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<p> The Notch signalling pathway is a lateral inhibition pathway that serves to limit the number of cells in a proneural cluster (a group of equipotent cells) that will adopt a neural cell fate during neurogenesis in Drosophila. The proper segregation of neural and epidermal progenitor cells during neurogenesis requires the expression of both the proneural genes and the neurogenic genes. Expression of proneural genes, such as achaete, gives cells the potential to commit to a neural cell fate. The neurogenic genes encode proteins that act in the Notch signalling cascade and are required for cell fate determination during Drosophila neurogenests. Notch and Delta are neurogenic genes that encode large transmembrane proteins. Interaction between the extracellular domains of Notch and Delta is thought to transmit a signal to the nucleus by way of the DNAbinding Suppressor of Hairless protein. In response to Notch activation Suppressor of Hairless is translocated to the nucleus where it activates the transcription ofthe neurogenic genes ofthe Enhancer of split complex (E(spl)-C). The products of the E(spl)-C are bHLH transcription factors. They possess a Cterminal tryptophan-arginine-proline-tryptophan (WRPW) motif that interacts with the product of another neurogenic gene, groucho. The groucho gene product encodes a protein containing a WD40 repeat element. When bound to Groucho, E(spl) bHLH proteins are able to repress transcription of proneural genes, such as achaete, thereby directing the cell to adopt a non-neural cell fate.</p> <p> A number of murine groucho homologues have been identified and named Grg's (Groucho related genes). Three full length Grg proteins have been identified which contain all five domains found in the Drosophila Groucho protein. Two short Grg proteins have also been identified which only contain one of the domains found in the full-length Grg proteins. A number of murine homologues of the Drosophila E(spl)-C have also been identified and named Hes (Hairy/Enhancer of split) proteins. Like the gene products of the Drosophila E(spl)-C, the Hes proteins are bHLH proteins containing a C-terminal WRPW motif. One of the Hes proteins, Hes3, is lacking a basic domain and therefore lacks the DNA-binding activity possessed by the other Hes proteins. </p> <p> Attempts were made to detect interactions between Grg and Hes proteins using co-immunoprecipitation techniques. The anti-WD40 antibody, which recognizes the long WD40-containing Grg proteins, was able to specifically immunoprecipitate 35S-labelled Grgl . This antibody was also able to recognize WD40-containing Grg proteins present in Pl9 cell extracts. However, attempts to co-immunoprecipitate radiolabelled Hesl and AMLlb proteins with Grg proteins present in P19 cell extract were unsuccessful due to the low affinity of the antiWD40 antibody and the background caused by the binding of the test proteins to Sepharose. A second method of co-immunoprecipitation was attempted using an HA-tagged Grgl fusion protein and a commercially available anti-HA antibody. The attempt to co-immunoprecipitate 35S-labelled Hesl with radiolabelled HAtagged Grg 1 was unsuccessful due to a high degree of background caused by Hesl binding to protein G Agarose. Using the Yeast Two-Hybrid interaction assay, the WD40-containing Grg proteins, Grgl and Grg4, were found to interact with Hesl. However, using the same assay WD40-containing Grg proteins were found not to interact with Hes3, which lacks DNA-binding activity. A Western blot was performed to determine if the Hes3 fusion proteins were being expressed in transformed yeast but none were detected. This may have been due to the poor affinity of the anti-GAL4 activation domain antibody. A similar Western blot demonstrated that the Grg proteins, fused to the GAL4 DNA binding domain, were being expressed in transformed yeast extract. The WD40-containing Grg proteins, Grgl and Grg4, were also found not to interact with AMLlb, a protein which contains a C-terminal VWRPY domain which is reminiscent of the Cterminal WRPW interaction domain found in Hes proteins and Drosophila E(spl) proteins. However, WD40-containing Grg proteins were able to interact with an AML 1 b mutant in which the VWRPY motif was mutated to VWRPW in the Yeast Two Hybrid assay. </p> / Thesis / Master of Science (MSc)

La préséniline1 (PS1) lorsqu'elle est mutée, cause la maladie d'Alzheimer sous forme héréditaire. Cette protéine est impliquée dans diverses voies de signalisation, particulièrement la voie de Notch et de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP). L'objectif de ce travail était d'étudier la relation entre ces deux voies. Pour ce faire, nous voulions créer une banque d'ADNc à partir de cellules qui surexpriment une portion du gène Notch pour ensuite la cribler par la méthode du double hybride de levure. Malheureusement, nous n'avons pu créer la banque d'ADNc. Cependant nous avons criblé une banque commerciale d'ADNc de cerveau embryonnaire humain en utilisant les sondes constituées par le domaine N-terminal de PS1 (1-132) ainsi que le domaine intracellulaire d'APP (AICD). Différents partenaires ont été identifiés avec les 2 sondes. Parmi ceux-çi, un clone ayant le potentiel de relier les voies de Notch et APP a été identifié avec la sonde AICD.

L'anémie de Fanconi (FA) est caractérisée par une aplasie médullaire, un risque accru de développer des cancers, ainsi que plusieurs types de malformations congénitales. La voie de NOTCH1 est impliquée dans l'embryogenèse et le maintien des cellules souches hématopoïétiques (HSC), qui sont déréglés chez les patients FA. Puisque les voies signalétiques de l'anémie de Fanconi et de NOTCH1 jouent un rôle essentiel dans l'hématopoïèse et le développement, nous avons étudié les liens qui existent entre les protéines FA et Hairy Enhancer of Split 1 (HES1), un effecteur de la voie de NOTCH1. Nous avons montré une interaction entre l'effecteur HES1 et le complexe FA, nécessaire à l'intégrité de la voie de l'anémie de Fanconi. Nos résultats indiquent également que la protéine HES1, en plus d'être un partenaire du complexe FA, est une cible de son activité E3 ubiquitine ligase. De plus, nous avons montré que le complexe FA est un co-régulateur de l'expression génique des cibles de l'effecteur HES1, en bloquant la formation du complexe de répression transcriptionnelle HESl-TLE/Gro. Finalement, l'étude fonctionnelle de l'interaction du complexe FA avec HES1 nous a permis de comprendre l'inter-relation qui existe entre les voies signalétiques de l'anémie de Fanconi et de NOTCH1, par le biais de l'effecteur HES1.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24997号 / 医博第5031号 / 新制||医||1069(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 藤田 恭之, 教授 羽賀 博典, 教授 武藤 学 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

This thesis is related to the field of digital signal processing; where the aim of this research is to develop features of an infinite impulse response adaptive notch filter capable of tracking multiple complex sinusoid signals. Adaptive notch filters are commonly used in: Radar, Sonar, and Communication systems, and have the ability to track the frequencies of real or complex sinusoid signals; thus removing noise from an estimate, and enhancing the performance of a system. This research programme began by implementing four currently proposed adaptive notch structures. These structures were simulated and compared: for tracking between two and four signals; however, in their current form they are only capable of tracking real sinusoid signals. Next, one of these structures is developed further, to facilitate the ability to track complex sinusoid signals. This original structure gives superior performance over Regalia's comparable structure under certain conditions, which has been proven by simulations and results. Complex adaptive notch filter structures generally contain two parameters: the first tracks a target frequency, then the second controls the adaptive notch filter's bandwidth. This thesis develops the notch filter, so that the bandwidth parameter can be adapted via a method of steepest ascent; and also investigates tracking complex-valued chirp signals. Lastly, stochastic search methods are considered; and particle swarm optimisation has been applied to reinitialise an adaptive notch filter, when tracking two signals; thus more quickly locating an unknown frequency, after the frequency of the complex sinusoid signal jumps.

Nous avons au cours de notre travail de thèse tenté de préciser les outils nécessaires àamplifier le potentiel lymphocytaire T de précurseurs hématopoïétiques chez l’Homme. Aucours de la différenciation lymphoïde T deux facteurs semblent importants, Notch et l’IL7.Nous avons étudié le rôle de l’IL7 et de Notch au cours de la différenciation T humaine. Nousavons montré que seule l’IL7 est indispensable à la différenciation des thymocytes immatureshumains. L’activation de la voie Notch potentialise la survie et la prolifération induite parl’IL7 des CD34+TN et des CD4 ISP. Notch maintien l’expression de la chaîne α de l’IL7Rmalgré la présence de l’IL7. Une étude épigénétique a montré que Notch est capable d’induirela déméthylation du promoteur de l’IL-7Rα permettant son expression.Les résultats obtenus avec les cellules CD34+ de sang de cordon ont montré que Notch etnon l’IL7 était indispensable à la différenciation au moins dans les stades précoces. Lesdifférences entre les thymocytes et les CD34+ de sang de cordon ne semblent pas êtreexpliquées par une expression différente des récepteurs Notch. Le système de différenciationdes cellules CD34+ de sang de cordon permet aussi d’augmenter le potentiel T in vitro.Nos données confirment le rôle indispensable de Notch et de l’IL7 dans la différenciationT avec toutefois des implications différentes selon l’origine des précurseurs et du stade dedifférenciation. La poursuite de l’étude du rôle de ces deux signaux au cours de l’ontogénie Thumaine permettrait de définir les conditions de culture optimale à l’amplification dupotentiel T des précurseurs CD34+ dans une optique d’utilisation en thérapeutique humaine / In this work, we have attempted to define tools for amplifying the T lymphocyte potentialof hematopoietic precursor cells in man. Notch and IL7 are important factors for Tlymphocyte differentiation. We have studied the roles of IL7 and Notch during human T celldifferentiation. We have shown that only IL7 is essential for differentiation of humanimmature thymocytes. Notch pathway activation potentiates IL7 induced CD34+ TN and CD4ISP survival and proliferation. Notch maintains IL7Rαchain expression in spite of thepresence of IL7. Epigenetic study showed that Notch is able to induce IL7RαpromoterdemethylationOur results on cord blood CD34+ cells showed that Notch, but not IL7, was essential fordifferentiation, at least in early stages. Differences between thymocytes and cord blood cellsCD34+ cells do not seem to be accounted for by different Notch receptor expression. Inaddition, cord blood CD34+ cell differentiation system increases in vitro T lymphocytepotential.Our data confirm the essential role of Notch and IL7 in T cell differentiation, with somediffferences between these two factors according to precursor origin and differentiation stage.Continuation of this study on the role of these signals in human T cell ontogeny would help indefining optimal culture conditions fot T lymphocyte potential amplification from CD34+precursors, in the perspective of therapeutical use in man

Les voies de signalisation sont des moyens de communication intercellulaires très conservées au cours de l'évolution qui contrôlent tous les aspects du développement des organismes multicellulaires. La signalisation par les récepteurs Notch oriente les destins cellulaires au cours du développement embryonnaire et régule l'homéostasie des tissus. Dans les cellules normales, l'activation de la voie Notch est soumise à une régulation très stricte, ayant pour enjeu de maintenir un équilibre au sein des tissues entre prolifération et différenciation. Cependant des disfonctionnement de la voie Notch sont à l'origine de l'augmentation de la prolifération cellulaire, perturbant ainsi cet équilibre et aboutissant à la transformation maligne des cellules. Le rôle central de NOTCH1 dans l'oncogenèse humaine est soutenu par la présence de mutations activatrices de la voie dans plus de 50% des leucémies aigues lymphoblastiques T (LAL-T), ainsi qu'un large éventail de cancers hématopoïétiques et de tumeurs solides. Au cours des dernières décennies, d'importants progrès ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes de transduction du signal Notch et l'identification des processus biologiques qui sont influencés par la voie Notch. Les fonctions physiologiques et pathologiques de NOTCH1 requièrent sa translocation dans le noyau, mais ses partenaires nucléaires et leurs rôles dans la tumorigénèse restent peu connus. De même, les mécanismes moléculaires par lesquelles Notch active la transcription des gènes cibles de la voie restent à élucider.Afin de comprendre les fonctions nucléaires de Notch dans un contexte tumoral, nous avons, par une approche protéomique, caractérisé les complexes protéiques associés à la forme oncogénique de NOTCH1 à partir d'extraits nucléaires de cellules leucémiques T humaines. Nos travaux, associant des approches biochimiques et fonctionnelles, mettent en évidence le rôle central de plusieurs enzymes et facteurs nucléaires dans le contrôle de l'activité transcriptionnelle et les fonctions oncogéniques de Notch.La perturbation de l'expression de plusieurs facteurs nouvellement identifiées induit un arrêt du cycle cellulaire et altère la prolifération in vitro des cellules cancéreuses portant des mutations de la voie Notch. De façon remarquable, l'inhibition des partenaires de NOTCH1 est capable de supprimer la croissance tumorale de cellules leucémiques humaines dans un modèle de xénogreffe murin. Ces travaux auront un impact important dans le développement des nouvelles stratégies capables d'interférer avec les fonctions oncogéniques de Notch et pourraient s'avérer utile dans le traitement des cancers humains. / Activating mutations in NOTCH1, an essential regulator of T-cell development, are frequently found in human T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). However, the precise mechanisms by which Notch causes T-ALL are not fully understood. While several target genes regulated by Notch have been identified in thymocytes and T-ALLs, little is known about the identity of NOTCH1 interacting partners that are required for its oncogenic activity. Using an improved tandem affinity chromatography method, followed by mass spectrometry, we have purified the intracellular active form of NOTCH1 (ICN1) and its nuclear cofactors in human T-ALL cells. We identified and validated a large set of proteins associated with ICN1, including transcriptional activators, repressors and protein-modifying enzymes. Moreover, we found that NOTCH1 interacts with lineage-specifying transcription factors and components of other signaling pathways that could cooperate to confer a specific program of gene expression. This work represents the first comprehensive analysis of Notch partners in the nucleus and provides a framework to elucidate Notch functions and regulation.We subsequently used Notch nuclear interactome as resource to expand our understanding of how ICN1 orchestrates target gene activation. Biochemical and functional experiments demonstrated that Notch activation in T-ALL cells leads to the assembly of a large multisubunit complex in the nucleus containing ICN-CSL-MAML1 as a core subunit and several classes of transcriptional regulators that act at different steps of the transcriptional activation process. These include the transcriptional activator AF4p12, the histone demethylases LSD1 and PHF8, and the SWI/SNF nucleosome remodeling complex PBAF, all of which are required for expression of Notch-responsive genes. We found that PBAF recruitment to Notch-target enhancers facilitates transcription in a chromatin context, probably through the remodeling of nearby nucleosomal structures, while LSD1 and PHF8 act through their demethylase activity to promote local epigenetic modifications. In the presence of Notch, PHF8 demethylates the repressive dimethyl H3 lysine-27 (H3K27me2) mark and LSD1 removes the repressive H3K9me2 mark from Notch-responsive enhancers to promote gene expression. However, LSD1 is also associated with CSL corepressor complex in the absence of Notch and contributes to CSL-mediated repression of Notch targets by removing the activating H3K4me2 mark, suggesting that LSD1 plays a dual role in Notch signaling regulation. AF4p12 is a poorly-characterized protein that was first identified as one of the MLL translocation partners in leukemias. While its precise role awaits further investigation, our results indicate that AF4p12 is required for RNAPII recruitment at several Notch-target genes, therefore acting as a transcriptional coactivator of ICN1. Importantly, we found that Notch cofactors are recruited to Notch-responsive genes in primary developing T cells and are required for Notch-mediated tumor growth in a xenograft T-ALL model. Thus, this newly characterized Notch-activation complex controls both Notch developmental and oncogenic functions in immature T-cells.In addition, our preliminary data provide insights into regulation of ICN1 stability and identify several protein-modifying enzymes as potential regulators of Notch signaling. Moreover, we propose that non-canonical Notch activities, as well as extensive crosstalk with lineage-specifying transcription factors, might shape the repertoire of Notch regulated genes, therefore contribute to Notch oncogenic functions in T-ALL cells.The identification of Notch-associated proteins in T-ALL uncovered novel aspects of Notch signaling and provided a powerful tool for dissecting mechanisms of Notch function and regulation that could be translated into new therapeutic approaches.

CRMP5 appartient à la famille des Collapsin Response Mediator Protein. Ces protéines sont très exprimées dans le cerveau en développement et les zones de neurogénèse chez l'adulte. Dans un contexte tumoral, l'expression des messagers de CRMP5 émergent dans un cluster de gènes associés à la plus faible survie des 20 patients suivis, et à la prolifération (Liang et al., 2005). Nous avons confirmé ces résultats dans une série rétrospective de 183 GBM où la forte expression protéique de CRMP5 est corrélée à une plus faible survie des patients (7.14 mois vs 10 mois) ; de plus les tumeurs exprimant fortement CRMP5 présentent un index mitotique 2 fois plus important (p = 0.0009) que les tumeurs exprimant faiblement CRMP5. Dans des cultures primaires ou lignées cellulaires de GBM nous montrons que la prolifération des glioblastomes est dépendante de l'expression de CRMP5 et de la voie de signalisation Notch. Des analyses en western blot démontrent que CRMP5 protège les récepteurs Notch de la dégradation lysosomale. Nous avons approfondi ce mécanisme et montré une nouvelle voie de régulation de Notch par CRMP5 qui par une interaction protéique avec Numb, l'inhibiteur de Notch empêche la dégradation du récepteur. Parallèlement, l'analyse en immunohistochimie sur les biopsies de GBM montrent une forte expression Notch et sa cible Hes1 dans les tumeurs exprimant fortement CRMP5. Ces résultats montrent la corrélation entre l'expression de CRMP5 dans les GBM, l'activation de la voie Notch et la faible survie des patients. Le ciblage de l'interaction CRMP5-Numb est une stratégie potentielle pour un traitement ciblé des glioblastomes / CRMP5 belongs to the Collapsin Response Mediator Protein family, highly expressed in the developing brain and in adult brain neurogenesis areas. In pathology, we identified CRMP5 as a marker of aggressivity in neuroendocrine lung tumors (Meyronet et al, 2008) while Liang et al (2005) using transcriptomic analysis of 20 Glioblastomas, revealed CRMP5 in a cluster of genes related to proliferation correlated with a poor overall survival. We confirmed these results at the protein level in a retrospective serie of 183 GBMs and correlated higher CRMP5 expression with a significantly lower median survival (7.14 months) than those with negative expression (10 months) (p=0,026).Furthermore, GBM with higher CRMP5 expression were characterized by a higher mitotic index. CRMP5 knockdown (siRNA) in primary culture from GBM xenograft and in the GBM cell line GL15 showed a dependence of GBM cell proliferation for CRMP5 expression. Notch signaling pathway expression and activation was found post-translationally dependent of CRMP5 expression. These results are enlightened by a clinical study showing a poor expression of Notch 1 and Hes1 in CRMP5-negative tumours compared to CRMP5-positive GBM. Mechanistically, we show a novel regulation of the Notch signaling pathway in GBM by CRMP5 counteracting Numb-dependent Notch receptors degradation by a direct protein interaction. These results show that CRMP5 expression in GBM activates Notch signalling pathway to promote proliferation and poor survival. Targeting CRMP5-Numb interaction is a promising strategy for future glioblastoma treatment