El presente y el futuro de la industria textil están íntimamente ligados al concepto de textil técnico, artículos éstos concebidos para su aplicación en diferentes segmentos de mercado: salud y ámbito hospitalario, industria naval, aeronáutica y de automoción, sector de construcción e ingeniería civil, defensa e industria militar, etc. En el presente proyecto de investigación se ha contemplado la funcionalización de fibras de polipropileno mediante la aditivación de nanopartículas de plata. De esta forma, se persigue la funcionalización de este material textil con el objetivo de que estas fibras exhiban propiedades antibacterianas y antifúngicas intrínsecas, aumentando así sus posibilidades de aplicación en el campo de textiles de uso médico. El desarrollo de hilos de polipropileno aditivados con nanopartículas de plata ha requerido de un proceso previo de aditivación de la granza polimérica mediante la utilización de un sistema de extrusión de doble husillo co-rotante. Se ha evaluado la influencia de la velocidad de extrusión, de la concentración de nanoplata y de la naturaleza y concentración de diferentes agentes compatibilizantes sobre la homogeneidad de la mezcla polímero-nanopartícula. Se ha optimizado la mezcla polipropileno-nanoplata con vistas a su aplicación en el proceso de hilatura por fusión de hilos multifilamento. Se ha estudiado la influencia de la relación de estirado y de la concentración de nanopartículas de plata en las propiedades térmicas, mecánicas y bioactivas de los hilos funcionales desarrollados. Los hilos multifilamento objeto de estudio presentan configuración monocomponente y bicomponente con sección corteza-núcleo. En el estudio del grado de dispersión de las nanopartículas de plata en la matriz de polipropileno se ha hecho uso de los siguientes técnicas analíticas: difracción de rayos X (XRD), microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Igualmente, se ha caracterizado la estabilidad térmica / Fages Santana, E. (2012). INVESTIGACIÓN DE FIBRAS DE POLIPROPILENO ADITIVADAS CON NANOPARTÍCULAS DE PLATA PARA LA MEJORA DE PROPIEDADES BIOACTIVAS EN EL SECTOR TEXTIL [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/21065

La investigación actual se enfoca en evaluar cómo afecta el uso de Nanotubos de Grafeno y el Sistema SNS 360 al concreto estructural con resistencia de 21Mpa. Utilizamos una metodología cuantitativa de carácter experimental, considerando como variables independientes a los Nanotubos de Grafeno y el Sistema SNS 360, y como variables intervinientes las propiedades constituyentes propias del concreto. La muestra analizada incluye una mezcla de concreto estándar y otra con nano-adiciones, sumando un total de 160 prototipos: 140 cilíndricos y 20 prismáticos. Los ensayos realizados abarcan determinación del f’c, tracción y flexión en distintos intervalos: 3, 7, 14 y 28 días. Se experimentó con dosificaciones de MWCNT de 0.10%, 0.25% y 0.05%, añadiendo 1% y 2% de SNS 360 en cada caso. Los resultados indican que la dosificación de 0.05% de MWCNT combinado con 2% NPF ofrece las mejores prestaciones en el concreto. Algunos parámetros obtenidos son: asentamiento de 3.8”, peso unitario de 2321 kg/cm3, contenido de aire del 1.8%, y tiempo de fraguado de 125 min. A los 28 días, el f’c alcanzó 330 kg/cm2, la tracción fue de 27 kg/cm2, y la flexión llegó a 64 kg/cm2. En cuanto al desgaste, superó en 0.078% al diseño estándar, y la permeabilidad mostró una penetración máxima de 19.29 mm. El costo por m³ es de S/ 991.71, indica un aumento del 33.4% en relación con el concreto convencional. / The current research focuses on evaluating how the use of Graphene Nanotubes and the SNS 360 System affects structural concrete with a strength of 21 MPa. We use a quantitative methodology of an experimental nature, considering as independent variables the Graphene Nanotubes and the SNS 360 System, and as intervening variables the intrinsic constituent properties of the concrete. The analyzed sample comprises a standard concrete mix and another with nano-additives, totaling 160 prototypes: 140 cylindrical and 20 prismatic. Tests were conducted on compression, tension, and bending resistance at different intervals: 3, 7, 14, and 28 days. We experimented with MWCNT dosages of 0.10%, 0.25%, and 0.05%, adding 1% and 2% of SNS 360 in each instance. The findings suggest that a dosage of 0.05% MWCNT combined with 2% NPF provides the best performance in concrete. Notable data includes a settlement of 3.8”, a unit weight of 2321 kg/cm3, an air content of 1.8%, and a setting time of 125 min. At 28 days, the compression strength reached 330 kg/cm2, tension stood at 27 kg/cm2, and bending achieved 64 kg/cm2. Regarding wear, it exceeded the standard design by 0.078%, and permeability showed a maximum penetration of 19.29 mm. The cost per m³ is S/ 991.71, marking an increase of 33.4% compared to conventional concrete.

Tesis por compendio / [ES] La pérdida y el desperdicio de alimentos supone un problema global de gran magnitud con implicaciones significativas en los ámbitos ambiental, económico y social. Una fracción importante de dichas pérdidas está producida por las enfermedades postcosecha causadas por fitopatógenos. Meyerozyma caribbica encapsulada en recubrimientos comestibles ha demostrado ser efectiva como control biológico en frutos. Sin embargo, las técnicas convencionales de producción de recubrimientos no garantizan la homogeneidad del tratamiento sobre el alimento, pudiendo afectar a su efectividad. En este sentido, las nanofibras hiladas mediante procesos electro y aerohidrodinámicos pueden actuar como una matriz biopolimérica para atrapar dichos microorganismos, y pueden ser depositadas homogéneamente en la superficie de los alimentos, y esto, junto a que son estructuras con una gran superficie-volumen, las hace más activas y eficientes. La etapa 1, consistió en la optimización y la caracterización fisicoquímica de las disoluciones poliméricas (goma de anacardo, CG; FucoPol, FP; poli óxido de etileno, PEO; pululano, Pul). La etapa 2, consistió en la obtención de estructuras mediante electrospray y electrospinning, éstas se caracterizaron mediante SEM, ATR-FTIR, WAXS, TGA y DSC. La etapa 3 consistió en la encapsulación de M. caribbica en nanofibras de pululano, CG:PEO y FP:PEO mediante electrospinning. Las nanofibras se caracterizaron mediante SEM, ATR-FTIR y TGA. Se determinó la viabilidad de M. caribbica y se evaluó la actividad antifúngica de las nanofibras frente a 6 hongos de interés comercial. La etapa 4, consistió en el análisis in vivo de frutos cubiertos con nanofibras adicionadas con M. caribbica aplicadas por Solution Blow Spinning (SBS) para ello se determinó la viabilidad de M. caribbica en las nanofibras y se evaluó la actividad antifúngica in vitro e in vivo como tratamientos preventivos y curativos frente a C. gloeosporioides. Finalmente, se evaluó el efecto de las nanofibras sobre los parámetros de calidad de los aguacates. Las microestructuras obtenidas con CG, mostraron cápsulas esféricas sin depresiones irregulares que encapsularon al compuesto modelo (ß-caroteno). Las cápsulas de CG brindaron protección térmica y fotoestabilidad al ß-caroteno. Por otro lado, FP, FP:Pul y FP:PEO mostraron fibras helicoidales cilíndricas, lisas y gruesas. Mediante WAXS, en las nanofibras de FP:Pul y FP:PEO se detectaron nuevos picos a ángulos por debajo de los 10º, lo que sugiere que FucoPol podría afectar la estructura polimérica de otros materiales con una estructura secundaria helicoidal. Las nanofibras de pululano, CG:PEO y FP:PEO con M. caribbica mostraron nanofibras cilíndricas, lisas y homogéneas. Los polímeros utilizados brindaron protección térmica a la levadura. Las nanofibras de pululano mostraron la viabilidad más alta de M. caribbica y el mayor porcentaje de inhibición del crecimiento de los 6 hongos evaluados. Mediante SBS se obtuvieron fibras homogéneas, continuas y rizadas. SBS garantizó una alta viabilidad de M. caribbica en las nanofibras aplicadas en la superficie de los aguacates bajo diferentes condiciones evaluadas. Las nanofibras de pululano con M. caribbica como tratamiento preventivo inhibieron por completo el crecimiento de C. gloeosporioides. Además, la aplicación de las nanofibras sobre los aguacates no afectó los parámetros de calidad. El pululano, la CG y el FP en combinación con PEO y pululano se han estudiado por primera vez para formar estructuras mediante procesos electrohidrodinámicos y aerohidrodinámicos. Estos resultados obtenidos, sugieren un alto potencial de las nanofibras para su uso en la industria alimentaria y representan una alternativa interesante para el tratamiento post-cosecha de frutos en el control de enfermedades fúngicas, contribuyendo de esta manera a reducir la pérdida en la producción de alimentos. / [CA] La pèrdua i el malbaratament d'aliments representen un gran problema mundial amb implicacions significatives en els àmbits ambiental, econòmic i social. Una part considerable d'estes pèrdues es deu a malalties post collita causades per fitopatògens. Meyerozyma caribbica, encapsulada en recobriments comestibles, ha demostrat ser efectiva com a control biològic en fruites. No obstant això, els mètodes tradicionals de producció de recobriments sovint no asseguren un tractament uniforme a la superfície dels aliments, cosa que pot comprometre l'eficàcia. En este context, les nanofibres filades mitjançant processos electro- i aerohidrodinàmics poden servir com a matriu bio polimèrica per atrapar estos microorganismes, garantint la deposició homogènia sobre les superfícies dels aliments. El seu gran ràtio superfície-volum enfortix l'activitat i l'eficiència. L'etapa 1 va implicar l'optimització i la caracterització fisicoquímica de les solucions de polímers (goma d'anacard, CG; FucoPol, FP; i poli òxid d'etilè, PEO); pululan, Pul). L'etapa 2 es va centrar en la fabricació d'estructures mitjançant electrospray i electrospinning, caracteritzades per SEM, ATR-FTIR, WAXS, TGA i DSC. L'etapa 3 va incloure l'encapsulació de M. caribbica en nanofibres de pullulan, CG:PEO i FP:PEO per electrofilat. Les nanofibres van ser caracteritzades per SEM, ATR-FTIR i TGA. La viabilitat de M. caribbica es va determinar i l'activitat antifúngica de les nanofibres es va avaluar contra 6 fongs d'interés comercial. L'etapa 4 va consistir en l'anàlisi in vivo de fruites recobertes amb nanofibres afegides amb M. caribbica aplicades per mitjà de Solution Blow Spinning (SBS); per això, es va determinar la viabilitat de M. caribbica a les nanofibres i es va avaluar l'activitat antifúngica in vitro i in vivo com a tractaments preventius i curatius enfront de C. gloeosporioides. Finalment, es va avaluar l'efecte de les nanofibres en els paràmetres de qualitat dels alvocats. Les microestructures obtingudes amb CG van mostrar càpsules esfèriques sense depressions irregulars que encapsulaven el compost model (ß-caroté). Les càpsules de CG van proporcionar protecció tèrmica i foto estabilitat al ß-caroté. D'altra banda, FP, FP:Pul i FP:PEO van mostrar fibres cilíndriques, suaus i gruixudes. Mitjançant WAXS es van detectar nous pics a angles per davall dels 10°, la qual cosa suggerix que FucoPol podria afectar l'estructura d'altres materials amb una estructura secundària helicoidal. Les nanofibres de pululan, CG:PEO i FP:PEO amb M. caribbica van mostrar nanofibres cilíndriques, suaus i homogènies. Els polímers utilitzats van proporcionar protecció tèrmica al llevat. Les nanofibres de pululan van mostrar la màxima viabilitat de M. caribbica i el màxim percentatge d'inhibició del creixement dels 6 fongs provats. Utilitzant SBS, es van obtindre fibres homogènies, contínues i arrissades. SBS va garantir una alta viabilitat de M. caribbica a les nanofibres aplicades a la superfície dels alvocats en diferents condicions avaluades. Les nanofibres de pululan amb M. caribbica com a tractament preventiu van inhibir completament el creixement de C. gloeosporioides. A més, l'aplicació de nanofibres en alvocats no va afectar els paràmetres de qualitat. El Pululan, la CG i l'FP en combinació amb PEO i pululan han estat estudiades per primera vegada per a formar estructures mitjançant processos electro hidrodinàmics i aero hidrodinàmics. Estos resultats obtinguts suggerixen un alt potencial de les nanofibres per a ser utilitzades en la indústria alimentària i representen una interessant alternativa per al tractament post collita de les fruites en el control de les malalties fúngiques, contribuint a reduir la pèrdua en la producció d'aliments. / [EN] Food loss and waste represent a significant global challenge with substantial implications across environmental, economic, and social domains. A considerable portion of these losses stems from postharvest diseases caused by phytopathogens. Meyerozyma caribbica, encapsulated in edible coatings, has demonstrated effectiveness as a biological control agent in fruits. However, conventional coating production methods often fail to ensure uniform treatment on food surfaces, potentially compromising efficacy. In this context, nanofibers spun through electro- and aerohydrodynamic processes can serve as a biopolymeric matrix to entrap such microorganisms, ensuring homogeneous deposition on food surfaces. Their large surface-area-to-volume ratio enhances activity and efficiency. Stage 1 involved optimizing and characterizing polymer solutions (cashew gum, CG; FucoPol, FP; polyethylene oxide, PEO; pullulan, Pul). Stage 2 focused on fabricating structures via electrospray and electrospinning, characterized by SEM, ATR-FTIR, WAXS, TGA, and DSC. Stage 3 entailed encapsulating M. caribbica in pullulan, CG:PEO, and FP:PEO nanofibers via electrospinning, fibers were characterized by SEM, ATR-FTIR, and TGA. M. caribbica viability and the nanofibers' antifungal activity were assessed against six commercially relevant fungi. Stage 4 comprised in vivo analysis of fruits coated with nanofibers containing M. caribbica applied via Solution Blow Spinning (SBS). Viability of M. caribbica in the nanofibers and their antifungal efficacy were determined in vitro and in vivo as preventive and curative treatments against C. gloeosporioides. The impact of nanofibers on avocado quality parameters was evaluated. The microstructures obtained with CG exhibited spherical capsules encapsulated the model compound (ß-carotene), providing thermal and photostability. FP, FP:Pul, and FP:PEO showed cylindrical, smooth, and thick helical fibers. Using WAXS, new peaks at angles below 10º were detected in FP:Pul and FP:PEO nanofibers, suggesting that FucoPol could affect the polymer structure of other materials with a secondary helical structure. Pullulan, CG:PEO, and FP:PEO nanofibers with M. caribbica were cylindrical, smooth, and homogeneous, offering thermal protection to the yeast. Pullulan nanofibers exhibited the highest M. caribbica viability and highest percentage of growth inhibition of the tested fungi. SBS showed homogeneous, continuous, and curly fibers, ensuring high M. caribbica viability on avocado surfaces under diferent conditions. Pullulan nanofibers with M. caribbica as preventive treatment completely inhibited C. gloeosporioides growth without affecting avocado quality parameters. This study represents the first investigation of pullulan, CG, and FP combined with PEO and pullulan for forming structures via electrohydrodynamic and aerohydrodynamic processes. The results underscore the high potential of nanofibers in the food industry, offering a promising alternative for postharvest fruit treatment against fungal diseases and contributing to reducing food loss in fruit production. / Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca número 754518 concedida para hacer posible el desarrollo de este proyecto de investigación. / Vázquez González, Y. (2024). Desarrollo de micro y nanofibras antifúngicas para el control de antracnosis en aguacate "Hass" (Persea americana Mill. cv. Hass) obtenidas por procesado electrohidrodinámico y aerohidrodinámico [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/206250 / Compendio

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los Requisitos para optar al Grado de Magíster en Ciencias Químicas. / Se realizó un estudio de las propiedades electrónicas y geométricas de moléculas de ftalocianina libre H2Pc y ftalocianina de oro AuPc depositadas sobre una superficie metálica de oro representada mediante un cluster de 26 y 58 átomos respectivamente, usando la metodología de teoría de funcionales de la densidad. Mediante la inclusión de una corrección semi-empírica para dar cuenta de las fuerzas de dispersión, la metodología D3, se mostró que la interacción entre las moléculas y la superficie está regida por fuerzas atractivas de tipo van der Waals, que determinan la estabilización de los sistemas estudiados, así como sus propiedades geométricas que se evidencia en la disminución de la distancia molécula-superficie. Esto se fundamenta tanto en el análisis de las energías de interacción como en la visualización de las fuerzas de dispersión mediante la metodología NCI. Cálculos de Densidad de Estados muestran que los sistemas molécula-superficie exhiben una estructura electrónica de interfase metal-orgánica, lo que provee evidencia de que el modelo de cluster es viable en la aproximación supermolécula para el estudio de fenómenos de superficie. También se analizó la capacidad electrocatalítica del sistema AuPc y se observó que reproduce la tendencia de los sistemas experimentales con configuraciones electrónicas similares. / A study of the electronic and geometric properties of metal-free phthalocyanine H2Pc and gold phthalocyanine AuPc deposited over a gold metallic surface represented by a cluster of 26 and 58 atoms respectively, using the density functional theory methodology. Through the inclusion of a semi-empirical correction to take into account the dispersion forces, the D3 methodology, it has been shown that the interaction between molecules and surface is ruled by van der Waals attractive forces, which determine the stabilization of the studied systems and their geometric properties, demonstrated by the dropping of the molecule-surface distance. This is explained by the analysis of the interaction energies and by the visualization of dispersion forces by means of the NCI methodology. Calculations of Density of States show that molecule-surface systems display a metalorganic interface electronic structure, which provides evidence for the cluster model as a feasible one in the supermolecule approximation for the study of surface related phenomena. Also, the electrocatalytic behavior of the AuPc system was analyzed and it was observed that it reproduces the experimental tendencies of systems with similar electronic configurations. / Fondecyt Regular N° 1140503 y N° 1180158.

Antecedentes: Las rehabilitaciones mediante prótesis de carga inmediata son una práctica habitual en los últimos años con altas tasas de éxito. No obstante en la literatura la mayoría de estudios clínicos se realizan en mandíbula debido a la mejor cualidad del hueso receptor respecto al maxilar. Estas peores características del maxilar obligan a buscar implantes que en su diseño macrométrico nos proporcionen mayor estabilidad primaria así como nuevos tipos de superficies que nos proporcionen una más rápida formación de hueso y estabilidad secundaria. Objetivo: .Analizar el comportamiento clínico de dos implantes dentales con las mismas características estructurales (macroestructura) y la microtopografía de las superficies diferentes, uno con microrugosidades (OsseoTite®) y otro con las mismas microrugosidades más la adición de nanocristales de fosfato cálcico (NanoTite®), ambos sometidos a carga inmediata en el maxilar edéntulo. Material y métodos: Se trata de un estudio controlado y aleatorizado a doble ciego. Tras el screening, se realizó el estudio del TAC para cirugía guiada (Simplant®) Insertándose 36 implantes en maxilar,que fueron cargados inmediatamente, repartidos en seis pacientes. Fueron descartados cuatro pacientes por no presentar la estabilidad primaria inicial requerida por el protocolo del estudio.Se realizaron las mediciones de la estabilidad de los implantes (ISQ) en el momento de la inserción, a los tres meses y a los tres años mediante el Ostell Mentor®, así como radiografías a los 0, 3, 12, 24 y 36 meses. Resultados: Al analizar la interacción de los valores del ISQ de ambas superficies en el momento de la inserción de los implantes y a los tres meses, obsevamos diferencias estadisticamente significativas p=0.0084 entre ellas, mientras la superficie control presenta una disminución del ISQ, la superficie estudio presenta un aumento del mismo, igualándose dicho valores a los tres años.Al comparar los valores de las Unidades Hounsfield con la calidad ósea obtenemos un p valor =0,00004943 lo que nos indica una diferencia estadísticamente significativa registrando valores mayores de la densidad ósea en huesos tipo 2 que los obtenidos en hueso tipo 3.Al analizar los valores obtenidos de las diferentes calidades óseas, en relación con la estabilidad de los implantes, independientemente de la superficie, obtenemos diferencias estadísticamente significativas p=0,0064, observándose valores mayores del ISQ en huesos tipo 2 que los obtenidos en hueso tipo 3 independientemente de la superficie. No así si los analizamos la interacción diferenciando las superficies.Al analizar la relación entre el torque de inserción y la estabilidad primaria de los implantes sin diferenciar el tipo de superficie, si obtenemos diferencias estadísticamente significativas p=0,0166 encontrándose una relación directa entre el torque de inserción y la estabilidad primaria obtenida.No así cuando comparamos el torque de inserción con el tipo de superficie de los implantes.Por último si relacionamos el torque de inserción con las diferentes calidades óseas obtenemos un p valor de 0,000011236, lo que nos indica que si hay diferencias estadísticamente significativas entre la calidad ósea y el torque al insertar el implante, obteniendose valores mayores en los implantes insertados en hueso tipo dos que los insertados en hueso tipo 3. Conclusión: Para poder realizar una carga inmediata en huesos de menor densidad, necesitamos superficies de implantes que nos favorezcan una rápida curación. En este estudio los valores obtenidos de estabilidad a los tres meses en la superficie tratada con nanocristales de fosfato cálcico son superiores a los de la superficie control, por lo que son una opción a tener en cuenta a la hora de planificar una carga inmediata en huesos de poca calida ósea, aunque se necesitan más estudios clínicos para autentificar este estudio.

[ES] Los sistemas CRISPR-Cas se basan en un mecanismo del sistema inmune adaptativo que se encuentra en bacterias y arqueas. Funcionan utilizando endonucleasas guiadas por ARN (proteínas Cas) para localizar y reconocer secuencias específicas de ácidos nucleicos. Los sistemas CRISPR-Cas son revolucionarios en el campo de la ingeniería genética, permitiendo la edición específica del genoma, ensayos de regulación genética y, desarrolladas en los últimos años, aplicaciones de diagnóstico. Los métodos de detección de ácidos nucleicos son la técnica de diagnóstico de referencia en la clínica debido a su alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, de cara al futuro, debemos desarrollar métodos versátiles de detección de virus que permitan diagnósticos rápidos y fiables, que superen las limitaciones de las técnicas actuales y puedan usarse fácilmente fuera del laboratorio para aplicaciones en puntos de atención (POC). Los sistemas CRISPR-Cas se han reconvertido en herramientas de diagnóstico de ácidos nucleicos gracias a la capacidad de algunas proteínas Cas de realizar cortes colaterales no específicos al reconocer su diana. Nuestro objetivo es ampliar el conjunto de herramientas de diagnóstico CRISPR-Cas mediante el desarrollo de una nueva estrategia de detección de ácidos nucleicos basada en CRISPR-Cas9, cuyo modo de acción se basa en el desplazamiento de hebra en lugar de en la catálisis colateral. Demostramos que los amplicones de ADN del SARS-CoV-2 generados a partir de muestras de pacientes pueden detectarse con CRISPR-Cas9. También demostramos la capacidad de realizar la detección simultánea de diferentes amplicones de ADN con la misma nucleasa, ya sea para identificar diferentes regiones de SARS-CoV-2 o diferentes virus respiratorios. Para avanzar hacia aplicaciones POC, acoplamos el paso de preamplificación isotérmica con oligos biotinilados para producir amplicones marcados. Cuando se combina con CRISPR-Cas9 y sondas marcadas con FAM, esto permite la visualización colorimétrica de la detección mediante ensayos de flujo lateral (LFA) en tiras disponibles en el mercado. La lectura colorimétrica permite la interpretación de los resultados a simple vista, superando la necesidad de un fluorímetro. Detectamos con éxito SARS-CoV-2 a partir de muestras de pacientes en la configuración LFA, y cuando se combinó con RT-RPA multiplexado, se logró la detección de dos regiones distintas del virus en una sola prueba. Además, la ausencia de actividad colateral en nuestra metodología permite el procesamiento de secuencias posteriores adicionales. Por lo tanto, también pretendemos explorar la capacidad de integración de señales de nuestro método de detección basado en CRISPR-Cas9. Demostramos que diseños de circuitos lógicos de ADN pueden procesar diferentes señales de SARS-CoV-2 detectadas por los complejos CRISPR. También nos propusimos mejorar nuestro sistema CRISPR-Cas9 para detectar tanto proteínas como ácidos nucleicos. Nos propusimos diseñar un ARN guía condicional que respondiera a la presencia de la proteína spike del SARS-CoV-2. Para ello, insertamos un aptámero en el ARN guía para bloquear la actividad de Cas9 en ausencia de la proteína. En presencia de la proteína spike, la interacción aptámero-proteína hace que el motivo de bloqueo sufra un cambio conformacional, liberando el ARN guía y activando Cas9. Aunque logramos con éxito el escenario de bloqueo utilizando las secuencias reguladoras, es necesario seguir trabajando para identificar una secuencia que pueda inducir el cambio conformacional específico necesario para restaurar la actividad de Cas9 en presencia de la proteína spike. En conjunto, esta plataforma de diagnóstico CRISPR-Cas9 permite una detección multiplexada en un solo tubo, complementando los métodos existentes basados en CRISPR, y ofreciendo un sistema extensible para aplicaciones en diagnóstico en el punto de atención y biocomputación. / [CA] Els sistemes CRISPR-Cas es basen en un mecanisme del sistema immunitari adaptatiu que es troba en bacteris i arqueus. Funcionen utilitzant endonucleases guiades per ARN (proteïnes Cas) per tal de dirigir-se i reconéixer seqüències específiques d'àcids nucleics. Els sistemes CRISPR-Cas siguen revolucionaris en el camp de l'enginyeria genètica, permetent l'edició específica del genoma, assajos de regulació gènica i, desenvolupades en els darrers anys, aplicacions de diagnòstic. Els mètodes de detecció d'àcids nucleics són la tècnica de diagnòstic de referència a la clínica degut a la seua alta sensibilitat i especificitat. No obstant, de cara al futur, hem de desenvolupar mètodes versàtils de detecció de virus que permeten diagnòstics ràpids i fiables, que superen les limitacions de les tècniques actuals i puguen utilitzar-se fàcilment fora del laboratori per a aplicacions en punts d'atenció (POC). Els sistemes CRISPR-Cas han estat reorientats com a eines de diagnòstic d'àcids nucleics, fet possible per la capacitat d'algunes proteïnes Cas de realitzar un tall col·lateral no específic en reconèixer un objectiu. El nostre objectiu és ampliar el conjunt d'eines de diagnòstic CRISPR-Cas desenvolupant una nova estratègia de detecció d'àcids nucleics basada en CRISPR-Cas9, el mode d'acció del qual es basa en el desplaçament de cadena en lloc de la catàlisi col·lateral. Mostrem que es poden detectar amplicons de DNA de SARS-CoV-2 generats a partir de mostres de pacients amb CRISPR-Cas9. També demostrem la capacitat de realitzar la detecció simultània de diferents amplicons de DNA amb la mateixa nucleasa, ja siga per identificar diferents regions de SARS-CoV-2 o diferents virus respiratoris. Per avançar cap a aplicacions de punt d'atenció (POC), vam combinar el pas de preamplificació isotèrmica amb oligos biotinilats per produir amplicons etiquetats. Quan es combinen amb l'orientació CRISPR-Cas9 i sondes etiquetades amb FAM, això permet la visualització colorimètrica de la detecció mitjançant assajos de flux lateral (LFA) en tires comercials disponibles. La lectura colorimètrica permet la interpretació dels resultats a simple vista, superant la necessitat d'un fluorímetre. Vam detectar amb èxit el SARS-CoV-2 a partir de mostres de pacients en el sistema LFA, i quan es va combinar amb RT-RPA multiplexada, es va aconseguir la detecció de dues regions diferents del virus en una sola prova. A més, l'absència d'activitat col·lateral en la nostra metodologia permet el processament de seqüències addicionals. Per tant, també ens proposem explorar la capacitat d'integració de senyals del nostre mètode de detecció basat en CRISPR-Cas9. Demostrem que els circuits lògics d'ADN dissenyats poden processar diferents senyals de SARS-CoV-2 detectats pels complexos CRISPR. També vam intentar millorar el nostre sistema CRISPR-Cas9 per detectar tant proteïnes com àcids nucleics. Ens vam proposar dissenyar un ARN guia condicional que respon a la presència de la proteïna spike del SARS-CoV-2. Per aconseguir-ho, vam inserir una seqüència d'aptàmer dins de l'ARN guia per bloquejar l'activitat de Cas9 en absència de la proteïna. En presència de la proteïna spike, la interacció aptàmer-proteïna fa que el motiu de bloqueig experimente un canvi conformacional, alliberant l'ARN guia i activant Cas9. Tot i que vam aconseguir amb èxit el bloqueig utilitzant les seqüències reguladores, es necessita més treball per identificar una seqüència que puga induir el canvi conformacional específic necessari per restaurar l'activitat de Cas9 en presència de la proteïna spike. Col·lectivament, aquesta plataforma de diagnòstic CRISPR-Cas9 permet una detecció multiplexada en un sol tub, complementant els mètodes existents basats en CRISPR i oferint un sistema extensible per a aplicacions en diagnòstics de punt d'atenció i biocomputació. / [EN] CRISPR-Cas systems are based on an adaptive immune system mechanism found in bacteria and archaea. They function using RNA-guided endonucleases (Cas proteins), to target and recognize specific nucleic acid sequences. CRISPR-Cas systems are revolutionary in the field of genetic engineering, enabling specific genome editing, gene regulation assays and, developed in recent years, diagnostic applications. Nucleic acid detection methods are the gold-standard diagnostic technique in the clinic due to their high sensitivity and specificity. However, going forward, we must develop versatile virus detection methods that enable fast and reliable diagnostics and that can overcome the limitations of the current techniques and can be easily used outside the laboratory for point-of-care (POC) applications. CRISPR-Cas systems have been repurposed as nucleic acid diagnostic tools made possible by the ability of some Cas proteins to perform non-specific collateral cleavage upon target recognition. We aim to expand the CRISPR-Cas diagnostic toolkit by developing a novel nucleic acid detection strategy based on CRISPR-Cas9, whose mode of action relies on strand displacement rather than on collateral catalysis. We show that SARS-CoV-2 DNA amplicons generated from patient samples can be detected with CRISPR-Cas9. We also demonstrate the ability to perform simultaneous detection of different DNA amplicons with the same nuclease, either to identify different SARS-CoV-2 regions or different respiratory viruses. To advance toward POC applications, we coupled the isothermal preamplification step with biotinylated oligos to produce labelled amplicons. When combined with CRISPR-Cas9 targeting and FAM-labelled probes, this allows for colorimetric visualization of detection using lateral flow assays (LFA) on commercially available strips. The colorimetric readout enables interpretation of the results with the naked eye, surpassing the need for a fluorimeter. We successfully detected SARS-CoV-2 from patient samples in the LFA setup, and when combined with multiplexed RT-RPA, the detection of two distinct regions of the virus was achieved in a single test. Furthermore, the absence of collateral activity in our methodology allows for the processing of additional downstream sequences. Therefore, we also aim to explore the signal integration capability of our CRISPR-Cas9-based detection method. We demonstrate that engineered DNA logic circuits can process different SARS-CoV-2 signals detected by the CRISPR complexes. We also aimed to enhance our CRISPR-Cas9 system to sense both proteins and nucleic acids. We aimed to engineer a conditional guide RNA that responds to the presence of the SARS-CoV-2 spike protein. To achieve this, we inserted an aptamer sequence within the guide RNA to block Cas9 activity in the absence of the protein. Upon the presence of the spike protein, aptamer-protein interaction makes the blocking motif undergo a conformational change, releasing the guide RNA and activating Cas9. While we successfully achieved the blocking scenario using the regulatory sequences, further work is needed to identify a sequence that can induce the specific conformational change required to restore Cas9 activity upon spike protein presence. Collectively, this CRISPR-Cas9 diagnostic platform allows a multiplexed detection in a single tube, complementing the existing CRISPR-based methods, and offering an extensible system for applications in point-of-care diagnostics and biocomputing. / This work was supported by a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Science and Innovation (PRE2019-088531). / Márquez Costa, R. (2024). Engineering of CRISPR-Cas9-Based Systems for Diagnostics and Biocomputing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/210634

[ES] La tomografía por difracción surge para mejorar las técnicas de imagen al considerar la naturaleza ondulatoria de la luz. Mientras que los primeros sistemas de imagen médica se basaban únicamente en fuentes sin difracción, este enfoque consigue mejorar la reconstrucción del índice de refracción de los objetos, lo que permite, por ejemplo, el estudio de estructuras subcelulares. Del mismo modo, la demanda de redes de telecomunicaciones cada vez más rápidas y seguras ha propiciado la aparición de la fotónica. Hace dos décadas, la combinación de estos dos campos dio lugar a los primeros sistemas de tomografía por difracción óptica (ODT), los cuáles han evolucionado rápidamente durante este siglo. En esta tesis, presentamos dos nuevas aplicaciones de la ODT. La primera está relacionada con el concepto del microscopio tomográfico de fase (TPM), una versión de la ODT que permite el estudio de células aisladas, con muchas aplicaciones biomédicas, como el diagnóstico y la prognosis del cáncer. Sin embargo, los sistemas TPM actuales son caros, pesados y complejos. Para resolver estos problemas, proponemos el concepto de TPM en chip. Con este fin, diseñamos una hoja de ruta hacia el primer dispositivo tomográfico integrado en el marco de la tecnología lab-on-a-chip (LoC), y desarrollamos los primeros pasos para ello: 1) Hasta ahora, sólo se han utilizado detectores planos para obtener los mapas de índice de refracción de los objetos estudiados en TPM, basados en la detección del campo difractado hacia delante. Sin embargo, los principios físicos fundamentales indican que medir también el campo difractado hacia detrás debería mejorar la resolución de las imágenes. Además, un detector plano no es la configuración óptima para el TPM en chip. En esta línea, hemos explorado la posibilidad de usar detectores circulares en este escenario, como una técnica más adecuada para las configuraciones en chip, demostrando al mismo tiempo que este enfoque proporciona una mejor resolución que el lineal. 2) Proponemos un esquema de TPM en chip basado en el uso de nanoantenas dieléctricas como fuente de luz y píxeles detectores ODT, y caracterizamos experimentalmente su comportamiento mediante microscopía óptica de campo cercano. En cuanto a la segunda aplicación, estudiamos el potencial de la ODT como nuevo paradigma en la detección de capas de invisibilidad realistas, una de las aplicaciones más importantes de los metamateriales. Hasta ahora, el scattering cross section (SCS) se ha utilizado como modelo de referencia para diseñar y observar la eficacia de estos dispositivos para ocultar objetos. En nuestro estudio, demostramos que la ODT puede detectar las capas de invisibilidad prácticas con una sensibilidad superior a la que ofrece el SCS, incluso a las frecuencias de trabajo óptimas. Además, es posible obtener una imagen representativa del tamaño y la forma de la capa, revelando claramente su existencia. Finalmente, se discuten las conclusiones extraídas de los resultados obtenidos. Además, se detallan las futuras líneas de trabajo para abordar los retos que no se han completado en esta tesis doctoral. / [CA] La tomografia per difracció sorgeix per millorar les tècniques d'imatge anteriors en considerar la naturalesa ondulatòria de la llum. Mentre que els primers sistemes d'imatge mèdica es basaven únicament en fonts sense difracció, aquest enfocament aconsegueix millorar la reconstrucció de l'índex de refracció dels objectes, la qual cosa permet, per exemple, l'estudi d'estructures subcelulars. De la mateixa manera, la demanda de xarxes de telecomunicacions cada vegada més ràpides i segures ha propiciat l'aparició de la fotònica. Fa dues dècades, la combinació d'aquests dos camps va portar als primers sistemes de tomografia per difracció òptica (ODT), els quals han evolucionat ràpidament durant aquest segle. En aquesta tesi, presentem dues noves aplicacions de la ODT. La primera està relacionada amb el concepte del microscopi tomogràfic de fase (TPM), una versió de la ODT que permet l'estudi de cèl·lules aïllades, amb moltes aplicacions en biomedicina, com el diagnòstic i prognosi del càncer. No obstant això, els sistemes TPM actuals són cars, pesats i complexos. Per resoldre aquests problemes, proposem el concepte de TPM en xip. Per fer-ho, dissenyem un full de ruta cap al primer dispositiu tomogràfic integrat en el marc de la tecnologia lab-on-a-chip (LoC), i desenvolupem els primers passos a aquest efecte: 1) Fins ara, només s'han utilitzat detectors plans per a obtindre els mapes d'índex de refracció dels objectes estudiats en TPM, basats en la detecció del camp difractat cap avant. No obstant això, els principis físics fonamentals indiquen que mesurar també el camp difractat cap endarrere hauria de millorar la resolució de les imatges. A més, un detector pla no és la configuració òptima per al TPM en xip. En aquesta línia, hem explorat la possibilitat d'usar detectors circulars en aquest escenari, com una tècnica més adequada per a les configuracions en xip, demostrant al mateix temps que aquest enfocament proporciona una millor resolució que el lineal. 2) Proposem un esquema de TPM en xip basat en l'ús de nanoantenes dielèctriques com a font de llum i píxels detectors ODT, i caracteritzem experimentalment el seu comportament en camp pròxim mitjançant microscòpia òptica de camp pròxim. Pel que fa a la segona aplicació, estudiem el potencial de la ODT com a nou paradigma en la detecció de capes d'invisibilitat realistes, una de les aplicacions més importants dels metamaterials. Fins ara, el scattering cross section (SCS) s'ha utilitzat com a model de referència per a dissenyar i observar l'eficàcia d'aquests dispositius per a ocultar objectes. En el nostre estudi, vam demostrar que la ODT pot detectar les capes d'invisibilitat pràctiques amb una sensibilitat superior a la que ofereix el SCS, fins i tot a les freqüències de treball òptimes. A més, és possible obtindre una imatge representativa de la grandària i la forma de la capa, revelant clarament la seua existència. Finalment, es discuteixen les conclusions extretes dels resultats obtinguts i es detallen les futures línies de treball per a abordar els reptes que no s'han completat en aquesta tesi doctoral. / [EN] Diffraction Tomography arises to improve previous imaging techniques by considering the wave nature of light. Whereas the first medical imaging systems relied only on non-diffracting sources, this approach results in an enhanced reconstruction of the object's refractive index distribution, allowing, for example, the study of subcellular structures. Likewise, the demand for increasingly faster and secure telecommunication networks led to the advent of photonics. Two decades ago, the combination of these two fields gave rise to the first optical diffraction tomography (ODT) systems, which have rapidly evolved during this century. In this thesis, we present two novel applications of ODT. The first one is related to the concept of tomographic phase microscopy (TPM), a version of ODT that enables the study of isolated cells, with many applications in biomedicine, such as the diagnosis and prognosis of cancer. Nevertheless, current TPM systems are expensive, heavy, and cumbersome. To solve these issues we propose the concept of on-chip TPM. For this purpose, we design a roadmap towards the first integrated tomographic device in the frame of lab-on-a-chip (LoC) technology and develop the first steps to this end: 1) Until now, only flat detectors have been used to obtain the refractive index maps of the objects studied in TPM, based on the detection of the forward scattering. However, fundamental physical principles indicate that measuring also the backscattered field should improve the resolution of the images. Moreover, a flat detector is not the optimal configuration for on-chip TPM. In this vein, we have explored the possibility of using circular detectors in this scenario as a more suitable technique for on-chip configurations, demonstrating at the same time that this approach provides a better resolution than the linear one. 2) We propose a TPM on-chip scheme based on the use of dielectric nanoantennas as the ODT light source and detector pixels, and experimentally characterize their near-field behavior via scanning near-field optical microscopy. As for the second application, we study the potential of ODT as a new paradigm in the detection of realistic invisibility cloaks, one of the most important applications of metamaterials. Up to now, the scattering cross section (SCS) has been used as the gold standard to design and observe the effectiveness of these devices in hiding objects. In our study, we show that ODT can detect practical invisibility cloaks with a higher sensitivity than that offered by the SCS, even at the optimal working frequencies. Moreover, it is possible to obtain an image depicting the size and shape of the cloak, clearly revealing their existence. Finally, the conclusions drawn from the obtained results are discussed. In addition, future lines of action to address the challenges that have not been completed in this doctoral thesis are detailed. / Díaz Fernández, FJ. (2021). Novel Applications of Optical Diffraction Tomography: On-chip Microscopy and Detection of Invisibility Cloaks [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/180125