O sistema NADPH oxidase é um complexo enzimático gerador de superóxido. O NF-kB é um fator de transcrição envolvido no controle da expressão de diversos genes ligados à resposta inflamatória. Defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g resultam em infecções recorrentes e à susceptibilidade mendeliana a micobacterioses, podendo diminuir a expressão do componente gp91-phox da NADPH oxidase. Estudamos qual é a relação direta do NF-kB e de defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g na regulação dos genes CYBA, NCF1, NCF2 e NCF4 do sistema NADPH oxidase humano em células U937, células B EBV transformadas provenientes de pacientes com EDA-ID, DGC, ou de pacientes com defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g. A expressão dos genes NCF1 e NCF2 foi diminuída em células com defeitos no eixo (IFNGR1 e INFGR2) e em células U937 IkB S32A/S36A. A expressão do gene NCF1 também foi diminuída em células EDA-ID S32I e em células EDA-ID NEMO/IKKg W420X. O NF-kB e os IFNGR1 e INFGR2 são necessários para a expressão dos genes NCF1 e NCF2 e para a ativação do sistema NADPH oxidase humano neste sistema modelo. / The NADPH oxidase system is an enzymatic complex that generates superoxide. The NF-kB is a transcriptional factor involved in the expression of several genes related to the inflammatory response. The IL-12/23-IFN-g axis defects lead to recurrent infections and to the mendelian susceptibility of mycobacterial disease (MSMD), and they can decrease the gp91-phox expression (a NADPH oxidase component). We studied the NF-kB and the IL-12/23-IFN-g axis defects consequences on the regulation of CYBA, NCF1, NCF2 and NCF4 genes of the human NADPH oxidase system in U937 cells, and in B EBV cells from patients with EDA-ID, DGC, or patients with IL-12/23-IFN-g axis defects. The NCF1 and NCF2 gene expression was decreased in IL-12/23-IFN-g axis defects cells (IFNGR1 and INFGR2) and in U937 IkB S32A/S36A cells. NCF1 gene expression was decreased in EDA-ID S32I and in EDA-ID NEMO/IKKg W420X cell lineages. The NF-kB and the IFNGR1 and INFGR2 are necessary for NCF1 and NCF2 gene expression and activation of the human NADPH oxidase in this model system.

La présente étude évalue la capacité de EPA:DHA 6:1, une formulation d’omega-3 capable d’induire la formation continue de monoxyde d’azote par la NO synthase endothéliale, à prévenir l’hypertension et la dysfonction endothéliale induites par l’angiotensine II (Ang II) chez le rat. L’hypertension induite par l’Ang II est associée à une dysfonction endothéliale caractérisée par une altération des composantes de la relaxation et une augmentation des réponses contractiles dépendantes de l’endothélium. L’Ang II augmente le stress oxydant vasculaire et l’expression de NADPH oxydase, COXs, eNOS, et AT1R, alors que SKCa et connexin 37 sont sous-exprimés. EPA:DHA 6:1 prévient l’hypertension, la dysfonction endothéliale et la surexpression des protéines cibles. En conclusion, la consommation chronique de EPA:DHA 6:1 prévient l’hypertension et la dysfonction endothéliale induites par l’Ang II chez le rat, probablement en prévenant le stress oxydant dû à la NADPH oxydase et aux cyclooxygénases. / EPA:DHA 6:1 has been shown to be a superior omega-3 formulation inducing a sustained endothelial NO synthase-derived formation of nitric oxide. This study examined whether chronic intake of EPA:DHA 6:1 prevents hypertension and endothelial dysfunction induced by angiotensin II (Ang II) in rats. Ang II-induced hypertension was associated with endothelial dysfunction characterized by blunted components of relaxation and increased endothelium-dependent contractile responses. Ang II increased the vascular oxidative stress, and the expression of NADPH oxidase subunits, COXs, eNOS, and AT1R whereas SKCa and connexin 37 were down-regulated. Intake of EPA:DHA 6:1 prevented the Ang II-induced hypertension and endothelial dysfunction, and improved expression of target proteins. In conclusion, chronic intake of EPA:DHA 6:1 prevented the Ang II induced hypertension and endothelial dysfunction in rats, most likely by preventing NADPH oxidase and cyclooxygenase-derived oxidative stress.

Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) sont considérés comme des messagers intracellulaires et sont produits principalement par les NADPH oxydases (Nox) dont Nox4 est l'un des représentants. Le dysfonctionnement de Nox4 est relié à de nombreuses pathologies (cancer, athérosclérose, hypertension pulmonaire ou arthrose). La régulation de l'activité NADPH oxydase de Nox4 est encore peu connue. L'objectif de ce travail est d'étudier l'activité NADPH oxydase et diaphorase (initiation du transfert d'électron) de Nox4.<br />Le clonage du gène de Nox4 a mis en évidence deux isoformes protéiques (Nox4A, forme entière et Nox4B, forme délétée d'un domaine de fixation du NADPH). La mise en place de deux modèles d'étude cellulaire (cellules HEK293E) et acellulaire (protéines recombinantes Nox4 tronquées) a permis d'obtenir les résultats suivants:<br />1) L'activité NADPH oxydase de Nox4A surexprimée dans les cellules HEK293E est constitutive et la partie C terminale cytosolique en milieu acellulaire possède une activité diaphorase. Par contre, Nox4B est inactive. <br />2) L'activité NADPH oxydase de Nox4 est inhibée par une série de composés quinones faiblement substitués (benzoquinone, hydroquinone, tMetBQ) et stimulée par d'autres quinones (tBuBQ, tBuBHQ, duroquinone, AA-861). L'implication du calcium et de la 5-lipoxygénase dans le mécanisme d'action des composés AA-861 et tBuBHQ a été écartée. Nos données convergent vers l'hypothèse d'une action directe des quinones sur la partie N terminale membranaire de Nox4.<br />Nous avons donc démontré que l'activité NADPH oxydase de Nox4 n'est pas seulement constitutive mais modulable par différentes quinones. Le mécanisme moléculaire précis reste à définir.

La mutagénèse dirigée et la transfection stable dans le modèle cellulaire X-CGD PLB-985 ont été utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires du dysfonctionnement de l'oxydase dans 3 cas de CGD-X+ (H303N /P304R, D500G, L505R), 1 cas de X–-CGD (S193F) et le rôle de 2 domaines de Nox2 191TSSTKTIRRS200 et 484DESQANHFAVHHDEEKD500. Les mutations H303N, P304R et D500G inhibent l'assemblage et l'activité de l'oxydase. La mutation L505R diminue partiellement l'affinité de Nox2 pour NADPH et son interaction avec p67phox in vitro. Cependant cet acide aminé n'est impliqué dans la fixation directe du NADPH. La boucle D et la région (484-504) sont essentielles à l'activité oxydase. Seule la région C-terminale est impliquée dans l'assemblage de l'oxydase et le transfert électronique du NADPH vers FAD. La boucle D des Nox1/3/4 est fonctionnelle pour l'activité oxidase de Nox2. Le modèle-3D de la partie C-terminale de Nox2 confirme l'importance de l'hélice-alpha dans l'activation du complexe oxydase.

Plant programmed cell death (PCD) is an essential process in plant-pathogen interactions. Importantly, PCD can have contrasting effects on the outcome depending on context. For example, plant PCD in plant-biotroph interactions is clearly beneficial to plants, whereas it could be detrimental to plants in plant-necrotroph interactions. Sclerotinia sclerotiorum is an agriculturally and economically important necrotrophic pathogen. Previous studies have shown that S. sclerotiorum secretes oxalic acid (OA) to enhance Sclerotinia virulence by various mechanisms including induction of PCD in plants. A recent study has also shown that reactive oxygen species (ROS) generation correlates with induction of PCD during disease development. These studies focus on links between ROS, oxalate, and PCD, and how they impact S. sclerotiorum disease development. I examined the involvement of ROS in pathogenic development of S. sclerotiorum. I identified and functionally characterized two predicted S. sclerotiorum NADPH oxidases (Nox1 and Nox2) by RNAi. Both nox genes appear to have roles in sclerotial development, while only Nox1-silenced mutants showed reduced virulence. Interestingly, the reduced virulence of the Nox1-silenced mutant correlated with decreased production of OA in the mutant. This observation suggests that regulation of ROS by S. sclerotiorum Nox1 may be linked to OA. The next study details the phenotype of plants inoculated with an S. sclerotiorum oxalate deficient mutant (A2), which showed restricted growth at the infected site. This response resembles the hypersensitive response (HR), and is associated with plant resistance responses including cell wall strengthening, plant oxidative burst, and induction of defensin genes. Conversely, leaves infected with wild type showed unrestricted spreading of cell death and were not associated with these resistant responses. Furthermore, previous work had shown that a Caenorhabditis elegans anti-apoptotic gene (ced-9) conferred resistance to wild type S. sclerotiorum, while this gene had negligible effects on the phenotype of plant leaves inoculated with A2 mutants. These findings suggest that HR-like cell death by A2 and PCD by wild type S. sclerotiorum may be regulated by different pathways. As a whole, these results reveal the importance of ROS, oxalate, and PCD in Sclerotinia disease development as well as the significance of interplay between them. These studies contribute to the understanding of the underlying mechanisms of Sclerotinia disease.

Based on the linear relationship between concentration of H2O2 and the decrease of electrochemiluminescence (ECL) intensity in a Ru(bpy)32+/TPA system, procedures for the indirect determination of glucose with a flow injection analysis were developed. By passing solutions of glucose through a FIA system containing a glucose oxidase (GOx) immobilized sol-gel column and an ECL system of Ru(bpy)32+ and TPA, glucose can be determined optimally with a detection limit of 1.0 £gM in a linear dynamic range of 1.0 ¡V 200.0 £gM. A repetitive injection of glucose (100 £gM) and human serum solutions gave satisfactory reproducibility with relative standard deviations of 1.3 (N=31) and 3.9 % (N=42) respectively. Interference due to the presence of ascorbic acid, uric acid or other reducible agents in solution can be corrected by passing sample solutions through another sol-gel column that contained no GOx. From the agreement between the contents of glucose in human serum and soft drink analyzed by the developed method and those obtained by the spectroscopy method based glucose assay kit and satisfactory recovery of glucose from interferent containing solutions, the feasibility of the developed method for real sample analysis was confirmed. One of the major purposes of this study was to develop new immobilization approaches and flow cell designs for the fabrication of regenerable ECL-based sensors with improved sensitivity, convenience and long-term stability. Silica particulates were used as immobilization support in ECL sensors for TPA and NAD(P)H and in biosensors for glucose and glucose-6-phosphate¡]G6P¡^. The first ECL flow cell was fabricated from a glass tube, and a platinum wire was used as working electrode held at +1.3 V. The volume of the flow cell was about 50 £gL. An Ag/AgCl electrode and a piece of Pt wire were used as the reference and counter electrode respectively and placed downstream of the working electrode. Ru(bpy)32+ immobilized silica particulates with 1/3 silica sol content showed the best performance for TPA determination, and the sensitivity of TPA determination was dependent upon the amount of Ru(bpy)32+ immobilized in silica particulates. The lowest level of analyte detected for TPA was 0.02£gM, and linear range was from 0.02£gM to 5£gM. Up to a certain concentration level, it was found that Ru(bpy)32+ was tightly held in silica particulates and did not leach out into aqueous solutions, even with continuous flow for up to ten hours. Ru(bpy)32+ immobilized silica particulates were characterized of well activity and high stability; that stored at 0¢J exhibited its original activity for up to one year. The second ECL flow cell was fabricated from a piece of epoxy block supported Pt electrode (1 ¡Ñ 2 cm) as counter electrode, a piece glass window and a polyethylene spacer with 78 £gL cell volume, two 2.0-cm length of 0.6-mm diameter platinum wires were used as working electrodes held at +1.1 V, and an Ag/AgCl electrode as reference electrode. All three electrodes were incorporated within the main body of the cell. One of the biosensor design packed Ru(bpy)32+ incorporated silica particulates in the ECL flow cell, and a glucose dehydrogenase (GDH) immobilized silica sol-gel column is placed between the sample injection valve and the flow cell. The ECL response to samples containing glucose and cofactor (NADP) results from the Ru(bpy)33+ ECL reaction with NADPH produced by glucose dehydrogenase. This ECL biosensor was shown applicable for both NAD+- and NADP+- dependent enzymes, where NADH detection ranged from 0.50£gM ¡V 5.0 mM NADH and NADPH detection ranged from 1.0£gM - 3.0 mM NADPH. Glucose can be determined in a linear dynamic range of 5.0 - 500 £gM. Another biosensor design immobilized glucose-6-phosphate dehydrogenase¡]G6PDH¡^onto the Ru(bpy)32+ -doped silica particulates through silica chemistry and then packed these particulates into the ECL flow cell. By passing samples containing G6P and cofactor (NAD) through the ECL flow cell, G6P can be determined in a linear dynamic range of 10.0 £gM-1.0 mM. The regenerable ECL biosensor was characterized of good reproducibility and well stability for flow injection analysis. A repetitive injection of NADH (100 £gM) and G6P¡]500£gM¡^gave satisfactory reproducibility with relative standard deviations of 2.8 %¡]N=105¡^and 2.8 % (N=40) respectively.

Les cellules dendritiques jouent un rôle prépondérant dans le développement des réponses immunitaires ; les nombreuses activités fonctionnelles de ces cellules dont leur importante capacité de phagocytose leur confèrent le pouvoir d'activer les différents mécanismes de défense de l'organisme qu'ils fassent parties de l'immunité innée ou adaptative. Or de nombreux travaux ont montré que lors du développement des réponses immunitaires, les mécanismes oxydatifs ont un rôle essentiel et sont donc étroitement contrôlés. Dans le cas des cellules dendritiques, la production de radicaux oxygénés est en très grande partie relié au fonctionnement d'une NADPH Oxydase (NOX2) que notre laboratoire a été le premier à identifier dans ces cellules, il y a quelques années. Ce complexe enzymatique à une position centrale dans la production en premier des radicaux superoxydes puis des différentes formes réactives de l'oxygène (FRO) qui en découlent. Au cours de ma thèse, j'ai tout d'abord mis en place un protocole permettant l'étude de la production des FRO dans les cellules dendritiques. Les différentes méthodes employées m'ont permis de démontrer que d'autres protéines du système oxydant tels NOX1 et SOD3, étaient également produites par les cellules dendritiques. Nos résultats montrent que ces protéines, à l'instar de ce qui avait été montré pour NOX2, jouent un rôle dans la formation et le contrôle des FRO. J'ai également étudié la localisation intracellulaire de ces protéines, ce qui m'a permis de mieux comprendre les rôles respectifs de ces dernières dans le contrôle de la production et de l'activité des FRO dans les cellules dendritiques. Il avait été préalablement montré que la dégradation des pathogènes dans les cellules dendritiques, après qu'ils aient été phagocytés, était en partie liée à l'activité NOX2. Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse nous permet d'envisager un impact des FRO résultant de l'activité de NOX1 sur le contrôle de l'apoptose des cellules dendritiques ou sur certaines voies de signalisation au niveau de noyau. De plus, la dismutation du superoxyde en peroxyde (H2O2) pourrait ne pas être une réaction spontanée comme plusieurs auteurs l'ont proposé, mais pourrait être lié à la présence de SOD3 qui interviendrait dans les compartiments d'endocytose.

La NADPH-oxydase phagocytaire, responsable de la production d'anions superoxydes microbicides, résulte de l'assemblage des protéines cytosoliques avec le cytochrome b558 membranaire redox formé de Nox2 et p22phox. Nous avons mis en évidence précédemment que le remplacement de la boucle D de Nox2 par celle de Nox4 (mutant D-loopNox4-Nox2) était à l'origine d'une " super-activité " oxydase. Le présent travail a consisté à élucider les mécanismes moléculaires à l'origine de la super-activité oxydase de ce mutant. Le mutant présente une activité oxydase ex vivo 2 à 8 fois supérieure à celle de cellules PLB-985 WT-Nox2, en réponse aux stimuli solubles et particulaires. Cette suractivité est plus importante en réponse à l'ionomycine et au facteur chimiotactique fMLF, dont les voies d'activation impliquent une augmentation du taux de Ca2+i. Cette suractivité a également été mise en évidence dans un système simplifié in vitro contenant uniquement les protéines purifiées du complexe oxydase et activé par l'acide phosphatidique. L'activité oxydase du mutant ex vivo présente une sensibilité accrue à un influx de calcium. Le cytochrome b558 muté est moins sensible aux événements de phosphorylation dépendant d'ERK1/2 durant l'activation par le fMLF. Ainsi, la suractivité du mutant D-loopNox4-Nox2 pourrait provenir d'une modification de la conformation de Nox2 mutée, favorisant l'état activé du complexe oxydase. De plus, la super-activité du mutant améliore son pouvoir bactéricide vis-à-vis de la souche atténuée P. aeruginosa PAO1. Enfin, nous avons pu mettre en évidence l'existence de deux phases distinctes et interdépendantes dans le processus de bactéricidie de ce microorganisme.

Les espèces réactives de l'oxygène ou ROS sont des molécules dérivées de l'oxygène produites " de manière professionnelle " par les NADPH oxydases (NOX). Ces enzymes utilisent l'oxygène comme accepteur d'électrons afin de les transférer à travers les membranes. Le produit de cette réaction est l'anion superoxyde. La famille des NADPH oxydases est composée chez l'Homme de 7 membres : NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1 et DUOX2. Bien que les structures des différentes isoformes des NOX soient très homologues, leurs mécanismes d'activation et leurs distributions tissulaires, cellulaires et subcellulaires et en conséquence, leurs fonctions physiologiques sont très différents. Leurs rôles physiologiques mais aussi pathologiques ont été très souvent déterminés à l'aide de modèles murins transgéniques. Le travail présenté dans cette thèse a eu pour but de déterminer deux nouveaux rôles de NOX1 dans des pathologies humaines : l'hypertension artérielle et le syndrome de détresse respiratoire. Dans un second temps, nous avons également évalué le rôle anti-inflammatoire de NOX2 en utilisant comme modèle des souris déficientes en Nox2. NOX1 a été impliqué dans l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II. Dans cette étude, il a été démontré que les ROS générés par NOX1 sont impliqués dans la formation des anévrysmes aortiques induits par l'angiotensine II, en régulant l'activité des métallo-protéases ainsi que la fibrose. L'activation de NOX1 par l'angiotensine II via son récepteur AT1 est un phénomène bien connu. Nous avons démontré que NOX1 est capable également de réguler la présence du récepteur AT1 à la membrane plasmique. Ces données font de NOX1 une cible thérapeutique de plus en plus importante dans l'hypertension artérielle ainsi que dans les anévrysmes aortiques. Le syndrome de détresse respiratoire des prématurés est caractérisé par une immaturité pulmonaire nécessitant une ventilation mécanique et de fortes concentrations d'oxygène. Les poumons soumis alors à des conditions d'hyperoxie vont être exposés à des concentrations importantes de ROS favorisant et exacerbant les lésions pulmonaires. Lors de cette étude, nous avons démontré à l'aide de souris déficientes en Nox1 que cette NADPH oxydase uniquement est impliquée dans la génération des ROS au niveau des cellules épithéliales et endothéliales pulmonaires induite par l'hyperoxie. NOX1 est à nouveau une cible potentielle thérapeutique lors des syndromes respiratoires des prématurés particulièrement sensibles aux fortes concentrations de ROS. La maladie granulomateuse septique ou CGD est un syndrome d'immunodéficience dû à la présence de mutations essentiellement de gp91phox, gène codant pour NOX2. En conséquence, les patients atteints de CGD souffrent d'infections récurrentes mettant en jeu leur pronostic vital. Associées à ces infections, des réactions inflammatoires exacerbées sont observées et ont un impact sur la morbidité. Dans cette étude, nous avons déterminé qu'une des origines possibles de l'inflammation en l'absence de NOX2 est le beta-glycan. Ces polymères de glucose, composés majoritaires de la paroi des champignons, induisent une inflammation qui ne peut se résoudre en l'absence de NOX2. Mais bien que l'hyperinflammation observée dans un modèle inflammatoire cutané chez les souris déficientes en Nox2 soit associée à de fortes quantités de TNF-alpha, l'augmentation de cette cytokine pro-inflammatoire n'est pas le principal médiateur les lésions inflammatoires induites par les beta-glycans et l'absence de Nox2. Le traitement des patients CGD par des bloqueurs du TNF-alpha ne semblent donc pas recommandés. D'un autre côté, il semble que les molécules capables de bloquer les effets des beta-glycans sont à considérer comme des cibles potentielles pour la recherche de molécules anti-inflammatoires spécifiques et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives pour les patients CGD.

<p>Apoptosis is a conserved mode of cell death executed by a group of proteases named caspases, which collectively ensure tissue homeostasis in multicellular organisms by triggering a program of cellular "suicide" in response to developmental cues or cellular damage. </p><p>Accumulating evidence suggests that cellular metabolism impinges directly upon the decision to initiate cell death. Several links between apoptosis and metabolism have been biochemically characterized. Using <italic>Xenopus</italic> oocyte extracts, our laboratory previously discovered that caspase-2 is suppressed by NADPH metabolism through an inhibitory phosphorylation at S164. However, the physiological relevance of these findings has not been investigated at the whole organism level. Studies presented in this dissertation utilize both Schneider's <italic>Drosophila</italic> S2 (S2) cells and transgenic animals to untangle the influence of metabolic status on fly apoptosis.</p><p>We first demonstrate a novel link between <italic>Drosophila</italic> apoptosis and metabolism by showing that cellular NADPH levels modulate the fly initiator caspase Dronc through its phosphorylation at S130. Biochemically and genetically blocking NADPH production removed this inhibitory phosphorylation, resulting in the activation of Dronc and the subsequent apoptotic cascade in cultured S2 cells and specific neuronal cells in transgenic animals. Similarly, non-phosphorylatable Dronc was found to be more potent than wild-type in triggering neuronal apoptosis. Moreover, upregulation of NADPH prevented Dronc-mediated apoptosis upon abrogation of <italic>Drosophila</italic> Inhibitor of Apoptosis (IAP) protein 1 (DIAP1) by double-stranded RNA (dsRNA) or cycloheximide (CHX) treatment, revealing a novel mechanism of DIAP1-independent apoptotic regulation in <italic>Drosophila</italic>. Mechanistically, the CaMKII-mediated phosphorylation of Dronc hindered its activation, but not its catalytic activity. As NADPH levels have been implicated in the regulation of oocyte death, we demonstrate here that a conserved regulatory circuit also coordinates somatic apoptosis and NADPH levels in <italic>Drosophila</italic>.</p><p>Given the regulatory role of NADPH in the activation of Dronc in <italic>Drosophila</italic> and caspase-2 in vertebrates, we then attempted to further elucidate the underlying signaling pathways. By tracking the catabolic fate of NADPH, we revealed that fatty acid synthase (FASN) activity was required for the metabolic suppression of Dronc, as both the chemical inhibitor orlistat and FASN dsRNA abrogated NADPH-mediated protection against CHX-induced apoptosis in S2 cells. Interestingly, it has been previously demonstrated that blocking FASN induces cell death in numerous cancers, including ovarian cancer; however, the mechanism is still obscure. As our results predict that suppression of FASN activity may prevent the inhibitory phosphorylation of Dronc and caspase 2 (at S130 and S164 respectively), we examined the contribution of caspase-2 to cell death induced by orlistat using ovarian cancer cells. Indeed, caspase-2 S164 was dephosphorylated upon orlistat treatment, initiating the cleavage and activation of caspase-2 and its downstream target, Bid. Knockdown of caspase-2 significantly alleviated orlistat-induced cell death, further illustrating its involvement.</p><p>Lastly, we developed an assay based on bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to monitor the oligomerization of Dronc in S2 cells, a crucial step in its activation. The sensitivity of this assay has been validated with several apoptotic stimuli. A future whole-genome screen employing this assay is planned to provide new insights into this complex apoptotic regulatory network by unbiasedly identifying novel apoptotic regulators.</p> / Dissertation