No presente estudo avaliou-se a atividade quimiopreventiva da tributirina (T), pró-fármaco do ácido butírico (AB) e presente naturalmente em leite e derivados, quando administrada a ratos Wistar durante as etapas de iniciação e seleção/promoção do modelo de hepatocarcinogênese do \"Hepatócito Resistente\" (RH). Os animais receberam diariamente, durante 8 semanas consecutivas e por entubação gástrica: T (200 mg/100 g de peso corpóreo [p.c.]; grupo TB) ou maltodextrina (300 mg/100 g de p.c.; grupo MD; controle isocalórico). Duas semanas após o início dos tratamentos, os grupos foram submetidos ao modelo do RH. Esse consistiu na aplicação intraperitoneal de uma dose do agente iniciante dietilnitrosamina (DEN, 20 mg/100 g de p.c.), seguida, 2 semanas após, da aplicação de 4 doses consecutivas de 2-acetilaminofluoreno (AAF; 2 mg/100 g de p.c.) e de uma hepatectomia parcial (HP) a 70%, acrescida de 2 doses de AAF (2 mg/100 g de p.c.) 2 e 4 dias após a cirurgia. Decorridas 6 semanas após a iniciação com DEN, os animais foram eutanasiados administrando-se, entretanto, 2 horas antes desse procedimento 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) (10 mg/100 g de p.c.). De acordo com a análise macroscópica dos fígados, e em comparação ao grupo MD, verificou-se que o grupo TB apresentou menor multiplicidade (p &lt; 0,05) e tamanho (p &lt; 0,05) de lesões pré-neoplásicas (LPN) hepáticas. Em relação à análise morfométrica das LPN hepáticas positivas para a enzima glutationa S-transferase forma placentária (GST-P) totais (persistentes + em remodelação) e também nas LPN hepáticas GST-P positivas persistentes, observou-se que em comparação ao grupo MD, o TB apresentou menor tamanho (p &lt; 0,05) e área do corte ocupada (p &lt; 0,05) por essas lesões. O grupo TB apresentou maior porcentagem (p &lt; 0,05) de LPN hepáticas GST-P positivas em remodelação e maior número (p &lt; 0,05) de corpúsculos apoptóticos (CA) nessas LPN em comparação ao MD. Não houve diferenças (p &gt; 0,05) entre os grupos MD e TB em relação à proliferação celular e aos danos no DNA. De acordo com a imunoistoquímica para p53, o grupo TB apresentou menor porcentagem (p < 0,05) de LPN hepáticas totais e persistentes positivas para a proteína, comparado ao MD. O grupo TB apresentou menor ativação (p &lt; 0,05) do fator nuclear-kB (NF-kB) quando comparado ao MD. O grupo TB tendeu a apresentar maior acetilação de histona H3 resíduo de lisina 9 (H3K9) em relação ao grupo MD. A T apresentou atividade quimiopreventiva promissora quando administrada a ratos Wistar diariamente e durante 8 semanas, abrangendo as etapas de iniciação e seleção/promoção do modelo de hepatocarcinogênese do RH. Inibição de LPN hepáticas GST-P positivas persistentes, indução da remodelação e da apoptose, além de normalização da função de p53, inibição da ativação do NF-kB e indução da acetilação de H3K9 parecem estar envolvidas com as ações anticarcinogênicas da T. / Chemopreventive activity of tributyrin (T), a butyric acid prodrug found in milk and its derivatives, was evaluated during the initial phases of the \"Resistant Hepatocyte\" (RH) model of hepatocarcinogenesis. During 8 consecutive weeks, rats received T (200 mg/100 g body weight; TB group) or maltodextrin (M; 300 mg/100 g body weight; MD group; isocaloric control). Two weeks after the beginning of the treatments, the animals received one dose of diethylnitrosamine (DEN; 20 mg/100 g body weight) for initiation. Two weeks later, the animals received six doses of 2-acetylaminofluorene (AAF, 2 mg/100 g body weight), 4 consecutive doses before partial (2/3) hepatectomy and the remaining, two and four days after surgery. All animals were euthanized 6 weeks after DEN administration. Two hours before euthanasia, rats received 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) (10 mg/100 g body weight). Multiplicity and area of visible hepatocyte nodules/animal were smaller (p &lt; 0,05) in TB group, compared to MD group. Mean area and % liver section area occupied by total (persistant + remodeling) hepatic placental glutathione S-transferase (GST-P) positive preneoplastic lesions (PNL) and persistant hepatic GST-P positive PNL were smaller (p <&lt; 0,05) in TB group, compared to control group. Compared to MD group, TB group presented increased (p &lt; 0,05) % of remodeling hepatic GST-P positive PNL and increased number of apoptotic bodies in these PNL. No differences (p gt; 0,05) were observed between MD and TB groups regarding cell proliferation and DNA damage. TB group presented reduced (p &lt; 0,05) % of total and persistant PNL p53 positive compared to MD group. TB group presented reduced (p < 0,05) nuclear factor-kB (NF-kB) activation in comparison with MD group. Lysine 9 acetylation site in H3 (H3K9) tended to be increased in TB group compared to MD. These results indicate that T represents promising chemopreventive agent against hepatocarcinogenesis when administered to Wistar rats during 8 consecutive weeks on initial phases of RH model. Persistant hepatic GST-P positive PNL inhibition, remodeling and apoptosis induction, p53 function normalization, inhibition of NF-kB activation and H3K9 acetylation can be involved with antineoplastic T actions.

Introdução: A importância do parênquima pulmonar na fisiopatologia da asma tem sido recentemente enfatizada, particularmente nos pacientes com asma grave e de difícil controle. O óxido nítrico (NO) é um importante modulador da resposta contrátil, inflamatória e de remodelamento pulmonar que ocorrem na asma. Embora seu papel na modulação em vias aéreas proximais e distais já tenha sido estabelecido, seus efeitos no parênquima pulmonar foram pouco investigados. Objetivos: Avaliar se a inibição da arginase 2, por intermédio do tratamento com N-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA), e da iNOS, por intermédio da administração de 1400W, pode modular a resposta constritora de parênquima distal, o estresse oxidativo, a expressão de iNOS, assim como a atividade da arginase, em modelo de inflamação alérgica crônica pulmonar em cobaias. Métodos: Os animais foram expostos a sete inalações com soro fisiológico ou com ovoalbumina em doses crescentes (1~5mg/ml- 4 semanas) e tratados com 1400W (2mg/Kg ip. diariamente) iniciando após a 7ª inalação e nor- NOHA (10M - infusão no banho durante a avaliação da mecânica oscilatória), ou associação de 1400W + nor-NOHA (administrado conforme descrito anteriormente). Setenta e duas horas após a sétima inalação os animais foram anestesiados, exsanguinados e a foi realizada a avaliação da mecânica oscilatória do parênquima pulmonar, sendo obtidos os valores de resistência e elastância tecidual na condição basal e após desafio (0,1% de ovoalbumina). Em seguida, os fragmentos de tecido pulmonar periférico foram fixados em solução de formolaldeído a 4%, por 48 horas. Depois de terminada a fixação, o material foi submetido às técnicas histológicas habituais com parafina, para obtenção de cortes de 4m de espessura. Os cortes foram corados para Hematoxilina e Eosina e utilizando técnica de imunohistoquímica foram avaliados o número de células iNOS positivas, a expressão de PGF2, do fator de transcrição NF-kB e de arginase 2 no septo alveolar, por intermédio de avaliação morfométrica. A expressão de arginase 2, NF-kB e PGF2 nos fragmentos de tecido pulmonar periférico foram avaliados em aumento 400X utilizando o programa Image-Pro Plus 4.5v Image Analysis System e os resultados foram expressos em porcentagem. Em relação ao número de células iNOS positivas nos fragmentos pulmonares, foi utilizada a técnica de contagem de pontos, determinada pelo número de pontos que coincidiam em células positivas em cada campo dividido pelo número de pontos que incidiam no tecido pulmonar, no aumento de 1000x. Foram analisados 10 campos por corte, selecionados de forma randômica. Os resultados foram expressos como células por unidade de área (104m2). Para a avaliação da atividade da arginase 2, foi utilizado o método descrito no kit da BioAssay Systems que utiliza um cromogênio, que forma um complexo corado com uréia, produzido na reação de arginase. A determinação da atividade da arginase 2 envolveu a medida da velocidade de reação, expressa em termos de atividade por miligrama de proteína (U/mg). Resultados: Não houve alteração no percentual de estruturas (vasos, vias aéreas e tecido alveolar) no tecido pulmonar nos quatro grupos experimentais, sendo que mais de 90% de tecido do fragmento pulmonar foi constituído de alvéolos. Os animais que foram expostos à ovoalbumina apresentaram um aumento da resistência e da elastância tecidual (após desafio antigênico), no número de células iNOS positivas, na percentagem de expressão de PGF2, arginase 2 e NF-kB no septo alveolar, assim como da atividade de arginase 2 comparativamente aos grupos controles (p<0,001). O tratamento com nor-NOHA ou 1400W isoladamente em animais expostos à ovoalbumina atenuou a resposta de elastância e resistência teciduais após desafio antigênico (p<0,001), o número de células iNOS positivas (p<0,001), na expressão de PGF2, de arginase 2 e NF-kB no septo alveolar (p<0,001). Porém a atividade da arginase 2 só foi reduzida nos grupos que foram tratados com nor-NOHA e na associação de 1400W e nor-NOHA (p<0,05). A associação de 1400W e nor-NOHA em animais expostos à ovoalbumina potencializou a atenuação da expressão PGF2 no septo alveolar (p<0,001). Conclusões: O presente estudo sugere que, neste modelo experimental de inflamação crônica pulmonar, a inibição da arginase tem papel importante na modulação das repostas constritoras e de estresse oxidativo no parênquima pulmonar distal. A associação da inibição da iNOS à da arginase 2 potencializa o controle da resposta de estresse oxidativo. Estas respostas são, pelo menos em parte, moduladas pela ativação de NF-kB. A inibição destas vias enzimáticas pode representar uma estratégia futura para o tratamento de pacientes com asma grave e de difícil controle / Introduction: The importance of the lung parenchyma in the pathophysiology of asthma has recently been emphasized, particularly in patients with severe asthma and difficult to control. Nitric oxide (NO) is an important modulator of contractile response, lung inflammation and remodeling occurring in asthma. Although its role in the modulation proximal and distal airways tone control has already been established, its effects on the lung parenchyma were rarely investigated. Aims: To evaluate the inhibition of arginase 2, through treatment with N-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) and / or iNOS, through the administration of 1400W, can modulate the constrictor response of distal parenchyma, oxidative stress, the expression of iNOS and the activity of arginase, in a model of chronic allergic lung inflammation in guinea pigs. Methods: The seven animals were exposed to inhaled saline or ovalbumin with increasing doses (1~5mg/ml-4 weeks) and treated with 1400W (2mg/kg ip daily) beginning after the 7th inhalation and nor-NOHA (10M - infusion in the bath during the evaluation of mechanical oscillation), or combination of 1400W + nor- NOHA (administered as formerly). Seventy-two hours after the seventh inhalation the animals were anesthetized, and exsanguinated and it was performed evaluation was made of oscillatory mechanics of lung parenchyma, and obtained the values of tissue resistance and elastance at baseline and after challenge (0.1% ovalbumin). Then the peripheral lung tissue fragments were fixed in formolaldeíde 4% for 48 hours. After completion of fixation, the material was subjected to routine histological techniques with paraffin to obtain sections of 4m thickness. The sections were stained with Hematoxylin and Eosin and by using immunohistochemical technique, we assessed the number of iNOS positive cells and expression of PGF2, of the transcription factor NF-kB and arginase 2 in the alveolar septum, through morphometric analysis. The expression of arginase 2, NF-kB and PGF2 in peripheral lung tissue fragments were evaluated at 400X increase by Image - Pro Plus Image Analysis System 4.5v and the results were obtained as a ratio between the amount of expression of arginase 2, NF-kB and PGF2 and are expressed as percentage. Regarding the content of iNOS in lung fragments, we used the technique of counting points, determined by the number of points coinciding in the positive cells in each field divided by the number of points that focused on lung tissue, using the increase of 1000x. Were increase of 10 fields analyzed per section, selected randomly. The results were expressed as cells per unit area (104m2). To assess the activity of arginase 2 we used the method bioassay described in the kit Systems using a chromogen which forms a colored complex with urea produced in the reaction of arginase. The determination of the activity of arginase 2 involved the measurement of reaction rate, expressed in terms of activity per milligram of protein (U/mg). Results: There were no changes in the percentages of structures (vessels, airways and alveolar tissue) lung tissue in four experimental groups, with more than 90% of the tissue fragment consisted of pulmonary alveoli. The animals that were exposed to ovalbumin, showed an increase in tissue resistance and elastance after antigen challenge, the number of iNOS positive cells, the of expression of PGF2, of NF-kB and arginase 2 in the alveolar septum well as in the activity of arginase 2, compared to control groups (p <0.001). The treatment with nor-NOHA or 1400W alone in animals exposed to ovalbumin attenuated the tissue elastance and resistance after antigenic challenge (p <0.001), the number of iNOS positive cells (p <0.001), the expression of PGF2, arginase 2 and NFkB in the alveolar septum (p<0.001). However the activity of arginase 2 was reduced in only in the groups that were treated with nor-NOHA and the association of 1400W and nor-NOHA (p <0.05). The combination of 1400W and nor-NOHA, in animals exposed to ovalbumin enhanced the attenuation of the expression of PGF2 in the alveolar septum (p <0.001). Conclusions: The present study suggests that in this experimental model of chronic pulmonary inflammation, inhibition of arginase 2 plays an important role in the modulation of constrictor responses and oxidative stress in the distal lung parenchyma. The association of iNOS inhibition to the arginase 2 enhances the control of oxidative stress response. These responses are, at least in part, modulated by the activation of NF-kB. The inhibition of these enzyme pathways may represent a future strategy for the treatment of patients with severe asthma and difficult to control

Objetivo: Avaliar o efeito da Isobruceina B como anti-hipernociceptivo e antiinflamatório, e identificar o mecanismo molecular envolvido. Métodos: Inicialmente, o efeito da IsoB sobre a hipernocicepção inflamatória do tecido plantar foi avaliada por von Frey eletrônico. Os tecidos plantares foram removidos para quantificação indireta da infiltração de neutrófilos por mieloperoxidase (MPO). Seu efeito nocicepção térmica foi avaliado em camundongos pelo teste da placa quente a 55º C. Camundongos pré-tratados com IsoB (s.c.) e tratados com carragenina (i.pl), tiveram seus tecidos plantares removidos para quantificação da liberação de citocinas TNF, IL-1? e KC/CXCL1. Para os estudos in vitro, foram utilizados macrófagos extraídos da cavidade peritoneal de camundongos naïve, pré-tratados com 3% de tioglicolato (i.p.) ou de linhagem RAW 264.7. Macrófagos peritoneais foram incubadas com lipopolissacarídeo (LPS) na presença ou ausência de diferentes concentrações de IsoB, para a quantificação da liberação das citocinas TNF, IL-1?, KC/CXCL1 e IL-10 no sobrenadante pelo método de ELISA. A produção in vitro de óxido nítrico (NO) foi indiretamente determinada pelo método de Griess. Para verificar o efeito da IsoB sobre a via do NF-kB, foram utilizados macrófagos RAW 264.7 estavelmente transfectados com um gene para expressão de luciferase dependente de NF-kB (RAW-Luc), incubados com diferentes estímulos (LPS, peptideoglicano, TNF e acetato de forbol miristato [PMA]) na presença ou ausência de IsoB. A atividade da luciferase foi detectada por meio do Luminômetro. A citotoxicidade da IsoB foi avaliada por MTT, lactato desidrogenase e ensaios de citotoxicidade pelo azul de tripan em macrófagos, in vitro. O efeito da IsoB em macrófagos, sobre a degradação o IkB-? e translocação do NF-kB (pela marcação da subunidade p65) para o núcleo e foram examinados por Western Blot de extratos nucleares e citoplasmáticos, e por Microscopia Confocal. O efeito da IsoB sobre a transcrição do RNAm do gene TNF induzido por LPS, foi avaliada por RT-PCR. Células HEK 293 transfectadas foram utilizadas para verificar o efeito da IsoB sobre a síntese de proteínas. Resultados: A IsoB inibe a hipernocicepção inflamatória, mas não tem efeito sobre a nocicepção térmica. IsoB inibiu a produção/libertação das citocinas IL-1? e KC/CXCL1 in vivo, e de TNF, IL-1?, KC/CXCL1, IL-10 e NO in vitro de forma concentração-dependente. O composto analisado também inibiu a atividade da luciferase, NF-kB dependente, por todos os estímulos testado, de forma concentração-dependente. Não foi detectada atividade citotóxica em nenhuma das concentrações testadas. A IsoB não inibe a degradação do IkB-? ou a translocação de NF-kB para o núcleo. Inesperadamente, o composto natural testado também não reduziu a transcrição de RNAm do gene TNF, porém inibiu a síntese de luciferase inespecificamente induzida. Conclusão: A redução da liberação de citocinas pró- inflamatórias, tais como TNF, IL-1? e KC/CXCL1 e da migração de neutrófilos são mecanismos envolvidos nos efeitos anti-inflamatório e anti-hipernociceptivo da IsoB. Os presentes resultados sugerem um mecanismo molecular baseado na direta inibição da síntese de proteica. / Objective: To evaluate the effect of the Isobruceina B (IsoB) as antihypernociceptive and anti-inflammatory, and identify the molecular mechanism involved. Methods: Initially the effect of IsoB upon inflammatoy hypernociception on plantar tissue was evaluated by electronic von Frey. Plantar tissues were removed for indirect quantification of neutrophil infiltration by myeloperoxidase (MPO). Its effect on thermal nociception in mice was evaluated by the hot plate test at 55 ° C. Mice pretreated with IsoB (s.c.) and treated with carrageenan (i.pl.), their tissues were removed for quantification of plantar release of cytokines TNF, IL-1? and KC/CXCL1. For in vitro studies, macrophages derived from peritoneal cavity of naive mice, pretreated with 3% thioglycolate (i.p.) or line RAW 264.7 were used. Peritoneal macrophages were incubated with lipopolysaccharide (LPS) in the presence or absence of different concentrations of IsoB for the quantification of the release of cytokines TNF, IL-1?, and IL-10 KC/CXCL1 in the supernatant by ELISA. In vitro production of nitric oxide (NO) was indirectly determined by the Griess method. To verify the effect of IsoB on the pathway of NF-kB, RAW 264.7 macrophages stably transfected with a gene to expression NF-kB-dependent luciferase (RAW-Luc) were incubated with different stimuli (LPS, peptidoglycan, TNF and phorbol myristate acetate [PMA]) in the presence or absence of IsoB. The luciferase activity was detected by the Luminometer. The cytotoxicity of IsoB was assessed by the MTT, lactate dehydrogenase and cytotoxicity assays trypan blue on macrophages in vitro. The effect of IsoB on macrophages upon the IkB-? degradation and NF-kB translocation (p65 subunit for marking) to the nucleus were examined by Western blot of nuclear and cytoplasmic extracts, and Confocal Microscopy. The effect of IsoB on the TNF mRNA gene transcription induced by LPS was assessed by RT-PCR. Transfected HEK 293 cells were used to verify the effect of IsoB on the protein synthesis. Results: IsoB inhibits inflammatory hypernociception, but has no effect on thermal nociception. IsoB inhibited the production/release of cytokines IL-1? and KC/CXCL1 in vivo, and TNF, IL-1?, KC/CXCL1, IL-10 and NO in vitro in a concentration-dependent manner. The analyzed compound also inhibited luciferase activity NF-kB-dependent for all stimuli tested in a concentration-dependent manner. Cytotoxic activity was not detected in any of the concentrations tested. The IsoB not inhibit the degradation of IkB-? or translocation of NF-kB to the nucleus. Unexpectedly, the natural compound tested neither reduced transcription of TNF mRNA, but inhibited the synthesis of luciferase induced nonspecifically. Conclusion: The reduction on release of pro-inflammatory cytokines such as TNF, IL-1? and KC/CXCL1 and neutrophil migration are mechanisms involved in anti-inflammatory and anti-hypernociceptive effects of IsoB. The present results suggest a molecular mechanism based on the direct inhibition of protein synthesis.

O objetivo do trabalho foi avaliar o estresse oxidativo pós-trauma cirúrgico, através da ativação da NF-<font face=\"symbol\">kB (in vivo), em ratos wistar, utilizando o método de imunohistoquímica em tecido não desmineralizado. Os resultados indicaram uma semelhança entre os grupos Implante, irrigado e adrenalectomizados. Porém, nos grupos dexametasona e composto orgânico, houve uma diferença estatística significante: observou-se um aumento expressivo no primeiro e uma redução no segundo. Dessa forma, conclui-se: 1- Que o método de imunohistoquímica pode ser aplicado em tecido ósseo não descalcificado incluído em Technovit® 7200 VLC; 2- Os implantes de titânio, neste período de poucas horas, não permanecem em sua posição; 3- O composto orgânico foi efetivo na redução da imunorreatividade da NF-<font face=\"symbol\">kB, reduzindo significativamente a ativação da NF-<font face=\"symbol\">kB em cortical dos animais; 4- A utilização da dexametasona como anti-inflamatório em tratamentos pré-cirúrgicos precisa ser melhor estudada. / The purpose of this work was to evaluate the oxidative stress after surgical trauma, through the activation of the NF-<font face=\"symbol\">kB (in vivo), in wistar rats, using immunohistochemistry method on non-demineralized tissue. The results indicate a similarity among the irrigated and adrenalectomized groups of implants. The group using dexamethasone and the organic compound though presented a significant statistical result showing an expressive increase and a reduction in the second group.Conclusions: 1- The immunochemistry method may be applied on non-decalcified bone tissue which are included on Technovit® 7200VLC. 2- The titanium implants studied in this period did not maintain its position in the bone tissue showing therefore that they integrate to the bone. 3- The organic compound was effective to reduce the immunoreactivity of NF-<font face=\"symbol\">kB with a significative reduction of the activity of this endonuclease in the bone cortical region on the studied animals. 4- More studies are required for the use of dexamethasone as an anti-inflammatory medicament on pre-surgical treatments.

Introdução: A importância do parênquima pulmonar na fisiopatologia da asma tem sido recentemente enfatizada, particularmente nos pacientes com asma grave e de difícil controle. O óxido nítrico (NO) é um importante modulador da resposta contrátil, inflamatória e de remodelamento pulmonar que ocorrem na asma. Embora seu papel na modulação em vias aéreas proximais e distais já tenha sido estabelecido, seus efeitos no parênquima pulmonar foram pouco investigados. Objetivos: Avaliar se a inibição da arginase 2, por intermédio do tratamento com N-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA), e da iNOS, por intermédio da administração de 1400W, pode modular a resposta constritora de parênquima distal, o estresse oxidativo, a expressão de iNOS, assim como a atividade da arginase, em modelo de inflamação alérgica crônica pulmonar em cobaias. Métodos: Os animais foram expostos a sete inalações com soro fisiológico ou com ovoalbumina em doses crescentes (1~5mg/ml- 4 semanas) e tratados com 1400W (2mg/Kg ip. diariamente) iniciando após a 7ª inalação e nor- NOHA (10M - infusão no banho durante a avaliação da mecânica oscilatória), ou associação de 1400W + nor-NOHA (administrado conforme descrito anteriormente). Setenta e duas horas após a sétima inalação os animais foram anestesiados, exsanguinados e a foi realizada a avaliação da mecânica oscilatória do parênquima pulmonar, sendo obtidos os valores de resistência e elastância tecidual na condição basal e após desafio (0,1% de ovoalbumina). Em seguida, os fragmentos de tecido pulmonar periférico foram fixados em solução de formolaldeído a 4%, por 48 horas. Depois de terminada a fixação, o material foi submetido às técnicas histológicas habituais com parafina, para obtenção de cortes de 4m de espessura. Os cortes foram corados para Hematoxilina e Eosina e utilizando técnica de imunohistoquímica foram avaliados o número de células iNOS positivas, a expressão de PGF2, do fator de transcrição NF-kB e de arginase 2 no septo alveolar, por intermédio de avaliação morfométrica. A expressão de arginase 2, NF-kB e PGF2 nos fragmentos de tecido pulmonar periférico foram avaliados em aumento 400X utilizando o programa Image-Pro Plus 4.5v Image Analysis System e os resultados foram expressos em porcentagem. Em relação ao número de células iNOS positivas nos fragmentos pulmonares, foi utilizada a técnica de contagem de pontos, determinada pelo número de pontos que coincidiam em células positivas em cada campo dividido pelo número de pontos que incidiam no tecido pulmonar, no aumento de 1000x. Foram analisados 10 campos por corte, selecionados de forma randômica. Os resultados foram expressos como células por unidade de área (104m2). Para a avaliação da atividade da arginase 2, foi utilizado o método descrito no kit da BioAssay Systems que utiliza um cromogênio, que forma um complexo corado com uréia, produzido na reação de arginase. A determinação da atividade da arginase 2 envolveu a medida da velocidade de reação, expressa em termos de atividade por miligrama de proteína (U/mg). Resultados: Não houve alteração no percentual de estruturas (vasos, vias aéreas e tecido alveolar) no tecido pulmonar nos quatro grupos experimentais, sendo que mais de 90% de tecido do fragmento pulmonar foi constituído de alvéolos. Os animais que foram expostos à ovoalbumina apresentaram um aumento da resistência e da elastância tecidual (após desafio antigênico), no número de células iNOS positivas, na percentagem de expressão de PGF2, arginase 2 e NF-kB no septo alveolar, assim como da atividade de arginase 2 comparativamente aos grupos controles (p<0,001). O tratamento com nor-NOHA ou 1400W isoladamente em animais expostos à ovoalbumina atenuou a resposta de elastância e resistência teciduais após desafio antigênico (p<0,001), o número de células iNOS positivas (p<0,001), na expressão de PGF2, de arginase 2 e NF-kB no septo alveolar (p<0,001). Porém a atividade da arginase 2 só foi reduzida nos grupos que foram tratados com nor-NOHA e na associação de 1400W e nor-NOHA (p<0,05). A associação de 1400W e nor-NOHA em animais expostos à ovoalbumina potencializou a atenuação da expressão PGF2 no septo alveolar (p<0,001). Conclusões: O presente estudo sugere que, neste modelo experimental de inflamação crônica pulmonar, a inibição da arginase tem papel importante na modulação das repostas constritoras e de estresse oxidativo no parênquima pulmonar distal. A associação da inibição da iNOS à da arginase 2 potencializa o controle da resposta de estresse oxidativo. Estas respostas são, pelo menos em parte, moduladas pela ativação de NF-kB. A inibição destas vias enzimáticas pode representar uma estratégia futura para o tratamento de pacientes com asma grave e de difícil controle / Introduction: The importance of the lung parenchyma in the pathophysiology of asthma has recently been emphasized, particularly in patients with severe asthma and difficult to control. Nitric oxide (NO) is an important modulator of contractile response, lung inflammation and remodeling occurring in asthma. Although its role in the modulation proximal and distal airways tone control has already been established, its effects on the lung parenchyma were rarely investigated. Aims: To evaluate the inhibition of arginase 2, through treatment with N-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) and / or iNOS, through the administration of 1400W, can modulate the constrictor response of distal parenchyma, oxidative stress, the expression of iNOS and the activity of arginase, in a model of chronic allergic lung inflammation in guinea pigs. Methods: The seven animals were exposed to inhaled saline or ovalbumin with increasing doses (1~5mg/ml-4 weeks) and treated with 1400W (2mg/kg ip daily) beginning after the 7th inhalation and nor-NOHA (10M - infusion in the bath during the evaluation of mechanical oscillation), or combination of 1400W + nor- NOHA (administered as formerly). Seventy-two hours after the seventh inhalation the animals were anesthetized, and exsanguinated and it was performed evaluation was made of oscillatory mechanics of lung parenchyma, and obtained the values of tissue resistance and elastance at baseline and after challenge (0.1% ovalbumin). Then the peripheral lung tissue fragments were fixed in formolaldeíde 4% for 48 hours. After completion of fixation, the material was subjected to routine histological techniques with paraffin to obtain sections of 4m thickness. The sections were stained with Hematoxylin and Eosin and by using immunohistochemical technique, we assessed the number of iNOS positive cells and expression of PGF2, of the transcription factor NF-kB and arginase 2 in the alveolar septum, through morphometric analysis. The expression of arginase 2, NF-kB and PGF2 in peripheral lung tissue fragments were evaluated at 400X increase by Image - Pro Plus Image Analysis System 4.5v and the results were obtained as a ratio between the amount of expression of arginase 2, NF-kB and PGF2 and are expressed as percentage. Regarding the content of iNOS in lung fragments, we used the technique of counting points, determined by the number of points coinciding in the positive cells in each field divided by the number of points that focused on lung tissue, using the increase of 1000x. Were increase of 10 fields analyzed per section, selected randomly. The results were expressed as cells per unit area (104m2). To assess the activity of arginase 2 we used the method bioassay described in the kit Systems using a chromogen which forms a colored complex with urea produced in the reaction of arginase. The determination of the activity of arginase 2 involved the measurement of reaction rate, expressed in terms of activity per milligram of protein (U/mg). Results: There were no changes in the percentages of structures (vessels, airways and alveolar tissue) lung tissue in four experimental groups, with more than 90% of the tissue fragment consisted of pulmonary alveoli. The animals that were exposed to ovalbumin, showed an increase in tissue resistance and elastance after antigen challenge, the number of iNOS positive cells, the of expression of PGF2, of NF-kB and arginase 2 in the alveolar septum well as in the activity of arginase 2, compared to control groups (p <0.001). The treatment with nor-NOHA or 1400W alone in animals exposed to ovalbumin attenuated the tissue elastance and resistance after antigenic challenge (p <0.001), the number of iNOS positive cells (p <0.001), the expression of PGF2, arginase 2 and NFkB in the alveolar septum (p<0.001). However the activity of arginase 2 was reduced in only in the groups that were treated with nor-NOHA and the association of 1400W and nor-NOHA (p <0.05). The combination of 1400W and nor-NOHA, in animals exposed to ovalbumin enhanced the attenuation of the expression of PGF2 in the alveolar septum (p <0.001). Conclusions: The present study suggests that in this experimental model of chronic pulmonary inflammation, inhibition of arginase 2 plays an important role in the modulation of constrictor responses and oxidative stress in the distal lung parenchyma. The association of iNOS inhibition to the arginase 2 enhances the control of oxidative stress response. These responses are, at least in part, modulated by the activation of NF-kB. The inhibition of these enzyme pathways may represent a future strategy for the treatment of patients with severe asthma and difficult to control

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

O objetivo do trabalho foi avaliar o estresse oxidativo pós-trauma cirúrgico, através da ativação da NF-<font face=\"symbol\">kB (in vivo), em ratos wistar, utilizando o método de imunohistoquímica em tecido não desmineralizado. Os resultados indicaram uma semelhança entre os grupos Implante, irrigado e adrenalectomizados. Porém, nos grupos dexametasona e composto orgânico, houve uma diferença estatística significante: observou-se um aumento expressivo no primeiro e uma redução no segundo. Dessa forma, conclui-se: 1- Que o método de imunohistoquímica pode ser aplicado em tecido ósseo não descalcificado incluído em Technovit® 7200 VLC; 2- Os implantes de titânio, neste período de poucas horas, não permanecem em sua posição; 3- O composto orgânico foi efetivo na redução da imunorreatividade da NF-<font face=\"symbol\">kB, reduzindo significativamente a ativação da NF-<font face=\"symbol\">kB em cortical dos animais; 4- A utilização da dexametasona como anti-inflamatório em tratamentos pré-cirúrgicos precisa ser melhor estudada. / The purpose of this work was to evaluate the oxidative stress after surgical trauma, through the activation of the NF-<font face=\"symbol\">kB (in vivo), in wistar rats, using immunohistochemistry method on non-demineralized tissue. The results indicate a similarity among the irrigated and adrenalectomized groups of implants. The group using dexamethasone and the organic compound though presented a significant statistical result showing an expressive increase and a reduction in the second group.Conclusions: 1- The immunochemistry method may be applied on non-decalcified bone tissue which are included on Technovit® 7200VLC. 2- The titanium implants studied in this period did not maintain its position in the bone tissue showing therefore that they integrate to the bone. 3- The organic compound was effective to reduce the immunoreactivity of NF-<font face=\"symbol\">kB with a significative reduction of the activity of this endonuclease in the bone cortical region on the studied animals. 4- More studies are required for the use of dexamethasone as an anti-inflammatory medicament on pre-surgical treatments.

No presente estudo avaliou-se a atividade quimiopreventiva da tributirina (T), pró-fármaco do ácido butírico (AB) e presente naturalmente em leite e derivados, quando administrada a ratos Wistar durante as etapas de iniciação e seleção/promoção do modelo de hepatocarcinogênese do \"Hepatócito Resistente\" (RH). Os animais receberam diariamente, durante 8 semanas consecutivas e por entubação gástrica: T (200 mg/100 g de peso corpóreo [p.c.]; grupo TB) ou maltodextrina (300 mg/100 g de p.c.; grupo MD; controle isocalórico). Duas semanas após o início dos tratamentos, os grupos foram submetidos ao modelo do RH. Esse consistiu na aplicação intraperitoneal de uma dose do agente iniciante dietilnitrosamina (DEN, 20 mg/100 g de p.c.), seguida, 2 semanas após, da aplicação de 4 doses consecutivas de 2-acetilaminofluoreno (AAF; 2 mg/100 g de p.c.) e de uma hepatectomia parcial (HP) a 70%, acrescida de 2 doses de AAF (2 mg/100 g de p.c.) 2 e 4 dias após a cirurgia. Decorridas 6 semanas após a iniciação com DEN, os animais foram eutanasiados administrando-se, entretanto, 2 horas antes desse procedimento 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) (10 mg/100 g de p.c.). De acordo com a análise macroscópica dos fígados, e em comparação ao grupo MD, verificou-se que o grupo TB apresentou menor multiplicidade (p &lt; 0,05) e tamanho (p &lt; 0,05) de lesões pré-neoplásicas (LPN) hepáticas. Em relação à análise morfométrica das LPN hepáticas positivas para a enzima glutationa S-transferase forma placentária (GST-P) totais (persistentes + em remodelação) e também nas LPN hepáticas GST-P positivas persistentes, observou-se que em comparação ao grupo MD, o TB apresentou menor tamanho (p &lt; 0,05) e área do corte ocupada (p &lt; 0,05) por essas lesões. O grupo TB apresentou maior porcentagem (p &lt; 0,05) de LPN hepáticas GST-P positivas em remodelação e maior número (p &lt; 0,05) de corpúsculos apoptóticos (CA) nessas LPN em comparação ao MD. Não houve diferenças (p &gt; 0,05) entre os grupos MD e TB em relação à proliferação celular e aos danos no DNA. De acordo com a imunoistoquímica para p53, o grupo TB apresentou menor porcentagem (p < 0,05) de LPN hepáticas totais e persistentes positivas para a proteína, comparado ao MD. O grupo TB apresentou menor ativação (p &lt; 0,05) do fator nuclear-kB (NF-kB) quando comparado ao MD. O grupo TB tendeu a apresentar maior acetilação de histona H3 resíduo de lisina 9 (H3K9) em relação ao grupo MD. A T apresentou atividade quimiopreventiva promissora quando administrada a ratos Wistar diariamente e durante 8 semanas, abrangendo as etapas de iniciação e seleção/promoção do modelo de hepatocarcinogênese do RH. Inibição de LPN hepáticas GST-P positivas persistentes, indução da remodelação e da apoptose, além de normalização da função de p53, inibição da ativação do NF-kB e indução da acetilação de H3K9 parecem estar envolvidas com as ações anticarcinogênicas da T. / Chemopreventive activity of tributyrin (T), a butyric acid prodrug found in milk and its derivatives, was evaluated during the initial phases of the \"Resistant Hepatocyte\" (RH) model of hepatocarcinogenesis. During 8 consecutive weeks, rats received T (200 mg/100 g body weight; TB group) or maltodextrin (M; 300 mg/100 g body weight; MD group; isocaloric control). Two weeks after the beginning of the treatments, the animals received one dose of diethylnitrosamine (DEN; 20 mg/100 g body weight) for initiation. Two weeks later, the animals received six doses of 2-acetylaminofluorene (AAF, 2 mg/100 g body weight), 4 consecutive doses before partial (2/3) hepatectomy and the remaining, two and four days after surgery. All animals were euthanized 6 weeks after DEN administration. Two hours before euthanasia, rats received 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) (10 mg/100 g body weight). Multiplicity and area of visible hepatocyte nodules/animal were smaller (p &lt; 0,05) in TB group, compared to MD group. Mean area and % liver section area occupied by total (persistant + remodeling) hepatic placental glutathione S-transferase (GST-P) positive preneoplastic lesions (PNL) and persistant hepatic GST-P positive PNL were smaller (p <&lt; 0,05) in TB group, compared to control group. Compared to MD group, TB group presented increased (p &lt; 0,05) % of remodeling hepatic GST-P positive PNL and increased number of apoptotic bodies in these PNL. No differences (p gt; 0,05) were observed between MD and TB groups regarding cell proliferation and DNA damage. TB group presented reduced (p &lt; 0,05) % of total and persistant PNL p53 positive compared to MD group. TB group presented reduced (p < 0,05) nuclear factor-kB (NF-kB) activation in comparison with MD group. Lysine 9 acetylation site in H3 (H3K9) tended to be increased in TB group compared to MD. These results indicate that T represents promising chemopreventive agent against hepatocarcinogenesis when administered to Wistar rats during 8 consecutive weeks on initial phases of RH model. Persistant hepatic GST-P positive PNL inhibition, remodeling and apoptosis induction, p53 function normalization, inhibition of NF-kB activation and H3K9 acetylation can be involved with antineoplastic T actions.

A proteína dermicidina (DCD) é codificada por um gene localizado na porção 12q13 do cromossomo 12, presente apenas em primatas e humanos. A proteína é secretada por células de glândulas da pele, melanócitos, neurônios e células epiteliais da mama normal. Alguns estudos inciais revelaram a participação da proteína DCD em processos oncogênicos nos carcinomas de mama, próstata e melanoma pela sua capacidade de atuar como um fator de crescimento e sobrevivência celular. Nos estudos realizados no nosso laboratório mostramos que a DCD é expressa em células normais da pele, placenta, cérebro e em vários tumores, incluindo os carcinomas de mama e melanoma maligno. Ensaios biológicos e bioquímicos mostraram que o \"knockdown\" da expressão de DCD no melanoma maligno G-361 via RNA de interferência (RNAi) diminuiu significativamente o crescimento in vitro em cultura celular e a formação de tumores em camundongos Nude. Resultados similares foram obtidos quando camundongos Nude transplantados com células de melanoma G-361 foram tratados com anticorpos policlonais de coelhos contra a proteína DCD. Para compreender melhor o papel da proteína DCD na transformação de células de melanoma G-361 foram feitos ensaios de microarranjo de DNA para identificar os genes diferencialmente expressos entre as sublinhagens pLKO (controle) e IBC-I que expressa o shRNA para o mRNA da DCD. Entre os 374 genes alterados pelo silenciamento, encontramos 162 com expressão aumentada e 212 com a expressão reduzida. Os estudos de bioinformática pelo software MetaCore mostraram que o silenciamento do gene DNA modula as vias canônicas e redes de sinalização mediadas pelo receptores e ligantes da família BAFF/APRIL que contralam a ativação do fator de transcrição NF-kB, bem como para histonas envolvidas na remodelação da cromatina. Os níveis de expressão de mRNA de 9 genes de interesse foram validados por ensaios de RT-qPCR. Em uma segunda fase do estudo, foram analisadas as proteínas presentes em extratos nuclares dos clones pLKO e IBC-I de melanoma maligno G-361 por espectrometria de massas. Nos extratos proteicos da sublinhagem pLKO foram identificadas 74 proteínas nucleares, enquanto que na sublinhagem IBC-I foram identificadas 31 proteínas. Um grupo de 21 proteínas foi identificado em ambas sublinhagens. Estudos de bioinformática pelo programa STRING revelou que 14 das proteínas identificadas na sublinagem G-361-pLKO faziam interações diretas ou indiretas com a DCD. A rede formada por estas proteínas tem como centro a proteína p53, uma proteína chave na regulação do programa de morte celular e sobrevivência ao estresse oxidativo. Por outro lado, notou-se que a maioria das proteínas identificadas no extrato nuclear da sublinhagem IBC-I é da família das histonas e que poderiam atuar em complexos de remodelação da cromatina nas células G-361-IBC-I. Nossos resultados nos possibilitaram sugerir que futuros estudos sobre a expressão das histonas e suas modificações pós-traducionais poderão ajudar a desvendar o possível papel da DCD na regulação epigenética do melanoma e em outros tipos de cânceres / Dermcidin (DCD) is a human gene mapped to chromosome 12q13 region, only identified in primates and humans, and normally expressed in the eccrine glands of skin and brain. Several studies have confirmed that DCD-derived peptides contribute to innate and immune surveillance and in the oncogenic processes of breast, prostate and skin cancers, as revealed by its role as a growth factor and cell survival. We have further explored DCD function and its tumorigenic potential on skin melanocytes by specifically knocking down its expression in G-361 malignant melanoma cells via expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA. Biological and biochemical assays showed that the \"knockdown\" in the expression of DCD in G-361-pLKO control clone and a G-361-IBC-I clone expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA decreased significantly the in vitro growth in cell culture and tumor formation in nude mice. Similar results were obtained treating nude mice bearing G-361 melanoma xenografts with rabbit polyclonal antibodies against DCD protein. Here, we present a DNA microarray-based study that identified the genes that are up- and down-regulated in a G-361-pLKO control clone and a G-361-IBC-I clone expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA. A total of 372 genes differentially expressed were identified; being 162 genes up-regulated and 212 genes down-regulated. Bioinformatic studies showed that DCD gene silencing modulates canonical pathways and signaling networks mediated APRIL/BAFF receptors and ligands and NF-kB signaling pathway as well as chromatin remodeling mediated by histone family. The mRNA expression levels of 9 genes of interest were validated by RT-qPCR assays. Next we analyzed the proteins present in nuclear extracts from G-361- pLKO and G-361-IBC-I clones by mass spectrometry. We identified 74 proteins in the G-361-pLKO clone and 31 proteins in the G-361-IBC-I. A group of 21 proteins was identified in both sublineages. Bioinformatics analyses by STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) platform showed that a small portion of the proteins identified only in G-361- pLKO cells was predicted to interact directly with DCD. The network formed by these proteins is centered in the p53 protein, a key regulator of survival and cell death program in response to DNA damage and oxidative stress. On the other hand, this network was completed abrogated using the nuclear protein from G-361-IBC-I because of absence of DCD protein. Since most of the proteins identified in nuclear extracts are of the histone family, it is likely that they are acting in the chromatin-remodeling complexes which are important to remodel nucleosomes of the G-361-IBC-I cells. Our results allowed us to suggest that future studies on the expression of histones and their posttranslational modifications may help to unravel the possible role of DCD in the epigenetic regulation of melanoma and other cancers

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.