Cette étude a analysé l’influence qu’exerce le vieillissement sur les mécanismes du sommeil chez le rat. Dans un premier temps, nous avons abordé le rôle joué par la NO-synthase inductible (iNOS) dans la régulation du sommeil paradoxal (SP). Nous rapporterons que l’injection d’un inhibiteur spécifique de la iNOS dans le tegmentum latérodorsal (LDT), inhibe l’apparition du SP chez le rat âgé (24 mois) mais pas chez l’adulte (4 mois). Cet effet est antagonisé par une injection secondaire d’un donneur de NO. Les corps cellulaires exprimant la iNOS sont localisés dans des noyaux voisins du LDT, mais, seuls des prolongements neuronaux expriment la iNOS dans ce noyau. Aucune expression de la iNOS n’est apparente dans le cerveau du rat adulte. Ces résultats sont la première preuve du rôle joué par la iNOS dans la régulation du SP chez l’animal âgé. Nous avons ensuite comparé la capacité des rats adultes et âgés à répondre à un stress d’immobilisation sur le plan polysomnographique. Les résultats obtenus confirment que, chez le rat adulte, le stress d’immobilisation d’une heure, imposé en début de période d’obscurité, provoque un rebond de SP. Chez l’animal âgé, au contraire, le stress d’immobilisation reste sans effets sur les états de veille et de sommeil. Enfin, nous avons tenté de mettre en évidence si l’agomélatine, un antidépresseur de nouvelle génération, était capable de compenser l’absence de rebond de SP observée chez l’animal âgé après un stress d’immobilisation. Les résultats obtenus indiquent que l’agomélatine, administrée au début de la période d’obscurité pendant 3 jours consécutifs, pouvait vraisemblablement favoriser la réapparition d’un rebond de SP / This study analysed the influence exerted by aging on the rat sleep-wake cycle. We first considered the part played by the inducible NO-synthase (iNOS) in the regulation of paradoxical sleep (PS or REM sleep). We report that the injection of an iNOS inhibitor, within the laterodorsal pontin tegmentum (LDT), suppresses the occurrence of PS in the aged animals (24 months), but not in the adult ones (4 months). This effect can be reversed by a secondary injection of a NO donor. While the cell bodies expressing the iNOS are localized in the structures neighbouring the LDT, only nerves ending impinge this nucleus. The iNOS is not expressed in the brain of the adult rat. These data constitute the first demonstration of the part played by the iNOS in the regulation of PS in the aged animal. Afterwards, we compared the ability of adult and aged rats to reply to an immobilization stress by a sleep rebound. Data obtained confirm that a sleep rebound occurs after a 1h immobilization stress in the adult rat. In the same conditions, such a sleep rebound is not observed in the aged animal. Finally, we checked whether agomelatine, a new type of antidepressant, was able to compensate the loss of the sleep rebound observed in the aged rat after an immobilization stress. Data obtained indicate that agomelatine, administered at the beginning of the dark period during 3 consecutive days, might facilitate the occurrence of a sleep rebound related to stress in the aged rat

Depuis sa découverte, le monoxyde d'azote n'a pas cessé d'intéresser la communauté scientifique. Sa biosynthèse est catalysée par les NO Synthases, qui est une famille de trois isoenzymes. La NOS neuronale et la NOS endothéliale sont constitutives et produisent du NO impliqué dans la neurotransmission et la vasodilatation respectivement. La NOS inductible quant à elle produit du NO impliqué dans la réponse immunitaire innée. Une surproduction de monoxyde d'azote est impliqué dans de nombreuses pathologies comme les maladies neuro-dégénératives ou les maladies chroniques à composantes inflammatoires. L'inhibition de iNOS et nNOS présente donc un grand intérêt thérapeutique. Cependant l'enjeu est de développer des inhibiteurs hautement sélectifs, afin de préserver les fonctions vitales de eNOS.Nous avons choisi de synthétiser des composés constitués d'un analogue de substrat tel que thiocitrulline et S-alkyl-isothiocitrulline auquel est ajouté, par un lien peptidique ou hétérocyclique, un résidu susceptible de se lier dans le canal d'accès du substrat, région moins conservée du site actif pouvant fournir des interactions spécifiques. La synthèse de ces composés a été réalisée sur support solide selon une méthode d'ancrage par la chaîne latérale développée au laboratoire, ou pour certains composés, selon une méthode classique d'ancrage par l'amine alpha, ces deux méthodes offrant un fort potentiel en chimie combinatoire. Les différents composés synthétisés ont été testés sur les trois isoformes recombinantes.Un second travail est brièvement exposé dans ce manuscrit. La synthèse de cyclopeptides basés sur le motif RGD impliqué dans la liaison aux intégrines a été réalisée selon un mode de cyclisation développé au laboratoire faisant intervenir la formation d'un pont guanidine qui sera ensuite diversement substitué. L'étude RMN et l'évaluation de leur activité biologique sur les récepteur opioïdes semble montrer un influence de la substitution du pont sur leur conformation et leur activité. / Since its discovery, Since its discovery, the nitric oxide did not stop interesting the scientific community. Its biosynthesis is catalyzed by NO synthases, a family of three isoenzymes. Neuronal NOS and endothelial NOS are constitutive and produce NO involved in neurotransmission and vasodilation process respectively. Inducible NOS produces NO involved in the innate immune response. An overproduction of nitric oxide is involved in many diseases such as neurodegenerative diseases or chronic diseases with inflammatory components. Thus, its inhibition should be of high therapeutical interest. However, it is necessary to develop highly selective inhibitors to preserve the vital functions of eNOS.We chose to synthesize compounds constituted of one substrate analogue as thiocitrulline or S-alkyl-isothiocitrulline which linked by a peptide bond or heterocycles to a residue able to bind into the substrate access channel, a less conserved region into the active site were specific interactions could be established. The synthesis of these compounds was performed on solid support according to an anchoring method through the side chain developed at the laboratory or, for some compounds, according to a conventional anchoring method through the alpha amine. These approaches are particulary interesting for a combinatory chemistry approach. All compounds were tested on the three recombinant isoforms.A second work is outlined in this manuscript. It consist of synthesizing cyclopeptides based on RGD motif involved in the binding to integrins and enkephalins analogues. The cyclisation method was developed in the lab and involves the formation of a guanidine bridge diversely substituted. NMR studies and biological evaluations on opioid receptor suggests that the diverse bridge substitutions could modulate the conformation and activity of the peptides.

Neuroprotektion und Verbesserung der zerebralen Durchblutung stellen die beiden zentralen therapeutischen Ansätze für den ischämischen Schlaganfall dar. In dieser Arbeit stellen wir ein neues experimentelles Konzept vor, welches das neuronale und endotheliale Zytoskelett als therapeutisches Target zur Schlaganfallbehandlung identifiziert. Ungebremster intrazellulärer Kalziumeinstrom durch aktivierte N-methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoren und spannungsabhängige Ca++-(VDCC)-Kanäle ist ein entscheidender Trigger für den Zelltod nach Schlaganfall. Die Aktivität dieser Kanäle wiederum wird dynamisch durch Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts modifiziert, welches u.a. durch das aktindegradierende Protein Gelsolin vermittelt wird. Neurone, denen Gelsolin fehlt (Gelsolin-Null), zeigen einen vermehrten Zelltod und erhöhten Ca++-Einstrom nach Sauerstoff/Glukose Deprivation und weiterhin erhöhte zytosolische Ca++-Spiegel in den Nervenendigungen nach Depolarisation in vitro. Nach transienter zerebraler Ischämie wiesen Gelsolin-Null Mäuse deutlich größere Infarkte im Vergleich zu den Kontrollen auf. Eine akute Behandlung mit Cytochalasin D, einem Pilztoxin, das spezifisch Aktinfilamente depolymerisiert, reduzierte das Schlaganfallvolumen in Gelsolin-Null und Wildtypmäusen auf das gleiche Volumen. Gelsolinaktivierung und Aktindepolymerisierung schützen somit vor Exzitotoxizität und Zelltod nach zerebraler Ischämie. Ein entscheidender Regulator des zerebralen Blutflusses ist die endotheliale NO Synthase (eNOS). Mäuse, denen dieses Enzym fehlt (eNOS-Null Mäuse), entwickeln grössere Infarkte nach fokaler zerebraler Ischämie. In unserer Arbeit zeigen wir, daß das G-Protein Rho Veränderungen im Zytosklett von Endothelzellen bewirkt, die zur eNOS Herunterregulierung führen. Die Behandlung von Mäusen mit Rho Inhibitoren, wie Statinen (HMG-CoA Reduktasehemmern), C3 Transferase von C. botulinum, oder aber mit dem (oben genannten) aktindepolymerisierenden Toxin Cytochalasin D führten zu einer höheren eNOS Aktivität, vermehrtem zerebralem Blutfluß und kleineren Infarkten nach zerebraler Ischämie. Diese neuroprotektiven Effekte konnten nicht in eNOS-Null Mäusen erzielt werden, was dieses Enzym als den entscheidenden Effektor dieses prophylaktischen Ansatzes identifiziert. Zusammenfassend stellen sowohl das neuronale Zytoskelett (durch Schutz vor Ca++-Influx) als auch das endotheliale Zytoskelett (über einen eNOS-abhängigen Mechanimus) ein neurartiges Target zur Schlaganfalltherapie dar. Diese ermöglichen neuartige Behandlungsstrategien sowohl in der Akutphase als auch zur Prophylaxe. Insbesondere die Tatsache, daß mit den Statinen bereits zugelassene spezifische Therapeutika zur Verfügung stehen, unterstreicht die unmittelbare klinische Relevanz der Untersuchungen. / Neuroprotection and reperfusion are the basic therapeutic concepts for the treatment of ischemic stroke. Here, we present a novel strategy which identifies both the neuronal and endothelial cytoskeleton as potential therapeutic targets. Increased Ca++ influx through activated NMDA receptors and voltage-dependent Ca++ channels (VDCC) is a major determinant of cell injury after brain ischemia. The activity of these channels is modulated by dynamic changes in the actin cytoskeleton, which may occur in part through the actions of the actin filament-severing protein gelsolin. We show that gelsolin null neurons have enhanced cell death and rapid, sustained elevation of Ca++ levels after glucose/oxygen deprivation as well as augmented cytosolic Ca++ levels in nerve terminals after depolarization in vitro. Moreover, major increases in infarct size are seen in gelsolin null mice after reversible middle cerebral artery occlusion compared to controls. In addition, treatment with cytochalasin D, a fungal toxin that depolymerizes actin filaments, reduced the infarct size of both gelsolin null and control mice to the same final volume. Hence, enhancement or mimickry of gelsolin activity may be neuroprotective during stroke. Cerebral blood flow is regulated by endothelium-derived nitric oxide (NO), and endothelial NO synthase-deficient (eNOS-/- "knockout") mice develop larger cerebral infarcts following middle cerebral artery (MCA) occlusion. We report that the small G-protein rho mediates disruption of the endothelial actin cytoskeleton that leads to upregulation of eNOS. Mice treated with Rho inhibitors like statins (HMG-CoA reductase inhibitors), C3 transferase from C. botulinum, or with the actin cytoskeleton disruptor cytochalasin have higher eNOS expression and activity, increased cerebral blood flow and smaller ischemic lesions following MCA occlusion. No neuroprotection was observed with these agents in eNOS-/- mice. These findings suggest that therapies which target the endothelial actin cytoskeleton may have beneficial effects in ischemic stroke. Both the neuronal and the endothelial actin cytoskeleton were identified as novel therapeutic targets following cerebral ischemia stroke. This may have implications for the treatment and prophylaxis of ischemic stroke in man.

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Le diabète de type 2, défini par une hyperglycémie chronique, résulte d'un déficit de la sécrétion d'insuline et d'une insulinorésistance. Durant le prédiabète qui précède la maladie, la cellule ß pancréatique est capable d'établir une hyperactivité sécrétoire compensatrice de l'insulinorésistance. Les NO synthases neuronales (nNOS) pancréatique et musculaire contrôlent respectivement la sécrétion d'insuline induite par le glucose dans la cellule ß et la force contractile, la captation et l'utilisation du glucose dans les myocytes. Dans le modèle génétique du rat obèse Zucker fa/fa mimant l'état prédiabétique associant un hyperinsulinisme et une insulinorésistance, nous avons retrouvé au niveau de la cellule ß une forte augmentation du complexe entre la nNOS et son inhibiteur endogène PIN (Protein Inhibitor of Neuronal NOS) au niveau des granules de sécrétion d'insuline. Ce complexe, grâce à une interaction accrue avec la myosine V, participe à l'hyperactivité sécrétoire de la cellule ß pancréatique. En effet, des molécules inhibant spécifiquement l'interaction nNOS-PIN permettent de rétablir, chez le rat fa/fa, une sécrétion d'insuline normale. Au niveau musculaire, nous avons observé, dans ce modèle animal, une diminution d'expression de la nNOS sans variation du taux d'ARNm, traduisant une protéolyse accrue de la protéine. L'inhibition de la dégradation protéasomale permet de restaurer l'expression et l'activité catalytique de la nNOS dans le muscle squelettique. Cette perte de fonctionnalité de l'enzyme participerait à l'installation de l'insulinorésistance. Ces travaux ont permis de valider la nNOS comme une cible potentielle pour la prévention du diabète de type 2. / Type 2 diabetes is a chronic disorder defined by chronic hyperglycemia resulting from a deficiency of insulin secretion and an insulin resistance in peripheral tissues and liver. A long lasting silent phase, called prediabetes, precedes the disease and in which pancreatic ß cell is able to improve insulin secretion to compensate for the insulin resistance. The pancreatic and muscular neuronal nitric oxide synthases (nNOS) control respectively glucose-induced insulin secretion in pancreatic ß cell and glucose uptake and utilization in myocytes. In the genetic model of obese Zucker fa/fa rat mimicking the prediabetic state characterized by hyperinsulinemia and insulin resistance, we found a high increase in the amount of the complex between nNOS and its endogenous inhibitor PIN (Protein Inhibitor of Neuronal NOS) at the level of insulin secretory granules within the ß cell. This complex, through an increased interaction with myosin V, participates in the secretory hyperactivity of the pancreatic ß cell, observed in this model of prediabetes. Indeed, molecules that specifically inhibit nNOS-PIN interaction allow to restore a normal insulin secretion in fa/fa rat. In skeletal muscle of this model, we observed a decreased expression of nNOS protein with no change in mRNA levels, suggesting an increased proteolysis of the protein. Inhibition of proteasomal degradation restores the expression and the catalytic activity of nNOS in skeletal muscle. Thus, this loss of functionality of the enzyme could participate in the installation of insulin resistance. This work therefore validated nNOS as a potential target for the prevention of type 2 diabetes.

Intaktes Endothel und die ausreichende Funktion der endothelialen NO-Synthase (eNOS) sind Voraussetzungen für gesunde Gefäße. Eine endotheliale Dysfunktion besteht bei Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren bzw. manifester koronarer Herzerkrankung (KHK). Endotheliale Vorläuferzellen (EPC) sind ein wichtiger Faktor für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Endothels. Im klinischen Teil der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Vorläuferzellen mit zunehmender Schwere der KHK in geringerem Maß im Blut zirkulieren. Die Anzahl der EPC war bei Patienten mit einer koronaren 3-Gefäßerkrankung um 77 % geringer, die Anzahl der kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) um 50,3%, jeweils verglichen mit Patienten ohne KHK. Bei diesen Patienten konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich die Konzentration des endogenen eNOS-Inhibitors asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) im Plasma mit zunehmender Schwere der KHK erhöhte (0,47 ± 0,02 μmol/l bei fehlender KHK gegenüber 0,58 ± 0,02 μmol/l bei koronarer 3-Gefäßerkrankung). ADMA ist über eine Hemmung der eNOS an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer endothelialen Dysfunktion beteiligt. Über diesen Weg wird vermutlich auch die Funktion der EPC erheblich eingeschränkt. Dies konnten wir anhand der In­vitro­Versuche mit EPC gesunder Spender zeigen. Dabei reduzierte sich unter ADMA-Einfluß die Anzahl der EPC in Kultur, die Anzahl und Größe der CFUs und ihre Funktion bzw. ihre Fähigkeit, sich in gefäßähnliche Strukturen zu integrieren. Eine gleichzeitige Gabe des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Rosuvastatin wirkte in all diesen In-vitro-Versuchen der hemmenden Wirkung von ADMA entgegen. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals eine inverse Korrelation zwischen ADMA-Spiegeln und der Anzahl und Funktion der EPC. Der negative Einfluss auf EPCs ist vermutlich ein wichtiger Mechanismus, über den ADMA der Entstehung und dem Fortschreiten kardiovaskulärer Erkrankungen Vorschub leistet. / Endothelial progenitor cells play a pivotal role in regeneration of injured endothelium, thereby limiting the formation of atherosclerotic lesions. Reduced numbers of EPCs may affect progression of coronary artery disease. Regulation of EPC mobilization and function is mediated in part by nitric oxide (NO). Endogenous inhibitors of NO synthases, such as ADMA, contribute to endothelial dysfunction and injury. We tested the hypothesis that asymmetric dimethylarginine (ADMA) may be an endogenous inhibitor of endothelial progenitor cells (EPCs). We used flow cytometry and in vitro assays to investigate the relationship between EPC number and function with ADMA plasma levels in patients with stable angina. The plasma concentration of ADMA was related to the severity of coronary artery disease and correlated inversely with the number of circulating CD34+/CD133+ progenitor cells (r = -0.69; p < 0.0001) and endothelial colony forming units (CFUs) (r = -0.75; p < 0.0001). Adjusting for all patient characteristics, we confirmed these findings in multivariate regression analyses. In vitro differentiation of EPCs was repressed by ADMA in a concentration-dependent manner. Compared with untreated cells, ADMA reduced EPC incorporation into endothelial tube-like structures to 27 +/- 11% (p < 0.001). Asymmetric dimethylarginine repressed the formation of CFUs from cultured peripheral blood mononuclear cells to 35 +/- 7% (p < 0.001). Asymmetric dimethylarginine decreased endothelial nitric oxide synthase activity in EPCs to 64 +/- 6% (p < 0.05) when compared with controls. Co-incubation with the hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase inhibitor rosuvastatin abolished the detrimental effects of ADMA. CONCLUSIONS: Asymmetric dimethylarginine is an endogenous inhibitor of mobilization, differentiation, and function of EPCs. This contributes to the cardiovascular risk in patients with high ADMA levels and may explain low numbers and function of EPCs in patients with coronary artery disease.

L’arbre bronchique constitue une large interface avec le milieu extérieur ce qui en fait notamment une sentinelle immunologique. Par ailleurs, il est soumis à de multiples contraintes physiques (variation de pressions lors du cycle ventilatoire) avec le développement de pathologies lorsque la réponse à ces contraintes est inadaptée. Au cours de ce travail, nous avons essayé de caractériser la réponse bronchique des voies aériennes distales à partir d’un modèle isolé de bronche humaine soumis à l’application d’un stretch unique ou cyclique tel qu’il est généré lors de la ventilation mécanique. D’un point de vue fonctionnel, le stretch unique ou cyclique s’accompagne d’une modification significative du tonus basal de la bronche avec deux étapes : l’une précoce apparaît au cours de l’exposition même des variations de tension pariétale, l’autre est tardive et apparaît à l’arrêt de l’étirement. Concernant l’étape précoce, elle se révèle robuste car aucun pré-traitement et particulièrement l’abrasion de l’épithélium ne la supprime totalement. La caractérisation de cette réponse implique notamment la voie des NO synthases et des Rho-A kinase. La réponse tardive fait quant à elle intervenir l’épithélium ainsi que la voie des NO-synthase suggérant un rôle prépondérant du NO. Par contre, ces modifications de force au repos sont indépendantes de la sécrétion de médiateurs inflammatoires détectés par ELISA. L’approche génétique renforce par contre le rôle du tissu de soutien bronchique en activant la synthèse de collagène (MMP-9). Au total l'application d'une contrainte cyclique renforce la bronchoconstriction par inhibition de la voie des NOsynthases et de la mécanotransduction. / The tracheo-bronchial tree is a true immunologic sentinel related to the huge interface with the external environment. Moreover, it is submitted to variable physical strains (tidal ventilation and variation in pressure) and an excessive response leads to the genesis of some pathology as hyperresponsiveness. The aim of this work on an isolated organ model was to characterize the human bronchial response to a single or repetitive and physiological stretch as observed during mechanical ventilation. From a functional perspective, a single strain or a cyclic stretch significantly increased the basal tone of the human bronchus with a two-step response: the early response appears during cycling and the delayed after the stretch has ceased. The early response is robust then no pre-treatment and especially epithelial removal totally inhibits it. This response implies NO synthase and Rho-A kinase pathway with a reduction of the developed basal tone with these inhibitors. As it concerns the late response, it involved epithelium and NO synthase suggesting a prominent action of NO. Inflammatory mediators are not directly involved in the rise of basal tone because stretch-induced secretion as detected with ELISA is very low. Genomic approach transiently activates transcription of genes for MMP-9, involved in the collagen production and consequently in the support tissue of the bronchial tree. As a conclusion, cyclic stretch enhances bronchoconstriction by inhibition of the NO-synthase pathway and mechanotransduction.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La découverte d’oxyde nitrique synthases (NOS) chez les bactéries a imposé un questionnement quant à la fonction de l’oxyde nitrique (NO) chez les microorganismes. Chez les mammifères, le NO remplit des fonctions de signalisation et de stress pour lesquelles il n’y a aucun équivalent chez les bactéries. Des études ont démontré que in vitro, comme chez les NOS animales (mNOS), les NOS bactériennes (bNOS) peuvent catalyser la conversion du L-arginine en L-citrulline et libérer du NO. Cependant, il a été découvert que les bNOS de Deinococcus radiodurans et Streptomyces turgidiscabies pouvaient catalyser la nitrosation de groupements trytophanyles. Jusqu’à maintenant ces études soutiennent l’hypothèse que les bNOS synthétisent du NO lors d’un processus de catalyse semblable à celui des mNOS. Cependant, elles indiquent que sa fonction pourrait être de modifier une molécule au site du cofacteur. Nous avons proposé l’étude des propriétés cinétiques et structurales des bNOS de Bacillus subtilis (BsNOS) et Staphylococcus aureus (SaNOS) afin d’investiguer le mécanisme catalytique des bNOS, d’approfondir les connaissances de la catalyse chez les NOS en général et d’explorer les particularités de ces enzymes susceptibles de révéler leur fonction. Nos études ont porté sur les caractéristiques structurales du site actif de SaNOS et BsNOS, sur les cinétiques de formation et de disparition du complexe oxygéné chez SaNOS, sur les interactions des substrats avec les ligands de l’hème et sur le rôle du cofacteur chez les bNOS. Nos résultats montrent que SaNOS et BsNOS peuvent catalyser les mêmes réactions biochimiques que les mNOS et apportent des éléments nouveaux permettant de mieux comprendre le mécanisme d’activation du complexe oxygéné, une étape cruciale à la catalyse. Par ailleurs, certaines ressemblances observées entre SaNOS, BsNOS et les mNOS ont révélé des propriétés conservées chez ces enzymes qui sont importantes pour la production et la fonction du produit synthétisé. Notamment la spécificité des interactions des différents substrats avec les ligands de l’hème et la déformation de la molécule d’hème. Cependant des différences reliées aux effets structuraux du cofacteur ont été observées et s’ajoutent à celles découvertes chez les autres bNOS qui indiquent que la fonction de ces enzymes pourrait se distinguer de celle des mNOS. / The discovery of nitric oxide synthases (NOS) in bacteria has raised many questions regarding the function nitric oxide (NO) might fulfill in prokaryotes. In mammals, NO is implicated in signal and stress events for which no equivalent functions exist in bacteria. In vitro studies have revealed that, like mammalian NOS (mNOS), bacterial NOS (bNOS) catalyze the hydroxylation of L-arginine to L-citrulline and release NO. In addition, it has been shown that the bNOS of Deinococcus radiodurans and Streptomyces turgidiscabies catalyse the nitrosation of tryptophanyl compounds. As of now these studies support the hypothesis that bNOS synthesize NO in a catalytic process similar to the one described for mNOS. However, these studies also indicated that the newly synthesized NO might be used to modify a molecule bound to the cofactor binding site. We proposed the investigation of the kinetic and structural properties of the bNOS of Bacillus subtilis (BsNOS) and Staphylococcus aureus (SaNOS) to probe the catalytic mechanism of bNOS, deepen our understanding of catalysis in NOS and explore the distinctive features of these new enzymes that might reveal their function. Our studies targeted the structure of the active site of SaNOS and BsNOS, the kinetics of formation and decay of the oxygenated complex of SaNOS, the interactions of the substrates with heme-bound ligands and the function of the cofactor in bNOS. Our results support the proposal that bNOS are able to catalyze the same biochemical reactions than those carried out by mNOS and bring new information that provide us with a better understanding of the mechanism of oxygen activation, a crucial step during catalysis. In addition the observation of some similarities between SaNOS, BsNOS and mNOS revealed conserved features in these enzymes that are important for the synthesis and function of the product. Notably the specificity of the interactions the two substrates make with the heme-bound ligands and the deformation of the heme molecule. Meanwhile structural differences related to the cofactor have been observed, and in addition to those observed in the other bNOS, point to a novel function for these enzymes.

Des études récentes ont montré que les produits de glycation avancée (AGE) pouvaient jouer un rôle dans la pathogénèse des troubles vasculaires en insuffisance rénale. Nous avons alors émis l’hypothèse que l’augmentation de la concentration des AGE observé dans le cas d’insuffisance rénale joue un rôle important dans la pathogenèse de l’hypertension artérielle, entre autres, en aggravant la dysfonction endothéliale et les dommages vasculaires. De plus, nous croyions que les effets des AGE sur la dysfonction endothéliale sont causés par l’activation des récepteurs RAGE sur les cellules vasculaires. Pour vérifier ces hypothèses nous avons étudié dans un premier temps l’effet du S100b, un agoniste des récepteurs des AGE (RAGE), sur la réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium au carbachol et la réponse vasoconstrictrice à la phényléphrine et l’ET-1 sur des segments d’aorte de rats in vitro montés dans des bains à organe, et, dans un deuxième temps, l’effet du S100b sur la fonction endothéliale, notamment l’expression de la NO synthase endothéliale (eNOS) et la production des radicaux libres de l’oxygène (ROS). Les résultats obtenus indiquent que le S100b induit une diminution de la réponse vasorelaxante dépendante du NO au carbachol. Par contre, le S100b entraine une augmentation de la réponse vasoconstrictrice à la phényléphrine. Ce dernier effet n’est pas modifié dans les vaisseaux dénudés de l’endothélium, ni l’inhibition de la production de NO dans les vaisseaux intacts. L’effet du S100b est néanmoins atténué en présence d’indométacine, un inhibiteur de la cyclo-oxygénase, suggérant que l’activation des RAGE module la production de certaines eicosanoides. Enfin, le S100b induit une diminution de la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1 qui est bloquée en présence de L-NAME, un inhibiteur de la production de NO. Ces derniers résultats indiquent que l’effet du S100b sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1 dépend de la relâche de NO. Par ailleurs les résultats obtenus sur des segments d’aorte de rats et des cellules endothéliales en culture indiquent que le S100b n’affecte pas la production de ROS dans les segments d’aorte, bien qu’il stimule leur production dans les cellules endothéliales isolées. Par contre, le S100b tend à augmenter l’expression de la eNOS dans l’endothélium des vaisseaux en culture. En conclusion, la stimulation des RAGE avec le S100b affecte la réponse aux agents vasoconstricteurs et vasodilatateurs sur des segments d’aorte de rats normaux de façon dépendante et, possiblement, indépendante de l’endothélium. Ces effets seraient causés, en partie, par la modulation de la relâche de NO et de l’expression de la eNOS, ainsi que par la production d’eicosanoides et de ROS et, possiblement, l’activation du système endothélinergique. Ainsi, les AGE peuvent affecter le tonus vasculaire en modifiant la fonction endothéliale. / Recent studies suggest that advanced glycation end products (AGEs) could play an important role in vascular pathogenesis in kidney disease. We hypothesized that increased AGEs concentrations in kidney disease play an important role in the pathogenesis of arterial hypertension, by increasing endothelial dysfunction and vascular damages. Furthermore, we believe that the effects of AGEs on endothelial dysfunction are caused by the activation of AGEs receptors (RAGE) on vascular cells. To test this hypothesis, we studied first the effect of S100b, an AGEs receptor agonist, on the endothelium dependent vasodilatation response to carbachol and the vasoconstriction response to phenylephrine and ET-1 on rats thoracic aorta segments in vitro placed in organ bath, and, secondly, the effect of S100b on the endothelial function, especially the expression of endothelial NO synthase (eNOS) and the production of reactive oxygen species (ROS). Our results indicate that S100b induces a decrease in the NO dependent vasodilatation response to carbachol, but an increase in the vasoconstriction response to phenylephrine. This effect of S100b on phenylephrine response is not modified in vessels without endothelium, nor following the inhibition of the NO production in intact vessels. The effect of S100b is however decreased with indometacine, a cyclooxygenase inhibitor, suggesting that RAGE activation modulates the production of eicosanoids. Finally, S100b induces a decrease in the vasoconstriction response to ET-1 that is blocked in presence of L-NAME, a NO production inhibitor. These results indicate that the effect of S100b on the vasoconstriction response to ET-1 is dependent on NO release. In addition, results obtained on cultured rat aorta segments and endothelial cells indicate that S100b does not affect the production of ROS althouch it stimulates their production in isolated endothelial cells. Otherwise, S100b tend to increase the expression of eNOS in the endothelium of cultured vessels. In conclusion, the stimulation of RAGE by S100b affects the response to vasoconstrictors and vasodilators agents on intact rat thoracic aorta segments in an endothelium dependant and, possibly, independent manner. These effects may be related, in part, to the modulation of NO release and eNOS expression, the production of eicosanoids and ROS, and, possibly, the activation of the endothelinergic system. Thus, AGEs could affect vascular tone through the modulation of the endothelial function.

Le tissu musculaire squelettique contribue considérablement au maintien de l’homéostasie du glucose chez l’humain. Que ce soit en situation postprandiale ou lors d’un travail musculaire, le muscle squelettique capte de grandes quantités de glucose sanguin à des fins d’entreposage ou de production d’énergie. Les voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation du transport du glucose à l’intérieur de la cellule musculaire sont nombreuses et complexes. En présence de désordres physiologiques et/ou métaboliques, de nombreux médiateurs chimiques et enzymatiques peuvent interagir avec les différentes protéines de ces voies de signalisation et entraîner des perturbations importantes au niveau de l’homéostasie du glucose. Notre première étude nous a permis de confirmer l’implication de la protéine AMPK dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire. L’AMPK est un senseur énergétique important activé dans le muscle squelettique au cours d’un effort physique. Toutefois, son rôle dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire demeure controversé. Grâce à un modèle murin d’invalidation génétique de l’AMPK spécifique au tissu musculaire et à l’élaboration d’un protocole de contraction ex vivo approprié, nous avons établi l’importance de l’AMPK dans la régulation du transport du glucose. Notre seconde étude nous a permis de démontrer que l’incubation ex vivo prolongée du muscle épitrochléen modifie l’expression du transporteur de glucose GLUT1. Nous avons également observé l’induction de la protéine iNOS et la production du NO. Parallèlement, nous avons mesuré une augmentation de l’expression de GLUT1 à la suite d’une exposition au NO dans un modèle de cellules musculaires ainsi qu’une augmentation du transport basal du glucose. L’ensemble de nos résultats nous permet de consolider le lien causal entre la production du NO et la modulation de l’expression de GLUT1 et potentiellement, le développement de perturbations au niveau du métabolisme du glucose musculaire.