Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription régulant l’expression de gènes impliqués dans plusieurs processus physiologiques. En général, ces récepteurs sont activés par une interaction avec un ligand spécifique, mais leur activité peut également être modulée par des modifications post-traductionnelles comme la SUMOylation. Notre laboratoire a récemment trouvé que le récepteur des estrogènes ER est une cible de cette modification sur un site de SUMOylation atypique nommé pSuM. Ce site non-consensus se retrouve également sur Nor-1, un récepteur nucléaire impliqué dans une variété de processus physiologiques comme le métabolisme du glucose, la prolifération cellulaire ainsi que la survie neuronale. Pour l’instant, le rôle de ce motif atypique reste inconnu et aucune évidence n’indique que Nor-1 est SUMOylé dans la littérature. Nos objectifs étaient donc de déterminer le potentiel de SUMOylation de Nor-1 sur son pSuM dans un contexte neuronal et de caractériser l’effet de la SUMOylation sur l’activité transcriptionnelle de Nor-1 ainsi que l’expression de gènes cibles. Nos résultats ont démontré que Nor-1 peut effectivement être SUMOylé sur son pSuM, que cette SUMOylation est dépendante d’une phosphorylation de la sérine-139 et que la voie des MAPK augmente l’état global de SUMOylation de Nor-1 ainsi que son expression protéique. De plus, les résultats ont indiqués que Nor-1 peut conjuguer deux isoformes de SUMO, soit SUMO-1 et SUMO-2. Les résultats démontrent également que la SUMOylation augmente l’activité transcriptionnelle de Nor-1 et que la SUMOylation de son site pSuM est importante pour le maintien de son activité transcriptionnelle basale. Nos résultats préliminaires suggèrent que la SUMOylation du pSuM de Nor-1 affecte l’expression de gènes cibles comme l’énolase-3 ce qui propose un rôle de la SUMOylation de Nor-1 dans la régulation du métabolisme des neurones. En conclusion, les résultats de ce projet permettent d'identifier un nouveau processus de SUMOylation impliqué dans la régulation des récepteurs nucléaires et de Nor-1 suggérant un rôle de ce processus de SUMOylation atypique dans plusieurs réseaux géniques et processus physiologiques. / Nuclear hormone receptors are transcription factors that regulate the expression of many genes implicated in a wide variety of physiological functions. They are generally activated by an interaction with a specific ligand but their activity can also be modulated by post-translational modifications such as SUMOylation. Recently, our laboratory identified ER as a SUMOylation target on an atypical SUMOylation motif named pSuM. This non-consensus SUMOylation motif was also found on Nor-1, a nuclear receptor implicated in physiological processes such as glucose metabolism, cellular proliferation and neuronal survival. Until now, the function of this pSuM motif is still unknown and there are no evidence that Nor-1 is a target of SUMOylation. Therefore, the objectives of this work were to determine the SUMOylation potential of Nor-1 on his pSuM in a neuronal context and to characterize the effect of SUMOylation on Nor-1 transcriptional activity and target genes expression. Our results showed that Nor-1 can indeed be SUMOylated on his pSuM, that this SUMOylation was dependent on serine-139 phosphorylation, and that the MAPK pathway augmented the global SUMOylation state of Nor-1 and its protein expression levels. Furthermore, we demonstrated that Nor-1 can conjugate SUMO-1 and SUMO-2. Our results also indicated that SUMOylation activates the transcriptional activity of Nor-1 and that the pSuM site of Nor-1 was important in maintaining its basal transcriptional activity. Preliminary results suggests that Nor-1 SUMOylation on the pSuM has an impact on the expression of target genes such as enolase-3, suggesting a potential role for Nor-1 in the regulation of the metabolism of neurons. In conclusion, the results presented in this work identify a new SUMOylation process implicated in regulating Nor-1 and nuclear receptors activities, suggesting an extended role of this atypical SUMOylation process in many gene networks and physiological processes.

Afin de répondre correctement aux nombreux changements se produisant à chaque instant dans leur environnement, les cellules utilisent une panoplie de messagers moléculaires dont la synchronisation est essentielle à la signalisation cellulaire appropriée. La superfamille des récepteurs nucléaires compte quarante-huit membres impliqués dans ces processus de signalisation et influence ainsi plusieurs fonctions physiologiques. Les récepteurs nucléaires de la sous-famille NR4A composée de Nur77/NR4A1, Nurr1/NR4A2 et Nor1/NR4A3 sont des facteurs critiques du développement et de la maintenance du système nerveux. Nor1/NR4A3 en particulier est essentiel aux processus de guidage axonal et de survie neuronale au niveau de l’hippocampe. Les NR4A se démarquent des autres récepteurs nucléaires puisqu’ils sont considérés comme des récepteurs orphelins constitutivement actifs, ce qui veut dire qu’ils ne nécessitent pas d’interaction avec un ligand afin d’être activés. Il devient ainsi important d’identifier de nouveaux mécanismes de régulation pour cette sous-famille de récepteur afin d’améliorer notre compréhension et potentiellement contrôler leurs activités dans un contexte neuronal. L’activité des récepteurs nucléaires peut être régulée de plusieurs façons, indépendamment de leur association avec un ligand endogène. Les modifications post-traductionnelles représentent un aspect crucial de la signalisation cellulaire permettant de réguler la fonction des protéines cibles de manière spécifique au contexte. La SUMOylation et la phosphorylation sont des exemples de modifications post-traductionnelles avec le potentiel de réguler l’activité transcriptionnelle, la stabilité et l’expression des gènes cibles des récepteurs nucléaires. Dans cette thèse, l’impact de la SUMOylation retrouvée sur un motif consensus ainsi que sur un motif non-consensus de SUMOylation phosphorylé du récepteur Nor1 est étudié. Dans la première étude, un motif de SUMOylation non-consensus nouvellement découvert sur Nor1 est décrit. Ce nouveau motif nommé pSuM a été identifié pour la première fois sur le récepteur nucléaire des estrogènes ERβ et sur le récepteur farnésoÏde FXR. Nous avons identifié un motif pSuM situé à la lysine 137 de Nor1 qui sert de cible fonctionnelle de SUMO2. Le pSuM se démarque du motif de SUMOylation consensus puisqu’il nécessite une phosphorylation afin d’être SUMOylé. Dans le cas de Nor1, nos résultats démontrent que la sérine 139 est phosphorylée par la voie des MAPK. La SUMOylation sur ce site mène à une réduction de l’activité transcriptionnelle et du recrutement à la chromatine de Nor1 ainsi que de l’expression des gènes sensibles à Nor1. Une particularité intéressante du pSuM de Nor1 est qu’il possède également une extension phosphorylable par la kinase CK2 qui est essentielle au processus de SUMOylation. Cette extension a également un effet sur la stabilité et la compétence transcriptionnelle de Nor1. En utilisant des lignées SH-SY5Y exprimant de manière stable différents mutants SUMO de Nor1, il est démontré que la SUMOylation du pSuM diminue la prolifération et la survie cellulaire en réponse au stress oxydant. Dans la seconde étude, la SUMOylation de Nor1 sur un motif de SUMOylation canonique situé sur la Lysine 89 est caractérisée. Il est démontré que ce site de SUMOylation est ciblé principalement par SUMO1 et qu’il est important afin de maintenir une compétence transcriptionnelle et une stabilité optimale du récepteur. Cette SUMOylation régule également la prolifération et la survie en réponse à un traitement au nocodazole des lignées stables ainsi que la stabilité des microtubules. En conclusion, ces études identifient de nouveaux mécanismes de SUMOylation et phosphorylation utilisés dans la régulation de l'activité du récepteur nucléaire Nor1. Elles permettent également d’approfondir nos connaissances des rôles joués par Nor1 dans la neuroprotection en réponse au stress oxydant ainsi que dans la régulation de la stabilité du réseau de microtubules, ce qui apporte une nouvelle fonction de Nor1. Puisque Nor1 et les autres NR4A sont fortement impliqués dans la formation et maintenance du système nerveux et que les modifications post-traductionnelles peuvent réguler ces fonctions, la découverte et la caractérisation de nouveaux mécanismes de régulation de ces récepteurs ont le potentiel de nous fournir des nouvelles connaissances utiles dans le cadre des maladies neurodégénératives et autres conditions pathologiques. / To answer the many changes happening every instant in its surroundings, cells require a fine-tuned array of molecular messengers to carry on proper signal transduction and homeostasis. The superfamily of nuclear receptors contains forty-eight members implicated in a wide variety of cellular and physiological functions. The nuclear receptors of the NR4A subfamily containing Nur77/NR4A1, Nurr1/NR4A2 and Nor1/NR4A3 are heavily implicated in the development and maintenance of the nervous system. In particular, Nor1/NR4A3 has been shown to be essential for axonal guidance and neuronal survival in the hippocampus. This subfamily also operates differently from other nuclear receptors as they are considered constitutively active orphan nuclear receptors without known endogenous ligand. Therefore, there is an increasing need to identify critical mechanisms that regulate NR4A nuclear receptors and to better understand the control of their activities in a neuronal context. Nuclear receptor activity can be regulated in various ways independently of their interaction with an endogenous ligand. One is through post-translational modifications which allow the regulation of protein function depending on the cellular context. SUMOylation and phosphorylation are post-translational modifications with the potential to regulate nuclear receptor activity, stability and target gene expression. In this thesis, the impact of a canonical SUMOylation site and a phosphorylation dependant SUMOylation motif on the orphan nuclear receptor Nor1 are studied. In the first study, a newly identified non-canonical SUMOylation motif on Nor1 was described. This new motif named pSuM was first identified on the nuclear estrogen receptor ERβ and farnesoid X receptor FXR. We report that this pSuM is located at Lys-137 on Nor1 and is a target of SUMO2. The pSuM differs from traditional SUMOylation motif since it requires to be phosphorylated for SUMOylation to occur. For Nor1, our evidence showed that the obligate phosphorylation of the pSuM on Ser-139 occurred through the MAPK pathway. SUMOylation of Nor1 pSuM reduced Nor1 transcriptional competence, responsive gene expression and chromatin binding. Interestingly, the pSuM of Nor1 also possesses an extension phosphorylated by the CK2 kinase, which is essential to achieve the SUMOylation process. This extension also affected Nor1 protein stability and transcriptional activity. Using stable SH-SY5Y cell lines expressing different SUMO mutants of Nor1, we also showed that Nor1 pSuM SUMOylation reduced cell proliferation and survival to oxidative stress. In the second study, the SUMOylation of Nor1 on a canonical SUMOylation site found at Lys-89 was characterized. This SUMOylation site was found to be targeted mainly by SUMO1 and to be important in maintaining optimal transcriptional competency and stability of the receptor. This SUMOylation also regulated proliferation and survival to a nocodazole treatment of stable cell lines, as well as microtubule network stability. In conclusion, these studies provide novel mechanisms in the regulation of Nor1 activity by SUMOylation and phosphorylation. They also helped to expand our knowledge on the role played by Nor1 in neuroprotection in response to oxidative stress, as well as in the regulation of microtubule stability, which identified a new function of Nor1. Since Nor1 and other NR4A receptors are implicated in the formation and maintenance of the nervous system, the identification of post-translational modifications as a regulatory mechanism uncovers novel opportunities in our understanding of these receptors and provide new insights for neurodegenerative diseases and other neuropathological conditions.

Les récepteurs nucléaires font partie d’une famille de protéine multigénique agissant comme facteurs de transcription qui, en réponse à la liaison d’un ligand, régulent l’expression de gènes cibles impliqués dans une variété de fonctions physiologiques. Cependant, les récepteurs nucléaires orphelins, qui n’ont pas de ligand connu, peuvent également être régulées par des modifications post-traductionnelles (PTMs) comme la SUMOylation et la phosphorylation. La famille des NR4A, incluant Nurr1, Nur77 et Nor1, sont des récepteurs orphelins dépendant grandement des PTMs au niveau de l’AF-1 afin de moduler leurs activités essentielles dans la différenciation, le développement et le métabolisme des fonctions neurologiques. En particulier, il est connu que les PTMs permettent le recrutement de cofacteurs comme l’isomérase Pin-1, une enzyme recrutée par des motifs phospho-sérine/thréonine-proline qui catalyse l’isomérisation cis/trans du lien avec la proline. Notre laboratoire a récemment identifié un site de SUMOylation atypique nommé pSuM (phosphorylation-dependent Sumoylation Motif) possédant une extension phosphorylable de motif sérine/thréonine-proline au niveau du domaine AF-1 (Activation Function-1) de certains récepteurs nucléaires, soutenant un processus de régulation transcriptionnelle des récepteurs via la SUMOylation et la phosphorylation. Le récepteur Nor1 possède un motif pSuM dont le rôle exact de la SUMOylation et l'implication de Pin-1 comme régulateurs de l’activité de Nor1 dans les mécanismes de neuroprotection reste inconnu. Ainsi nos objectifs sont de déterminer et caractériser le mécanisme de recrutement et l'impact de Pin-1 sur la régulation de Nor1 ainsi que de déterminer le rôle de Pin-1 sur l’expression des gènes cibles impliqués dans la neuroprotection. Nos résultats démontrent que l’isomérase Pin-1 favorise l’expression de gène impliquées dans la neuroprotection comme Eno3, Nrip1 et Atf3 via un mécanisme dépendant de la SUMOylation et de la phosphorylation qui permet la régulation positive de l’activité transcriptionnelle de Nor1 dans un modèle de cellules neuronales de souris. En conclusion, les résultats de ce travail permettent d’identifier l’isomérase Pin-1 comme un nouveau cofacteur de Nor1 impliqué dans le contrôle de l’expression génique associé à la neuroprotection et démontre un mécanisme de régulation de Nor1 par la SUMOylation et la phosphorylation de l’extension du pSuM. / Nuclear receptors are part of a family of multigene proteins acting as transcription factors that, in response to ligand binding, regulate the expression of target genes involved in various physiological functions. However, orphan nuclear receptors, which have no known ligand, can also be controlled by post-translational changes (PTMs) such as SUMOylation and phosphorylation. The NR4A family, including Nurr1, Nur77, and Nor1, are orphan receptors highly dependent on PTMs at the AF-1 domain to modulate their essential activities in the differentiation, development, and metabolism of neurological functions. The PTMs of nuclear receptors allow the recruitment of cofactors such as the Pin-1 isomerase, an enzyme recruited by phospho-serine/threonine-proline motifs that catalyzes the cis/trans isomerization of the proline. Our laboratory has recently identified an atypical SUMOylation site named pSuM (phosphorylation-dependent Sumoylation Motif) characterized by a phosphorylation-sensitive extension of serine/threonine-proline pattern usually present in the AF-1 (Activation Function-1) domain of receptors and providing transcriptional regulation via SUMOylation and phosphorylation. As of now, the role of SUMOylation and Pin-1 as regulators of Nor1 activity in neuroprotection mechanisms remains unknown. Thus, our objectives were to determine and characterize the recruitment mechanism of Pin-1 and its impact on the transcriptional regulation of Nor1 as well as to determine the role of Pin-1 on the expression of target genes involved in neuronal integrity. Our results have shown that Pin-1 isomerase enhances the expression of genes involved in neuroprotection such as Eno3, Nrip1, and Atf3 through a SUMOylation and phosphorylation mechanism that upregulates the transcriptional activity of Nor1 in neuronal cells. In conclusion, this project identifies Pin-1 as a novel cofactor of Nor1 that is regulated by SUMOylation and phosphorylation of the pSuM extension, thus allowing a tight control over the transcription of genes involved in neuroprotection processes.

Les lymphocytes T (LT) CD8 sont un sous-type de cellules immunitaires qui participent à l’élimination des certains agents infectieux et de cellules tumorales. La capacité de réponse des LT CD8 est dépendante de leur état de différenciation. Lors d’une réponse immunitaire, les LT CD8 spécifiques à l’agent infectieux sont activés, se différencient et prolifèrent en LT effecteurs (LTE) qui participent à l’élimination de l’agent pathogène. Les LTE peuvent être distingués en effecteurs de courte durée de vie (SLEC), terminalement différenciés et éliminés par apoptose après l’infection, et en précurseurs des cellules mémoires (MPEC) qui survivent et génèrent les LT mémoires (LTM). Par contre, lors d’une infection chronique ou d’une réponse antitumorale, la persistance antigénique et inflammatoire induisent l’épuisement des LT CD8, soit un état de différenciation caractérisé par des fonctions effectrices et prolifératives diminuées ainsi qu’une forte expression de récepteurs inhibiteurs (RI). Afin d’améliorer les thérapies vaccinales, les traitements antitumoraux et les thérapies lors des infections chroniques, il est important de mieux comprendre la différenciation des LT CD8. Nous avons étudié le rôle de NR4A3 dans la différenciation des LT CD8 chez la souris. NR4A3 est un récepteur nucléaire et un facteur de transcription (FT) dont l’expression est rapidement induite par une stimulation antigénique, mais dont le rôle dans les LT CD8 n’a pas été encore déterminé. Nous avons émis l’hypothèse que l’expression de NR4A3 dans ces cellules suite à une stimulation antigénique contrôle leur différenciation. Premièrement nous avons étudié le rôle du NR4A3 dans la différenciation des LT CD8 lors d’une infection aiguë et avons déterminé que la délétion de NR4A3 dans les LT CD8 augmente la différenciation MPEC, la génération des LTM et la production de cytokines. La régulation de la différenciation des LT CD8 par NR4A3 est transcriptionnelle et, lors des premiers jours postinfection, sa délétion induit un programme transcriptionnel associé avec la différenciation des LTM. De plus, dès les premières heures postactivation, la délétion de NR4A3 favorise l’induction d’un état de chromatine plus ouvert avec une prédiction d’activité augmentée des FT bZIP. Deuxièmement, nous avons étudié le rôle de NR4A3 lors d’une réponse immunitaire antitumorale au cours d’une thérapie cellulaire adoptive (ACT) sous traitement d’anti-PD-L1 (ligand d’un RI) où la meilleure fonctionnalité et persistance des LT CD8 NR4A3 déficients ont été mises à l’épreuve. Ainsi, l’ACT avec des LT CD8 NR4A3 déficients augmente la survie de souris porteuses de tumeurs et les lymphocytes T infiltrants les tumeurs (TIL) NR4A3 déficients sont moins terminalement épuisés et présentent des plus fortes proportions et nombres cellulaires intra-tumoraux. Le profil transcriptomique au niveau de cellules uniques a révélé que les TIL NR4A3 déficients favorisent la génération de progéniteurs distincts et des populations fonctionnelles associées avec le traitement anti-PD-L1. En conclusion, NR4A3 est un régulateur de la fonction et la différenciation des LT CD8 dont l’activité pourrait être modulée afin d’améliorer les stratégies de vaccination ou les thérapies cellulaires. / CD8 T cells are an immune cell population involved in the clearance of different types of infections and the elimination of tumor cells. The response capacity of CD8 T cells depends on their differentiation state. During an immune response, antigen-specific CD8 T cells are activated, differentiate and proliferate into effectors that participate in elimination of the pathogen. Among the pool effectors, there are short-lived effector cells (SLEC) that are terminally differentiated and die by apoptosis after the infection clearance, and the memory precursors effector cells (MPEC) that survive to give rise to memory CD8 T cells. However, during chronic infection or an anti-tumor immune response, antigen persistence and inflammation induce CD8 T cell exhaustion, which is a differentiation state characterized by decreased effector functions and proliferative capacity and an increased expression of inhibitory receptors (IR). Thus, to be able to increase the efficiency of CD8 T cells following vaccination, in the context of antitumoral or during treatment against chronic viral infections, it is important to better understand CD8 T cell differentiation. We studied the role of NR4A3 in CD8 T cell differentiation in mice. NR4A3 in a nuclear receptor and transcription factor (TF), which expression is rapidly induced following antigenic stimulation, but the role of its induction in CD8 T cells was not yet identified. We propose that NR4A3 expression in CD8 T cells following antigenic stimulation controls their differentiation. First, we studied the role of NR4A3 in CD8 T cell differentiation during acute infection and determined that its deletion increases MPEC differentiation, memory generation, and cytokines production. NR4A3 regulates CD8 T cell differentiation at the transcriptional level, and its deletion induces a memory-related transcriptional program early during the immune response (day three post-infection). Moreover, a few hours following the CD8 T cell activation, NR4A3 deletion increased chromatin accessibility, particularly to bZIP TF. Secondly, we studied the role of NR4A3 during the antitumoral response in the context of adoptive cell therapy (ACT) and cotreatment with anti-PD-L1 (ligand of an IR), during which we tested the increased functionality and persistence of NR4A3 deficient cells. ACT with NR4A3-deficient cells increases the survival of tumor-bearing mice. In addition, NR4A3 deficiency increased the frequency of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and decreased T cell exhaustion. Single-cell transcriptional profile of TILs revealed that NR4A3 deficiency induces the generation of a transcriptionally distinct progenitor population and an increase in functional populations associated with the anti-PD-L1 treatment. To conclude, NR4A3 is a new regulator of CD8 T cell differentiation and function whose activity regulation could increase the efficiency of vaccinations and cell therapy treatments.

Les infections virales peuvent demeurer latentes pendant plusieurs décennies et se réactiver pendant des périodes d’immunosuppression. Les receveurs de greffes hématopoïétiques sont particulièrement susceptibles compte tenu de l’immunosuppression importante qui est nécessaire pour prévenir le rejet ou la maladie du greffon contre l’hôte, souvent pendant des périodes prolongées. La plupart de ces infections ne peuvent pas être traitées avec des médicaments antiviraux, et lorsque c’est possible, les traitements peuvent amener de la résistance. L’injection de cellules T spécifiques contre les virus provenant de donneurs sains est un traitement efficace pour traiter ces infections virales potentiellement mortelles ou les cancers qu’elles causent. Cependant, la persistance de ces cellules est limitée en partie par la stimulation antigénique chronique qui cause l’épuisement des cellules T. En éliminant les membres de la famille de récepteurs orphelins NR4A, qui favorisent l’épuisement et limitent la différenciation en cellules mémoires durables, notre but est de rendre ces cellules transférées plus persistantes et efficaces. Nos données à ce jour montrent que l’élimination du récepteur NR4A3 n’ altère pas la différenciation mémoire ni la production de cytokines effectrices. Cependant, l’absence de NR4A3tend à amener une diminution le l’expression du marqueur d’épuisement Tim-3, ce qui suggère que l’on peut prévenir l’épuisement et ainsi améliorer les thérapies cellulaires en ciblant les membres de la famille des récepteurs NR4A. / Viral infections can lay dormant for decades only to reactivate in periods of immune suppression. Transplant recipients are particularly susceptible to these infections as they require intensive immunosuppression to prevent rejection or graft-versus-host-disease, often for the rest of their life. Most of these infections cannot be treated with currently available antiviral medications and those that do can develop resistance. Virus-specific T cells (VSTs) are a treatment that uses expanded T cells to treat these infections by infusing donor cells into patients with life-threatening viral infections and cancers. However, these cells have a limited lifespan in part due to chronic antigen stimulation causing T cell exhaustion and lack of persistence. By knocking out members of the NR4A family of orphan receptors, which favour exhaustion and limit differentiation into long-lasting memory cells, we aim to make these transferred cells more persistent and effective. NR4A3 knockout did not alter memory differentiation or effector cytokine production but did result in a trend towards decreased expression of the exhaustion marker Tim-3, which indicates that targeting members of this family may improve clinically translatable cellular therapies.