela Leite Ferraz Cabral (isabelalferraz@hotmail.com) on 2018-04-19T13:07:04Z No. of bitstreams: 1 Isabela Leite Ferraz (após a defesa).pdf: 2321770 bytes, checksum: 6bfabab6d5e2449baea610ec9c7969ec (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-04-19T17:32:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cabral_ilf_dr_bot.pdf: 2321770 bytes, checksum: 6bfabab6d5e2449baea610ec9c7969ec (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T17:32:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cabral_ilf_dr_bot.pdf: 2321770 bytes, checksum: 6bfabab6d5e2449baea610ec9c7969ec (MD5) Previous issue date: 2018-02-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Justificativa e objetivo: o hábito de tatuar o corpo faz parte da cultura de muitos povos no mundo. A partir do início dos anos 1990, passou a ser utilizada por alguns grupos sociais e em faixa etária determinada como uma forma de arte no corpo. Os pigmentos podem conter componentes orgânicos e inorgânicos, metais e solventes. Há grande variação na composição química destes, o que dá origem às diferentes cores. Pouco se conhece sobre as possíveis implicações da introdução de uma agulha para realização de anestesia regional sobre uma pele tatuada. Alguns autores questionam se o pigmento contido na tatuagem pode desencadear aracnoidite química. Estudo experimental determinou infiltrado inflamatório linfoplasmacitário perivascular nas meninges de coelhos, 6 meses após punção subaracnoidea sobre pele tatuada. O objetivo desta pesquisa foi avaliar se a punção subaracnoidea realizada sobre a pele tatuada de coelhos ocasiona alterações histológicas precoces nas meninges. Material e Métodos: após a aprovação da Comissão de Ética e Pesquisa no Uso de Animais, foram utilizados 28 coelhos adultos jovens, da raça Grupo Genético de Botucatu, com pesos entre 3300 e 5400g e comprimento de medula espinal (espaço medido entre a base do crânio e o espaço lombossacral) entre 38 e 41 cm, fornecidos pelo Biotério da Faculdade de Medicina de Botucatu. Os animais foram divididos em 2 grupos (G): G1- punção subaracnoidea sobre tatuagem e injeção de solução salina a 0,9% e G2 - punção subaracnoidea sobre pele não tatuada e injeção de solução salina a 0,9%. Após anestesia venosa com xilazina e cetamina, os animais de G1 foram tatuados e, após 30 dias, sob a mesma anestesia, foi realizada a abordagem do espaço subaracnoideo, com agulha de Quincke 22G 21/2”, no espaço intervertebral entre a primeira e a segunda vértebra sacral, guiada por ultrassom. Os animais de G1 e G2 receberam as soluções correspondentes em volume de 5 μL por centímetro de medula espinal (aproximadamente 0,2 mL). Os animais foram avaliados clinicamente quanto à sensibilidade e à motricidade por 30 dias, após os quais foram sacrificados e retiradas as porções lombar e sacral da medula espinhal para exame histológico por microscopia óptica. Resultados: onze animais (78,6%) de G1 apresentaram lesões histológicas focais na pia-máter e aracnoide. Nos animais de G2 não foram encontradas alterações histológicas no tecido nervoso, nos vasos sanguíneos ou nas meninges. Conclusão: são precoces as alterações histológicas meníngeas desencadeadas pela introdução do pigmento da tatuagem após punção subaracnoidea. / Background: body tattooing is cultural for many people around the world. Since the early 1990s, it began to be used by some social groups and some age groups as a body art. The pigments may contain organic and inorganic components, metals and solvents. There is a great variation in the chemical composition of these pigments and that is why they produce different colors. We don’t know the possible implications of introducing a needle for performing regional anesthesia on a tattooed skin. Some authors question whether the pigment contained in the tattoo can trigger chemical arachnoiditis. One experimental study showed perivascular lymphoplasmacytic inflammatory infiltrate in rabbit meninges, 6 months after subarachnoid puncture on tattooed skin. The aim of this study was to evaluate if the subarachnoid puncture performed on the tattooed skin of rabbits already causes early histological changes in the meninges. Material and Methods: after Ethics Committee’s approval, it was used 28 young adult rabbits from Botucatu’s genetic group. The rabbits weights were between 3000 and 4500g and the length of spine (space measured from the base of the skull to lumbosacral space) were between 38 and 41 cm provided by the Medical Center of Botucatu Medical School. The animals were divided into 2 groups (G): in G1 group there was a subarachnoid puncture on tattooing and injection of 0.9% saline solution while in G2 group there was a subarachnoid puncture on non-tattooed skin and injection of 0.9% saline solution. After venous anesthesia with xylazine and ketamine, the G1 animals were tattooed. After 30 days, under the same anesthesia, the subarachnoid space were accessed, with Quincke's Needle 22G 21/2” , in the intervertebral space between the first and second sacral vertebra. All the procedure was ultrasound guided. The rabbits of G1 and G2 groups received the corresponding volume solutions of 5 μl per centimeter of spinal cord (approximately 0.2 mL). The animals were clinically assessed for sensitivity and motor function for 30 days. After that, they were sacrificed and the lumbar and sacral portions of the spinal cord were removed for histological examination by light microscopy. Results: eleven animals (78.6%) of G1 group had focal histological lesions in the pia mater and arachnoid. No histological changes were found in nervous tissue, blood vessels or meninges on G2 group. Conclusions: early meningeal histological changes are triggered by introduction of tattoo pigment into central nervous system after subarachnoid puncture. / FAPESP - Proc 2014/24053-9

Orientador: Eliana Marisa Ganem / Resumo: Justificativa e objetivo: o hábito de tatuar o corpo faz parte da cultura de muitos povos no mundo. A partir do início dos anos 1990, passou a ser utilizada por alguns grupos sociais e em faixa etária determinada como uma forma de arte no corpo. Os pigmentos podem conter componentes orgânicos e inorgânicos, metais e solventes. Há grande variação na composição química destes, o que dá origem às diferentes cores. Pouco se conhece sobre as possíveis implicações da introdução de uma agulha para realização de anestesia regional sobre uma pele tatuada. Alguns autores questionam se o pigmento contido na tatuagem pode desencadear aracnoidite química. Estudo experimental determinou infiltrado inflamatório linfoplasmacitário perivascular nas meninges de coelhos, 6 meses após punção subaracnoidea sobre pele tatuada. O objetivo desta pesquisa foi avaliar se a punção subaracnoidea realizada sobre a pele tatuada de coelhos ocasiona alterações histológicas precoces nas meninges. Material e Métodos: após a aprovação da Comissão de Ética e Pesquisa no Uso de Animais, foram utilizados 28 coelhos adultos jovens, da raça Grupo Genético de Botucatu, com pesos entre 3300 e 5400g e comprimento de medula espinal (espaço medido entre a base do crânio e o espaço lombossacral) entre 38 e 41 cm, fornecidos pelo Biotério da Faculdade de Medicina de Botucatu. Os animais foram divididos em 2 grupos (G): G1- punção subaracnoidea sobre tatuagem e injeção de solução salina a 0,9% e G2 - punção subaracnoidea s... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Background: body tattooing is cultural for many people around the world. Since the early 1990s, it began to be used by some social groups and some age groups as a body art. The pigments may contain organic and inorganic components, metals and solvents. There is a great variation in the chemical composition of these pigments and that is why they produce different colors. We don’t know the possible implications of introducing a needle for performing regional anesthesia on a tattooed skin. Some authors question whether the pigment contained in the tattoo can trigger chemical arachnoiditis. One experimental study showed perivascular lymphoplasmacytic inflammatory infiltrate in rabbit meninges, 6 months after subarachnoid puncture on tattooed skin. The aim of this study was to evaluate if the subarachnoid puncture performed on the tattooed skin of rabbits already causes early histological changes in the meninges. Material and Methods: after Ethics Committee’s approval, it was used 28 young adult rabbits from Botucatu’s genetic group. The rabbits weights were between 3000 and 4500g and the length of spine (space measured from the base of the skull to lumbosacral space) were between 38 and 41 cm provided by the Medical Center of Botucatu Medical School. The animals were divided into 2 groups (G): in G1 group there was a subarachnoid puncture on tattooing and injection of 0.9% saline solution while in G2 group there was a subarachnoid puncture on non-tattooed skin and injection of 0.... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Antonio Francisco Godinho / Resumo: Nas últimas décadas os níveis de contaminação ambiental por metais pesados e inseticidas vêm aumentando significativamente, acompanhando exponencialmente o rápido e crescente desenvolvimento industrial levando à exposição simultânea a vários agentes químicos com ação sobre o sistema nervoso central (SNC). Sob o ponto de vista toxicológico, co-exposição a substâncias químicas tende a piorar de forma qualitativa e quantitativa os danos produzidos e a irreversibilidade dos processos de neurotoxicidade. Um dos mais prevalentes tipos de desordens sobre o SNC é o da ansiedade. O objetivo deste trabalho foi estudar a co-exposição gestacional ao metal pesado cádmio (Cd) e ao inseticida organofosforado dimetoato (DM) e sua influência sobre o comportamento de ansiedade na prole de ratos em desenvolvimento. Fêmeas prenhes foram expostas durante toda a gestação, por via oral, a solução de Cd (10mg/l), DM (4mg/kg, gavage) e Cd+DM. Após o nascimento dos filhotes foram avaliados: desenvolvimento físico e sensório-motor dos filhotes durante os primeiros dias de idade e o comportamento de ansiedade nas idades de 30 e 80 dias, utilizando arena de campo aberto (ACA), labirinto em cruz elevado (LCE) e caixa claro-escura (CCE). Também foram quantificadoso Cd e o DM tecidual e a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) sanguínea e cerebral. Os resultados obtidos mostram que: a co-exposição aos agentes alterou o desenvolvimento físico dos filhotes; Cd, DM e Cd+DM aumentaram a ansiedade da pro... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the last decades the levels of environmental contamination by heavy metals and insecticides increased significantly, following exponentially the fast and crescent industrial development leading to the simultaneous exposition to some chemical agents with action on the central nervous system (SNC). Under the toxicological point of view, co-exposure enhances qualitatively and quantitatively the damages produced and the irreversibility of the neurotoxicity processes. One of the most prevalent types of disorders on the SNC is the anxiety. The objective of this work was to study the gestational co-exposure to heavy metal cadmium (Cd) and organophosphate insecticide dimethoate (DM), and its influences on anxiety behavior of rats offspring during its development. Pregnant females were exposed during gestational period, by oral view, to the Cd solution (10 mg/l), DM (4 mg/kg, gavage), or Cd+DM. After birth were evaluated: offspring's physical and sensory-motor development in the first days of age, and anxiety behavior in the ages of 30 and 80 days, using open field arena (OF), elevated plus maze (EPM) and light-dark box (LDB) apparatus. Also were quantified Cd and DM in tissues and activity of the acetylcholinesterase enzyme (AChE) in blood and brain. The obtained results show that: co-exposition to chemical agents modified the physical development of the young rats; Cd, DM and Cd+DM increased the anxiety of the offspring in the young and adult age however, the increase of anxiety ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Neuropatia é a complicação mais comum e mais debilitante da Diabetes Mellitus, a longo prazo presente em mais de 50% dos pacientes que possuem a doença. A hiperglicemia induz estresse oxidativo nos neurônios de diabéticos acarretando a ativação de múltiplas vias bioquímicas, as quais são potenciais alvos terapêuticos para a neuropatia diabética. Está claro que compostos carbonil reativos são mediadores glicotóxicos do estresse oxidativo através da formação de produtos finais de glicação avançada como resultado direto da hiperglicemia. Metilglioxal e glicolaldeído são compostos carbonil reativos inevitavelmente produzidos pelo metabolismo, os quais são encontrados em maior quantidade em situações de hiperglicemia. Recentemente, tem sido dada muita atenção para o envolvimento de espécies reativas na toxicidade do metilglioxal e do glicolaldeído, e tem-se demonstrado que essas glicotoxinas têm potencial para induzir estresse oxidativo, parar o crescimento celular e promover morte por apoptose ou necrose. O metilglioxal e o glicolaldeído interagem com grupamentos sulfidril de moléculas de glutationa e de enzimas, inibindo sua atividade; entretanto, os mecanismos moleculares relacionados aos efeitos tóxicos dessas glicotoxinas e as vias pelas quais elas levam a formação de espécies reativas não estão completamente elucidados. Neste estudo nós buscamos esclarecer a relação entre o metabolismo do metilglioxal e do glicolaldeído e a produção de espécies reativas, e investigamos as possíveis rotas de morte celular envolvidas. Utilizamos a linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada, pois este é um modelo neuronal bem caracterizado para estudos de compostos neurotóxicos. Nós avaliamos a produção de espécies reativas induzida por metilglioxal e glicolaldeído através da técnica da diclorofluoresceína, e avaliamos, também, seus efeitos sob o conteúdo de glutationa celular. Além disso, investigamos a ativação das caspase-3, -8 e -9 e a contribuição de diferentes sistemas peroxidases (glutationa-redutase e a tioredoxina-redutase), na defesa neuronal contra essas glicotoxinas. Como resultados encontramos que o tratamento com ambas glicotoxinas rapidamente provocou um aumento na produção de espécies reativas e diminuição do conteúdo de glutationa, com concomitante ativação das caspases-8 e -9 e, posteriormente, também houve ativação da caspase-3 pelo tratamento com metilglioxal. Vimos que a tioredoxina-redutase possui um papel mais importante na defesa celular contra a toxicidade do metilglioxal do que contra o glicolaldeído, enquanto que a glutationa-redutase tem papel semelhante na defesa celular contra ambas glicotoxinas. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo é um importante mecanismo da toxicidade do metilglioxal e do glicolaldeído nas células diferenciadas SHSY5Y e, que enzimas redutoras de grupamentos sulfidril contribuem de diferentes formas na defesa celular contra cada uma dessas glicotoxinas. / Neuropathy is the most common and debilitating complication of Diabetes Mellitus present in more than 50% of the patients with long-standing disease. Hyperglycemia induces oxidative stress in neurons from diabetic patients and results in activation of multiple biochemical pathways. These activated pathways are a major source of damage and are potential therapeutic targets in diabetic neuropathy. A large body of evidence has implicated reactive carbonyl compounds as glycotoxic mediators of oxidative stress by forming advanced glycation endproducts as a direct result of hyperglycemia. Methylglyoxal and glycolaldehyde are reactive carbonil compounds inevitably produced by the metabolism, but they are found in increased rates under hyperglycemia condition. Recently, the attention has been focused on the involvement of reactive species in methylglyoxal and glycolaldehyde toxicities, resulting in oxidative stress and leading to cell growth arrest, apoptotic or necrosis death. These glycotoxins interact with sulfhydryl-groups of glutathione molecules enzymes, inhibiting their activity; however, the molecular mechanism underlying methylglyoxal and glycolaldehyde cytotoxic effects and reactive species generation are not fully understood. In this study we have pursued to establish the role of methylglyoxal and glycolaldehyde metabolisms and reactive species production, and have looked for the possible death routes involved with the toxic effects of these glycotoxins. Here we used the differentiated human neuroblastoma SH-SY5Y cells as neuronal experimental model to investigate the pathological effects of various neurotoxic compounds. We have evaluated the methylglyoxal and glycolaldehyde capacity to reactive species generation by dichlorofluorescein assay and their effects upon cellular glutathione content. Also, we have assessed the caspase-3, -8 and -9 activation and the contribution of different peroxidases systems (glutathione reductase and thioredoxin reductase) in the neuronal defense against methylglyoxal and glycolaldehyde cytotoxicities. We found that both glycotoxins promptly provoke reactive species generation and decrease the cell glutathione content, as well induce caspase-8 and -9 activation. Later caspase-3 activation was found in methylglyoxal treatment. We demonstrate that thioredoxin reductase has a most important role in cell defense against methylglyoxal toxicity than against glycolaldehyde, meanwhile there is no difference in the glutathione reductase role. Our results show that oxidative stress is an important mechanism in the methylglyoxal and glycolaldehyde toxicities and sulfhydryl reductases contributes differently in the cellular defense against these glycotoxins.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-01-22T12:45:03Z No. of bitstreams: 1 2014_WillianMeloJunior.pdf: 2264980 bytes, checksum: 47db4fa2b95a2735926d361be45a79e0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2015-02-10T17:04:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_WillianMeloJunior.pdf: 2264980 bytes, checksum: 47db4fa2b95a2735926d361be45a79e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-10T17:04:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_WillianMeloJunior.pdf: 2264980 bytes, checksum: 47db4fa2b95a2735926d361be45a79e0 (MD5) / A bebida psicoativa conhecida como ayahuasca (Banisteriopsis caapi e Psychotria viridis) é um sacramento incorporado a religiões não indígenas oriundas da região amazônica. Essa cocção sagrada tem propriedades de cura alardeadas em rituais xamânicos e um corpo de evidências crescente indica que o uso é seguro no contexto ritualístico. A perspectiva de uso da ayahuasca extrapolando o uso religioso seja em um contexto terapêutico ou recreacional ainda carece de dados pré-clínicos que atestem sua segurança. Esse estudo avaliou os perfis genotóxico, mutagênico, citotóxico e neurocomportamental da ingestão aguda de ayahuasca em ratos Wistar. Os bioensaios realizados foram análise de fragmentação de DNA por citometria de fluxo (CF), Ensaio Cometa (EC), teste do Micronúcleo (MN), análise das séries hematológicas (eritrograma, leucograma e plaquetograma) e avaliação sérica das funções renais, hepática e pancreática. Para avaliação neurocomportamental utilizaram-se os testes de campo aberto, labirinto em cruz elevado e natação forçada, que além de avaliar a locomoção e mobilidade são também modelos preditivos de ação ansiolítica e antidepressiva. Cinqüenta ratos Wistar, de ambos os sexos, foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos experimentais: grupo controle negativo (GC-) que recebeu água filtrada, grupo controle positivo que recebeu doxorrubicina (DOX) e grupos tratados (GT) com diferentes doses de ayahuasca (1X, 5X e 15X a dose ritualística). A observação comportamental mostrou redução da atividade locomotora geral nos testes de campo aberto e labirinto em cruz elevado. No teste de natação forçada, animais tratados do grupo 15X mostraram significativa redução do tempo de flutuação, animais tratados com as doses 1X, 5X e 15X mostraram comportamento ativo do tipo escalada aumentado, sugerindo uma possível ação antidepressiva da infusão. Ayahuasca mostrou baixo potencial genotóxico em doses 1X e 5X, ocorrendo aumento na incidência de eritrócitos micronucleados apenas na dose mais elevada (15X). Além disso, a bebida não mostrou ação citotóxica nas condições testadas e as funções hepática, renal e pancreática se mantiveram sem alterações significativas em todas as doses testadas. Esses resultados indicam que ratos tratados com ayahuasca nas doses até 5X a dose ritualística não apresentaram alterações genotóxicas ou citotóxicas, e o potencial antidepressivo observado é um efeito que deve ser investigado mais detalhadamente. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / The psychoactive brew known as ayahuasca (Banisteriopsis caapi and Psychotria viridis) is a sacramental beverage incorporated by non-indigenous religions originated from the Amazon region. This sacred cooking has touted healing properties in shamanic rituals and an increasing body of evidence indicates that its use is safe in ritualistic context. The prospect of use of ayahuasca in a therapeutic context or in a recreational context still lacks of preclinical data about its safety. This study evaluated the genotoxic, mutagenic, cytotoxic and neurobehavioral profiles of ayahuasca. Bioassays were: analysis of DNA fragmentation by flow cytometry (FC), comet assay (CA), the micronucleus test (MN), hematological analysis (erythrogram, leukogram and thrombogram) and serum evaluation of renal, hepatic and pancreatic functions. For neurobehavioral assessment were used the open field test, elevated plus maze test and forced swimming test. These tests evaluate locomotion and mobility as well as are also predictive of anxiolytic and antidepressant action. 50Wistar rats of both sexes were randomly distributed into five experimental groups: negative control group (GC-) that received filtered water, Positive Control Group who received doxorubicin (DOX) and treated groups (GT) with different doses of ayahuasca (1X, 5X and 15X). Behavioral evaluation showed reduction in general locomotor activity in the open field and elevated plus maze tests. In water animals of 15X treated group showed significant reduction in the fluctuation, treated animals of 1X, 5X e 15X showed active behavior like climbing increased, suggesting a possible antidepressive effect. Ayahuasca showed low genotoxic potential at the 1 X and 5X doses; causing increase in the incidence of micronuclei erythrocytes only at the highest dose (15X). In addition, the beverage showed no cytotoxic effect in the tested conditions and hepatic, renal and pancreatic functions remained without significant changes at all tested doses. These results indicate that treated rats with doses up to 5X ritualistic dose showed no genotoxic or cytotoxic changes, and the antidepressant potential observed is an effect that should be investigated further.

Neuropatia é a complicação mais comum e mais debilitante da Diabetes Mellitus, a longo prazo presente em mais de 50% dos pacientes que possuem a doença. A hiperglicemia induz estresse oxidativo nos neurônios de diabéticos acarretando a ativação de múltiplas vias bioquímicas, as quais são potenciais alvos terapêuticos para a neuropatia diabética. Está claro que compostos carbonil reativos são mediadores glicotóxicos do estresse oxidativo através da formação de produtos finais de glicação avançada como resultado direto da hiperglicemia. Metilglioxal e glicolaldeído são compostos carbonil reativos inevitavelmente produzidos pelo metabolismo, os quais são encontrados em maior quantidade em situações de hiperglicemia. Recentemente, tem sido dada muita atenção para o envolvimento de espécies reativas na toxicidade do metilglioxal e do glicolaldeído, e tem-se demonstrado que essas glicotoxinas têm potencial para induzir estresse oxidativo, parar o crescimento celular e promover morte por apoptose ou necrose. O metilglioxal e o glicolaldeído interagem com grupamentos sulfidril de moléculas de glutationa e de enzimas, inibindo sua atividade; entretanto, os mecanismos moleculares relacionados aos efeitos tóxicos dessas glicotoxinas e as vias pelas quais elas levam a formação de espécies reativas não estão completamente elucidados. Neste estudo nós buscamos esclarecer a relação entre o metabolismo do metilglioxal e do glicolaldeído e a produção de espécies reativas, e investigamos as possíveis rotas de morte celular envolvidas. Utilizamos a linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada, pois este é um modelo neuronal bem caracterizado para estudos de compostos neurotóxicos. Nós avaliamos a produção de espécies reativas induzida por metilglioxal e glicolaldeído através da técnica da diclorofluoresceína, e avaliamos, também, seus efeitos sob o conteúdo de glutationa celular. Além disso, investigamos a ativação das caspase-3, -8 e -9 e a contribuição de diferentes sistemas peroxidases (glutationa-redutase e a tioredoxina-redutase), na defesa neuronal contra essas glicotoxinas. Como resultados encontramos que o tratamento com ambas glicotoxinas rapidamente provocou um aumento na produção de espécies reativas e diminuição do conteúdo de glutationa, com concomitante ativação das caspases-8 e -9 e, posteriormente, também houve ativação da caspase-3 pelo tratamento com metilglioxal. Vimos que a tioredoxina-redutase possui um papel mais importante na defesa celular contra a toxicidade do metilglioxal do que contra o glicolaldeído, enquanto que a glutationa-redutase tem papel semelhante na defesa celular contra ambas glicotoxinas. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo é um importante mecanismo da toxicidade do metilglioxal e do glicolaldeído nas células diferenciadas SHSY5Y e, que enzimas redutoras de grupamentos sulfidril contribuem de diferentes formas na defesa celular contra cada uma dessas glicotoxinas. / Neuropathy is the most common and debilitating complication of Diabetes Mellitus present in more than 50% of the patients with long-standing disease. Hyperglycemia induces oxidative stress in neurons from diabetic patients and results in activation of multiple biochemical pathways. These activated pathways are a major source of damage and are potential therapeutic targets in diabetic neuropathy. A large body of evidence has implicated reactive carbonyl compounds as glycotoxic mediators of oxidative stress by forming advanced glycation endproducts as a direct result of hyperglycemia. Methylglyoxal and glycolaldehyde are reactive carbonil compounds inevitably produced by the metabolism, but they are found in increased rates under hyperglycemia condition. Recently, the attention has been focused on the involvement of reactive species in methylglyoxal and glycolaldehyde toxicities, resulting in oxidative stress and leading to cell growth arrest, apoptotic or necrosis death. These glycotoxins interact with sulfhydryl-groups of glutathione molecules enzymes, inhibiting their activity; however, the molecular mechanism underlying methylglyoxal and glycolaldehyde cytotoxic effects and reactive species generation are not fully understood. In this study we have pursued to establish the role of methylglyoxal and glycolaldehyde metabolisms and reactive species production, and have looked for the possible death routes involved with the toxic effects of these glycotoxins. Here we used the differentiated human neuroblastoma SH-SY5Y cells as neuronal experimental model to investigate the pathological effects of various neurotoxic compounds. We have evaluated the methylglyoxal and glycolaldehyde capacity to reactive species generation by dichlorofluorescein assay and their effects upon cellular glutathione content. Also, we have assessed the caspase-3, -8 and -9 activation and the contribution of different peroxidases systems (glutathione reductase and thioredoxin reductase) in the neuronal defense against methylglyoxal and glycolaldehyde cytotoxicities. We found that both glycotoxins promptly provoke reactive species generation and decrease the cell glutathione content, as well induce caspase-8 and -9 activation. Later caspase-3 activation was found in methylglyoxal treatment. We demonstrate that thioredoxin reductase has a most important role in cell defense against methylglyoxal toxicity than against glycolaldehyde, meanwhile there is no difference in the glutathione reductase role. Our results show that oxidative stress is an important mechanism in the methylglyoxal and glycolaldehyde toxicities and sulfhydryl reductases contributes differently in the cellular defense against these glycotoxins.

O uso da cocaína na forma de crack vem crescendo nos últimos anos quando comparado às demais vias de administração. Contribuem para esse fato a obtenção quase imediata de efeitos e a maior facilidade de uso, que dispensa a necessidade de material injetável. O usuário de crack sofre os efeitos não só da cocaína, mas também de seu produto de pirólise, a metilecgonidina (AEME). Existem evidências de que a cocaína leva à neurodegeneração, entretanto a participação da AEME nesse processo ainda não foi estudada. A proposta deste estudo foi investigar a participação da AEME no processo neurodegenerativo utilizando cultura primária de hipocampo realizada a partir de fetos de ratos. Foram realizados ensaios de viabilidade celular (MTT) e da atividade da lactato desidrogenase (LDH), além da avaliação morfológica por microscopia de fluorescência. Foi estudada também a participação do dano oxidativo no processo de neurodegeneração, como a formação de aduto de DNA; atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST); e a produção de malonaldeído (MDA), um biomarcador de peroxidação lipídica. Tanto a cocaína quanto a AEME mostraram-se neurotóxicas. A partir dos ensaios de viabilidade e da avaliação morfológica foi possível inferir que, em células hipocampais, a cocaína leva à morte celular tanto por necrose quanto por apoptose e que a provável via envolvida na neurodegeneração da AEME é a apoptose. A AEME não causou lesão direta ao DNA, uma vez que não foi observada a formação de adutos nem com a desoxiguanosina (d-G), a base nitrogenada mais reativa, nem com DNA comercial. Mais ainda, nossos resultados mostraram que a AEME e a cocaína, nas concentrações de 1 e 2 mM, respectivamente, foram equipotentes e a incubação concomitante das duas substâncias nessas concentrações apresentou efeito aditivo após 48 horas de exposição. A morte de células hopocampais evidenciada a partir de 24 horas de exposição foi precedida pela diminuição da atividade da GPx após 3 horas de incubação tanto com a AEME e a cocaína, quanto com a associação entre essas substâncias. A atividade da GST também diminuiu, no entanto, somente após 6 horas de exposição, antecedendo a morte celular. Não foi observada alteração na atividade da GR. Houve um aumento, porém, não estatisticamente significativo, de MDA após 48 horas de incubação. Nossos resultados sugerem uma maior susceptibilidade à neurodegeneração com o uso de crack do que com a cocaína isoladamente. / Smoking crack has increased in the last years when compared to the other routes of cocaine administration. Its advantage is the quicker and stronger high effects and its ease of use without the need of needles. Smoking crack involves inhaling not only cocaine, but also its pyrolysis product, methylecgonidine (AEME). There are evidences that cocaine causes neurodegeneration, but AEME involvement in this process has not been studied yet. The aim of this study was to investigate AEME participation in neurodegeneration using a primary hippocampus culture made from rat fetuses. Cellular viability assays (MTT), lactate dehydrogenase activity (LDH) and morphological evaluations with fluorescence microscopy were performed. The involvement of oxidative injury in the neurodegeneration process was also studied through DNA adduct formation; the evaluation of antioxidants enzymes activities as glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glutathione S-transferase (GST); and the production of malonaldehyde (MDA), a lipoperoxidation biomarker. Both cocaine and AEME showed neurotoxic effects. Through viability assays and morphologic evaluations we can suggest that, in hippocampal cells, cocaine cell death mechanism involves not only necrosis, but also apoptosis and that AEME pathway involved in neurodegeneration is only apoptosis. AEME did not produce a direct DNA injury, as no DNA adduct was observed with desoxyguanosine (d-G), the most reactive nitrogenous base, nor with commercial DNA. Moreover, our results showed that 1 and 2 mM of AEME and cocaine, respectively, were equipotent and the concomitant incubation of both compounds in those concentrations showed additive effect after 48 hours of exposure. Hippocampal cell death at 24 hours was preceded by a decrease in GPx activity after 3 hours of incubation with AEME, cocaine and association between these two compounds. GST activity also decreased but only after 6 hours of exposure, also before cell death. There was no alteration in GR activity. There was an increase, although not statistically significant, in MDA after 48 hours of exposure. As smoking crack abusers are exposed to both cocaine and AEME, our results suggest a higher susceptibility to neurodegeneration in smoking crack than with cocaine alone.

O açaí é uma fruta da amazônia brasileira de consumo emergente no Brasil e outras regiões do mundo. Primordialmente consumida na sua forma de polpa e estabelecida como uma \"superfruta\" graças ao seu potencial antioxidante e anti-inflamatório. No entanto, pouco se sabe sobre sua composição em relação aos elementos químicos essenciais. No presente estudo, a análise sistemática de 12 polpas produzidas com frutos de diferentes localidades demonstrou que a polpa de açaí é naturalmente rica nos elementos Ca, Cu, Fe, Mg, Zn, com destaque para as concentrações encontradas de Mn que foram notoriamente maiores do que as comumente observadas em alimentos considerados como fonte principal deste elemento químico essencial na dieta. Cabe destacar que em valores médios, todos os elementos químicos estudados no açaí apresentaram-se em concentrações que contribuem significativamente para as suas necessidades diárias preconizadas. Entretanto, a análise do fracionamento químico da polpa de açaí demonstrou que o ferro está em uma forma potencialmente indisponível; enquanto que cerca de 40% dos elementos cálcio, magnésio, manganês e zinco estão quelados a um composto não fenólico de alta solubilidade em água e que pode aumentar suas biodisponibilidades. Diferentemente dos demais, o cobre interagiu significativamente com a fração fenólica solúvel em água do alimento. A fração fenólica eluída com metanol por SPE demonstrou ter considerável atividade antioxidante direta no ensaio de sequestro de DPPH com EC50 de 19,1 ?g/L e foi eficaz na atenuação da citotoxicidade, estresse oxidativo e alteração funcional induzidos por 500 ?M de MnCl2 em cultura primária de astrócitos, avaliados pelos ensaios de LDH e MTT, GSH/GSSG, F2-IsoPs, captação de glutamato e expressão de Nrf2. Este extrato de açaí em uma concentração ótima de 0,1 ?g/mL preveniu o estresse oxidativo induzido por Mn restaurando a razão GSH/GSSG, protegendo as membranas astrocitárias da lipoperoxidação e diminuindo a expressão de Nrf2. Uma concentração mais elevada de extrato de açaí exacerbou os efeitos do Mn nestes mesmos parâmetros, exceto na lipoperoxidação medida pela formação de F2-IsoPs. Assim, o pré-tratamento dos astrócitos com concentrações mais elevadas destas antocianinas com exposição ao Mn em sequência, pode predispor os astrócitos fazendo com que um efeito pró-oxidante prevaleça. Estes achados devem ser considerados em estudos futuros que explorem a potencialidade das antocianinas do açaí em formulações nutracêuticas para obtenção de efeitos antioxidantes e neuroprotetores ideais. Assim, conclui-se que o próprio açaí possui uma fração de compostos fenólicos capaz de atenuar os efeitos oxidativos do Mn e que portanto, pode indicar uma segurança alimentar do consumo do fruto em quantidades moderadas. / Açaí is a fruit from Brazilian Amazon with an exotic flavor possessing high antioxidant and anti-inflammatory properties. Based on these properties, the fruit is classified as one of the new \"super fruits\". However, few is known about its essential chemical elements content. In this study, the systematic analysis of 12 freeze-dried pulps processed with açaí of different locations showed that açaí pulp is naturally rich in Ca, Cu, Fe, Mg, Zn, and especially amounts of Mn, which was significantly greater than in foods considered Mn dietary source, were found. In average values, all determined essential chemical elements contribute significantly to their recommended daily intake requirements. However, fractionation analysis of açai showed that iron is potentially not bioavailable. While about 40% of calcium, magnesium, manganese, and zinc are binding to a non-phenolic compound high soluble in water, which may increase their bioavailabilities. Copper is significantly bound to water-soluble phenolic fraction in açaí. This phenolic fraction eluted with methanol by SPE provided considerable direct antioxidant activity on the DPPH scavenging assay with EC50 of 19.1 ?g/L and was effective attenuating cytotoxicity, oxidative stress, and functional alterations induced by 500 ?M of MnCl2 in primary cultured astrocytes, which was assessed by MTT and LDH assay, GSH/GSSG ratio, F2-IsoPs formation, glutamate uptake, and Nrf2 levels. This anthocyanin-rich açaí extract in an optimal concentration of 0.1 ?g/mL prevented oxidative stress induced by Mn restoring the GSH/GSSG ratio, protecting the astrocytic membrane from lipid peroxidation and decreasing levels of Nrf2. A higher concentration of the same açaí extract exacerbated the effects of Mn in these same parameters, except on lipid peroxidation assessed by F2-IsoPs. In constrast, pre-treating with high concentrations of açaí\'s anthocyanins followed by Mn exposure, pro-oxidant effects likely prevails. These findings should be considered in future studies regarding the potential of anthocyanins in açaí on nutraceutical formulations to obtain optimal antioxidant and neuroprotective effects. Thus, we conclude that the own açaí has a phenolic fraction capable of attenuates the oxidative effects of Mn. So, may indicates that moderate açaí consumption is dietary safe regarding Mn neurotoxicity.