Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica. Área de especialización: Bioquímica Clínica / Introducción: El Cáncer de Ovario Epitelial (COE) es el cáncer ginecológico con mayor mortalidad en mujeres post-menopáusica. Su carcinogénesis y progresión neoplásica es atribuida a múltiples moléculas relacionadas con la proliferación, diferenciación y angiogénesis; entre las cuales, se ha estudiado el factor de crecimiento neuronal (NGF), su receptor de alta afinidad (TrkA) y el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), que aumentan su expresión a medida que COE pierde su diferenciación. Además, las isoformas del Receptor de Estrógenos α y β (REα y REβ), que poseen efectos antagónicos de proliferación celular, modifican su expresión en COE al compararla con epitelio ovárico normal. Esto sugiere que los cambios en la expresión de ambos RE es un evento importante en la progresión de COE. Objetivos:1)Determinar la localización subcelular de REα, p-REα ser 118 y REβ y semicuantificar su expresión, en el epitelio superficial de ovario normal funcional e inactivo, tumores ováricos benignos, borderline y COE seroso grado I, II y III. 2) Evaluar si NGF modifica la inmunodetección de REα, p-REα ser 118 y REβ en explantes de COE. 3)Analizar si las gonadotrofinas (LH y FSH) modifican la inmunodetección de REα, p-REα ser 118 y REβ en explantes de COE Metodología: Estudio ex-vivo: Se utilizaron biopsias de ovario pertenecientes a los siete grupos de estudio que siguen una progresión neoplásica de COE, incluidas en parafina para evaluación histológica y posterior estudio de Inmunodetección de las isoformas de RE por Inmunohistoquímica (IHQ). Estudio in-vitro: Se utilizaron explantes de COE estimulados por dos horas con NGF, FSH, LH y la mezcla de ambas gonadotrofinas. Luego se incluyeron en parafinas para su posterior análisis de Inmunodetección de las isoformas de RE por IHQ. Resultados: Estudio ex–vivo: REα se localiza en el núcleo de células epiteliales y estromales de todos los grupos de estudio, manteniendo constante su detección durante la progresión neoplásica de COE. pREα se localiza a nivel nuclear en ambos compartimentos de los grupos de estudio, aumentando su expresión en forma significativa desde Ovario normal funcional hasta Borderline (p < 0.01), sin embargo su expresión disminuye drásticamente en COE I, para volver a aumentar en forma significativa hasta COE III (p < 0.01). REβ se localiza principalmente en el citoplasma de células epiteliales y estromales de todos los grupos de estudio, sin hacer un cambio en su inmunodeteccion entre los grupos estudiados. REβ se expresa también en el núcleo de las células epiteliales y estromales de Ovario normal funcional hasta Tumor ovárico benigno con una expresión ascendente (p < 0,05), y luego desaparece su expresión nuclear en los tres grados de diferenciación de COE (p < 0.01). Estudio in– vitro: Existe un aumento de la Inmunodetección de pREα en células epiteliales de explantes de COE al estimularlos con concentraciones crecientes de NGF. No existen cambios significativos de la expresión de las tres isoformas de RE al estimularlos con FSH, LH y la mezcla de ambas gonadotrofinas. Conclusión: La Inmunodetección de REα total no se modifica durante la progresión neoplásica de COE, mientras que REβ disminuye desde tumor benigno hasta COE II; aumentando así la relación REα/REβ. La Inmunodetección de pREα aumenta significativamente desde COE I hasta COE III. Este último resultado, junto al aumento de pREα por efecto de NGF en explantes de COE, podría sugerir que existe una activación de REα por vía no clásica ligando independiente, a través de la transducción vía MAPK/ERK desencadenada por la unión de factores de crecimiento y sus respectivos receptores, entre ellos NGF a través de TrkA

Tesis Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al título de Bioquímica / El receptor de alta afinidad de la neurotrofina NGF, TRKA, ha sido asociado con distintos tipos de cáncer, pudiendo encontrarse isoformas de este receptor. En el cáncer ovárico no se han descrito isoformas de este receptor, sin embargo, se ha determinado un aumento de la forma activa de TRKA, relacionándolo con una baja sobrevida. En una línea celular de ovario de hámster chino, el ectodominio de TRKA puede ser liberado mediante un corte proteolítico, quedando activado constitutivamente un fragmento del receptor formado por los dominios intracelular y transmembrana. La detección de este fragmento disminuye al expresar una forma inactiva de ADAM17 (una de las proteasas más estudiadas de la familia de proteínas ADAMs). Estos antecedentes llevaron a postular que en el cáncer ovárico epitelial humano se expresan isoformas del receptor TRKA, siendo una o más de ellas, cortada por ADAM17, resultando en la detección de una forma proteica fosforilada adicional del receptor, constituida sólo por sus dominios intracelular y transmembrana. Para lograr los objetivos de este trabajo se realizaron experimentos ex–vivo en muestras de tejidos ováricos humanos, con el fin de determinar la presencia de transcritos e isoformas del receptor TRKA, además de los niveles proteicos de ADAM17. También, se realizaron experimentos in-vitro con líneas celulares de ovario humano, para evaluar las isoformas de TRKA que experimentan un corte por efecto de ADAM17. Resultados de este trabajo mostraron la presencia de tres transcritos del receptor TRKA en ovario, con mayores niveles en muestras de cáncer más avanzado. Detectamos tres isoformas de este receptor en muestras de ovario y, adicionalmente, una isoforma de TRKA-p de 41kDa, cuyos niveles se encuentran aumentados en muestras de cáncer ovárico. Adicionalmente, encontramos mayores niveles proteicos de ADAM17 en muestras de cáncer ovárico avanzado, en comparación con muestras de tumores borderline. También se encontró una correlación positiva entre los niveles proteicos de ADAM17 y de TRKA en cáncer ovárico e, interesantemente, se observó una sob posici n (“merge”) s tincion s ambas proteínas al realizar la Inmunofluorescencia. Nuestros resultados muestran por primera vez la presencia de tres transcritos e isoformas de TRKA en ovario humano, además de una forma corta de TRKA-p (41 kDa), posiblemente producto de un corte proteolítico por la potencial acción de ADAM17. La presencia de una isoforma truncada fosforilada del receptor TRKA en cáncer ovárico epitelial tendría gran utilidad clínica, ya que podría servir como marcador pronóstico y como posible blanco terapéutico / TRKA is the high affinity receptor for the neurotrophin NGF. There are reports about isoforms of this receptor, but so far none have been detected in ovary. Phosphorylated TRKA receptor (p-TRKA) is highly expressed in epitelial ovarian cancer; nevertheless, it is not known if TRKA is post-translationally processed to smaller molecular forms in ovarian carcinoma. Earlier studies in cell lines have shown that TRKA is proteolytically cleaved by the metalloprotease ADAM17, resulting in an isoform containing the phosphorylated transmembrane and cytosolic domains of the receptor. Therefore, the aim of this study was the detection of isoforms of TRKA receptor in epithelial ovarian cancer, being one or more of them cleaved by ADAM17, resulting in an additional phosphorylated form of TRKA, containing its transmembrane and cytosolic domains. We analyzed the TRKA mRNA and protein levels, as well as protein levels of ADAM17, in human tissues. We also studied the cellular localization of these proteins in human cell lines. Using PCR analysis, we found three transcripts of TRKA in ovary, with higher levels in poorly differentiated epithelial ovarian cancer tissues. On the other hand, we found three isoforms of the receptor, as well as an additional form of 41 kDa by Western blot; with higher levels of these isoforms of TRKA in cancer samples. When ADAM17 was evaluated in ovarian tissues by immunohistochemistry, we found that this protein was mostly seen in epithelial cells, and a progressive increase in protein abundance with the progression of epithelial ovarian cancer. We also found a positive correlation between ADAM17 and TRKA protein levels in ovarian cancer, as well as a merge between both proteins by immunofluorescence. These results show for the first time the presence of isoforms of TRKA in ovary, as well as an additional form of 41 kDa of the receptor Besides, ADAM17 and the different isoforms of the TRKA receptor levels were found to be higher in more advanced stages of the disease. Also, a positive correlation was found between ADAM17 and TRKA receptor levels during different stages of ovarian cancer. This additional phosphorylated form of the TRKA receptor found in ovarian cancer tissues may be of great clinical significance, since it could be used as a new therapeutic target

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El cáncer ovárico epitelial (COE) es el cáncer ovárico más común, siendo en Chile la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Un aspecto importante para la mantención y progresión tumoral es el establecimiento de nueva vasculatura. En COE, NGF y su receptor TRKA son mediadores directos de angiogénesis in vitro, e indirectos al inducir la expresión y secreción de VEGF. El factor transcripcional RUNX2 induce procesos oncogénicos como proliferación, migración e invasión celular. Adicionalmente, se cree que RUNX2 puede ser un mediador de angiogénesis tumoral, ya que en varios modelos de cáncer promueve la expresión de VEGF y sus niveles proteicos se incrementan en hipoxia. En COE, RUNX2 los niveles se relacionan con mal pronóstico y en modelos in vitro promueve proliferación, migración e invasión en células de cáncer ovárico, sin embargo, no existen estudios que busquen vincularlo con angiogénesis en este cáncer. Hipótesis: En cáncer ovárico epitelial se produce un aumento en los niveles de RUNX2, y en la línea celular A2780 de cáncer ovárico sus niveles son incrementados por los factores proangiogénicos NGF e hipoxia cuando se comparan con la línea celular HOSE de epitelio superficial ovárico normal. Objetivos: Establecer si RUNX2 se expresa en cáncer ovárico epitelial, si sus niveles se incrementan con la progresión de la transformación maligna del epitelio ovárico, y determinar si en el modelo de líneas celulares, RUNX2 es aumentado por las condiciones proangiogénicas de hipoxia y estímulo con NGF. Metodología: Se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en tejidos ováricos (OVI, ovario normal inactivo; TBE-TBO, tumores ováricos Benignos y Borderline; y COE) mediante Western Blot, y a través de inmunohistoquímica se determinó el % células positivas con RUNX2 nuclear. En las líneas celulares HOSE y A2780 se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en extractos totales y en fracciones subcelulares mediante Western Blot, y su localización subcelular mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se realizaron estímulos con NGF, CoCl2 y ensayos de hipoxia en ambas líneas celulares, para posteriormente determinar los niveles proteicos de RUNX2 y HIF-1α por Western Blot. Resultados: Se determinó que los tejidos ováricos correspondientes a TBE-TBO y COE presentaron un mayor porcentaje de células positivas para RUNX2 nuclear respecto a lo observado en OVI. Por otro lado, ambas líneas celulares, HOSE y A2780, presentaron RUNX2 con localización principalmente nuclear, mostrando la línea HOSE niveles más altos respecto a la línea A2780. Los estímulos con NGF y CoCl2 no modificaron los niveles proteicos de RUNX2 en las líneas celulares en las condiciones analizadas. Por otra parte, se determinó que en la línea celular HOSE los niveles de RUNX2 disminuyen durante hipoxia, manteniéndose constantes los de HIF-1α. En el caso de las células A2780, no se observaron cambios en los niveles de las proteínas RUNX2 y HIF-1α en condiciones de hipoxia. Conclusiones: El presente trabajo permite concluir que los tejidos transformados de epitelio ovárico poseen un alto porcentaje de células con RUNX2 nuclear. Consistente con esto, la línea celular A2780 presenta altos niveles de RUNX2 en el núcleo, sugiriendo estos antecedentes un rol de RUNX2 en COE. Por otro lado, en las condiciones evaluadas, NGF e hipoxia no produjeron cambios en los niveles de RUNX2 en las líneas celulares. Proyección: Es necesario realizar nuevos ensayos para determinar con certeza si las condiciones proangiogénicas de NGF e hipoxia pueden inducir angiogénesis a través de RUNX2 en COE. En el caso de NGF es necesario evaluar si este puede influenciar la actividad transcripcional de RUNX2, y en el caso de hipoxia, se requiere modificar las condiciones experimentales para determinar con mayor seguridad si la restricción de oxígeno afecta los niveles de RUNX2 / Epithelial ovarian cancer (COE) is the most common ovarian cancer, being Chile the second cause of death due to gynecological neoplasias. An important aspect for tumor maintenance and progression is the establishment of new vasculature. In COE, NGF and its TRKA receptor are direct mediators of in vitro angiogenesis, and indirectly by inducing VEGF expression and secretion. RUNX2 transcriptional factor induces oncogenic processes such as cell proliferation, migration and invasion. In addition, it is believed that RUNX2 may be a mediator of tumor angiogenesis, since in several cancer models it promotes the expression of VEGF and its protein levels increase in hypoxia. In COE, RUNX2 levels are related to poor prognosis and in vitro models promote proliferation, migration and invasion in ovarian cancer cells, however, there are no studies that seek to link it with angiogenesis in this cancer. Hypothesis: In epithelial ovarian cancer there is an increase in RUNX2 levels, and in the A2780 cell line of ovarian cancer their levels are increased by the proangiogenic factors NGF and hypoxia when compared to the HOSE cell line of normal ovarian surface epithelium. Objective: To establish whether RUNX2 is expressed in epithelial ovarian cancer, if its levels increase with the progression of malignant transformation of ovarian epithelium, and to determine if RUNX2 is increased in the cell lines model by the proangiogenic conditions of hypoxia and stimulation with NGF. Methods: RUNX2 protein levels in ovarian tissues (OVI, normal ovary, TBE-TBO, Benign ovarian tumors and Borderline, and COE) were evaluated by Western Blot, and by means of immunohistochemistry the percentage of RUNX2 nuclear positive cells was determined. In the HOSE and A2780 cell lines the protein levels of RUNX2 in total extracts and subcellular fractions were evaluated by Western Blot, and its subcellular localization by immunocytochemistry. Additionally, stimuli were performed with NGF, CoCl2 and hypoxia assays in both cell lines, to later determine the protein levels of RUNX2 and HIF-1α by Western Blot. Results: It was determined that the ovarian tissues corresponding to TBE-TBO and COE presented a higher percentage of RUNX2 nuclear positive cells than observed in OVI. On the other hand, both cell lines, HOSE and A2780, presented RUNX2 with mainly nuclear localization, showing the line HOSE levels higher than the line A2780. The stimuli with NGF and CoCl2 did not modify the protein levels of RUNX2 in the cell lines in the conditions analyzed. On the other hand, it was determined that in the HOSE cell line the levels of RUNX2 decrease during hypoxia, keeping those of HIF-1α constant. In the case of A2780 cells, no changes were observed in the levels of the RUNX2 and HIF-1α proteins under conditions of hypoxia. Conclusions: The present work concludes that the transformed tissues of ovarian epithelium possess a high percentage of cells with nuclear RUNX2. Consistent with this, the A2780 cell line presents high levels of RUNX2 in the nucleus, suggesting this background a RUNX2 role in COE. On the other hand, under the conditions evaluated, NGF and hypoxia did not produce changes in the RUNX2 levels in the cell lines. Projection: Further testing is required to determine with certainty whether the proangiogenic conditions of NGF and hypoxia may induce angiogenesis tHRPough RUNX2 in COE. In the case of NGF it is necessary to evaluate if this can influence the transcriptional activity of RUNX2, and in the case of hypoxia, it is necessary to modify the experimental conditions to determine more safely if the oxygen restriction affects RUNX2 levels / Fondecyt

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica. Área de especialización: Bioquímica Clínica / El cáncer ovárico representa la segunda causa de muerte de origen ginecológico, y el 80-90% corresponde a carcinoma ovárico epitelial (COE), del cual el 40% es de tipo seroso. Esta patología se caracteriza por presentar un transcurso silente, una detección tardía, responder pobremente a terapias, ser altamente angiogénico y de sobrevida muy baja. La etiología del COE no está clara y se postulan varias hipótesis al respecto. En carcinoma de páncreas, colon, tiroide papilar y medular, próstata y neuroblastoma, se ha reportado una sobreexpresión del receptor tirosina kinasa (trkA). En cuanto a su ligando, el factor de crecimiento nervioso (NGF) se ha reportado su participación directa e indirecta a través de su receptor trkA, en la angiogénesis, evento crucial para el desarrollo y progresión del tumor. El factor angiogénico más estudiado es el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y se ha encontrado una sobreexpresión de las isoformas 121, 165 y 189, las cuales aumentan por efecto de NGF en explantes de cáncer ovárico epitelial. Si bien, ya se sabe que el receptor trkA y su ligando NGF participan en la angiogénesis del ovario, no hay antecedentes claros que indiquen si el receptor trkA y su ligando NGF están involucrados en la génesis y progresión del COE. Por lo que nos planteamos la siguiente Hipótesis:trkA modifica su expresión durante la carcinogénesis ovárica constituyendo un nuevo marcador tumoral. Para desarrollar este estudio nos propusimos el siguiente Objetivo General: Evaluar los niveles del receptor trkA y de NGF, durante las distintas etapas de transición del epitelio ovárico (desde el tejido ovárico normal al cáncer ovárico epitelial) y si esta expresión se relaciona con la expresión de VEGF. Metodología: En 30 muestras de ovarios: ovarios inactivos (OV-I), tumores benignos (T.Ben), borderline (T.Bord) y COE grados I, II y III (n=5 para cada grupo), se evaluó la localización celular y niveles proteicos del receptor trkA total, trkA-p, NGF y VEGF mediante inmunohistoquímica (IHQ). Para la semicuantificación se sumaron los porcentajes de las intensidades 2 y 3 y se expresó como el porcentaje de células con tinción positiva en el epitelio. Además, en tejidos congelados se analizaron los niveles de mRNA del receptor trkA, NGF y VEGF por RT-PCR, los resultados por PCR fueron normalizados con el gen constituivo β – actina. Resultados: Se encontró un aumento discreto en los niveles de mRNA de NGF durante la progresión carcinogénica, y estos aumentos fueron significativos entre OV-I vs COE I, COE II COE III (p<0,05). En cuanto a la expresión proteica de NGF, también se encontró un aumento significativo entre OV-I vs COE II y COE III (p<0,01). Los productos de splicing alternativos que codifican para las isoformas de VEGF 121, 165 y 189 aumentaron significativamente durante la progresión carcinogénica. VEGF 121 aumentó significativamente entre OV-I vs COE I, II y III vs (p<0,001). VEGF 165 aumentó significativamente entre OV-I vs COE I, II y III (p<0,001), y para VEGF 189 entre OV-I vs COE I, COE II y III (p<0,01). En cuanto a la expresión proteica de VEGF, se encontró un aumento durante la progresión, el cual fue significativo entre OV-I vs COE I, II y III (p< 0,001). Se encontró un aumento gradual y significativo en los niveles de mRNA de trkA, a medida que se va perdiendo la diferenciación celular. Este aumento fue significativo entre T.Bord vs COE I, COE II y III (p<0,01), COE I vs COE III (p<0,001) y COE II vs COE III (p<0,01). En las muestras de ovario normal inactivo y tumores benignos no fue posible encontrar la expresión génica de trkA, en parte por la poca cantidad de epitelio que encontramos en estos grupos. En cuanto a la expresión proteica del receptor trkA total, se observó un aumento gradual y significativo durante la progresión; principalmente entre OV-I vs COE I, II y III (p<0,001). De igual forma, los niveles proteicos del receptor activo p-trkA, aumentaron significativamente durante la progresión del COE, entre COE I vs COE III (p<0,01). En los grupos de OV-I, T.Ben y T.Bord, no se encontró tinción positiva para p-trkA. Discusión: Tanto la expresión proteica del receptor trkA total y p-trkA, como los niveles de mRNA de trkA, aumentan durante la progresión carcinogénica, principalmente entre los COE, y dichos aumentos se elevan significativamente con la indiferenciación del tejido, lo que confirmaría su posible uso como marcador de progresión del COE y también como marcador de mal pronóstico, ya que la proteína p-trkA se detectó desde COE I en adelante y a nivel de mRNA no fue detectado en los grupos de ovario inactivo y tumor benigno, sólo a partir de los tumores borderline comienza a detectarse pero muy débilmente, a diferencia de lo que ocurre en COE donde su expresión génica como proteica es muy alta. Este aumento en la expresión proteica de trkA durante la progresión se correlaciona positiva y significativamente con la expresión proteica de NGF y VEGF. Estos últimos corresponden a factores proangiogénicos, importantes para el desarrollo, progresión y metástasis tumoral

Magister en Bioquímica área de especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al título profesional de Bioquímica / En el cáncer ovárico epitelial (COEI), el ovario pierde el control normal de la angiogénesis. El COE exhibe alta expresión del Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), un factor proangiogénico. Por otro lado, la calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional con propiedades anti-angiogénicas. Su exposición en la cara extracelular de la membrana plasmática de células tumorales en proceso de muerte celular es necesaria para que éstas sean reconocidas y fagocitadas por células dendríticas. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de CRT en muestras humanas: ovarios normales inactivos, tumores benignos, tumores borderline y muestras de cáncer ovárico epitelial. Además, evaluar si el NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales normales de la superficie ovárica humana (células HOSE) y en una línea celular de cáncer ovárico epitelial (A2780). Los niveles de mRNA y proteicos de CRT fueron evaluados mediante RT-PCR, western-blot e inmunohistoquímica en un total de 67 muestras ováricas humanas. La expresión de CRT inducida por estimulación con NGF en líneas celulares fue evaluada por RT-PCR, western-blot e inmunocitoquímica. Los niveles de mRNA de CRT aumentaron en muestras de cáncer ovárico epitelial comparado con ovarios normales inactivos, tumores benignos y tumores borderline. Los niveles proteicos resultaron mayores en cáncer con respecto a tumores benignos y tumores borderline. Al estimular las líneas celulares HOSE y A2780 con NGF (100 ng/ml) por 30 minutos, no se observaron cambios estadísticamente significativos en los niveles de mRNA. Sin embargo, a través de inmunocitoquímica y western-blot se observó un aumento significativo en los niveles proteicos de CRT al estimular con NGF comparado con la situación control. Este efecto fue revertido por GW441756, un inhibidor específico del receptor de NGF, TRKA. Estos resultados sugieren que NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales ováricas mediante la activación de su receptor de alta afinidad TRKA / In epithelial ovarian cancer (EOC), the ovary loses the normal control of angiogenesis. EOC exhibits high expression of Nerve Growth Factor (NGF), a proangiogenic protein. On the other hand, calreticulin (CRT) is a multifunctional protein with anti-angiogenic properties. Its exposure on the cell membrane of dying tumor cells is necessary to promote their recognition and engulfment by dendritic cells. The aim of this work was to evaluate CRT expression in human samples: normal inactive ovaries, benign tumors, borderline tumors and epithelial ovarian cancer samples. Besides, to evaluate whether NGF regulates CRT expression in human ovarian surface epithelium cells (HOSE cells) and in an epithelial ovarian cancer cell line (A2780). Calreticulin mRNA and protein levels were analyzed by RT-PCR, western-blot and immunohistochemistry in 67 human ovarian samples. CRT expression induced by NGF stimulation in cell lines was evaluated by RT-PCR, western-blot and immunocytochemistry. CRT mRNA levels were elevated in epithelial ovarian cancer samples as compared to inactive normal ovaries, benign tumors and borderline tumors. CRT protein levels, evaluated by western-blot, were increased in epithelial ovarian cancer with respect to benign and to borderline tumors. When HOSE and A2780 cell lines where stimulated with NGF (100 ng/ml) for 30 minutes, no significant increase in CRT mRNA levels, evaluated by RT-PCR, was found. However, by immunocytochemistry and western-blot there was a significant increase in CRT protein levels after NGF stimulation, as compared to controls. This effect was reverted by GW441756, a TRKA specific inhibitor, receptor for NGF. These results suggest that Nerve Growth Factor regulates CRT expression in epithelial ovarian cells through TRKA activation, its high affinity receptor

Tesis Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Clínica Aplicada, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El cáncer ovárico epitelial (COE) es la primera causa de muerte por neoplasias ginecológicas en países desarrollados como Canadá, EE.UU e Israel. Específicamente en Chile, es la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Este cáncer se caracteriza por ser de diagnóstico tardío, debido a su sintomatología inespecífica, y poseer una pobre respuesta al tratamiento. Debido a lo anterior, es importante entender los mecanismos tanto de la génesis como del desarrollo de esta neoplasia. Actualmente, hay mucha literatura sobre los factores de crecimiento que están involucrado en la progresión del COE, así como también de aquellos factores de crecimiento que juegan un rol crítico en la carcinogénesis ovárica. En COE se sabe que la vía de señalización de TGF-β1 se encuentra alterada de modo que esta vía podría estar involucrada en la progresión de esta patología. Por otro lado, NGF y su receptor TRKA participan en la progresión del cáncer ovárico debido a su rol en la proliferación celular y angiogénesis. Estudios en nuestro laboratorio han reportado que a medida que progresa el cáncer ovárico epitelial, hay un aumento en los niveles de VEGF, NGF, receptor TRKA y su forma activa (p-TRKA). En otras patologías, se ha demostrado que TGF-β1 es capaz de aumentar los niveles de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), así como también que NGF puede inducir esta enzima en ovario bovino. COX-2 juega un papel importante en muchos tipos de cáncer y es clave en la síntesis de prostaglandinas a partir de ácido araquidónico, siendo la PGE2 la más común y ubicuamente producida. Se ha reportado que esta prostaglandina es capaz de inducir la expresión de VEGF y, por ende, promover la angiogénesis tumoral. Hipótesis: En cáncer ovárico epitelial, hay un aumento en los niveles de COX-2, y los factores de crecimiento NGF y TGF-β1, en forma independiente, aumentan los niveles de COX-2 y PGE2, induciendo un incremento en los niveles de VEGF en líneas celulares de cáncer de ovario. Objetivos: Evaluar si la presencia y el cambio en los niveles de COX-2 se relacionan con la progresión del COE; además, determinar si TGF-β1 o NGF aumentan los niveles de COX-2 y la producción de PGE2, y si este último induce un aumento en los niveles de VEGF en las líneas celulares de epitelio de la superficie ovárica humana (HOSE) y de cancer ovárico epitelial humano (A2780). Metodología: En los experimentos ex vivo se evaluaron los niveles de COX-2 en 36 muestras de tejido ovárico (6 OVI; 6 TBE; 6 TBO; 6 COE I; 6 COE II y 6 COE III) mediante inmunohistoquímica, western blot y RT-PCR. En relación a los experimentos in vitro, ambas líneas celulares se estimularon con TGF-β1 o NGF para determinar los niveles de COX-2, tanto por RT-PCR como western blot, y los los niveles secretados de PGE2 y VEGF en los medios de cultivo por inmunoanálisis. Resultados: La inmunotinción de COX-2 en las muestras de tejido ovárico muestra un aumento en los niveles proteicos de esta enzima a medida que progresa el cáncer ovárico epitelial. Acorde a lo anterior, mediante western blot y RT-PCR se aprecian mayores niveles de COX-2 en las muestras de tejido de cáncer ovárico en comparación con las muestras de ovario inactivo. En las líneas celulares de ovario, sólo la línea celular cancerígena A2780 respondió ante los tratamientos con NGF o TGF-β1 durante 2 horas, observando un aumento en los niveles del transcrito y proteína de COX-2 y de PGE2. Finalmente, al utilizar un inhibidor de COX-2 no se aprecia una disminución en los niveles de secreción de VEGF, por efecto de los tratamientos con NGF o TGF-β1. Estos resultados sugieren que el incremento en los niveles de VEGF por NGF, demostrado y publicado por nuestro grupo de laboratorio, puede ser sin la participación de PGE2. Proyecciones: Desde el punto de vista clínico, sería interesante evaluar qué procesos tales como proliferación, migración o invasión celular está modulando COX-2 y PGE2, por efecto de NGF o TGF-β1 en las células A2780. Adicionalmente, sería importante determinar a través de qué vía de señalización esta prostaglandina está mediando tales procesos, puesto que sería crucial tener una visión mucho más acabada de los mecanismos involucrados en esta patología. Considerando lo anterior, se podrían plantear nuevos blancos terapéuticos que permitan mejorar la sobrevida de las pacientes que padecen de este tipo de cáncer / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecological malignancies in developed countries like Canada, USA and Israel. Specifically in Chile, is the second leading cause of death from gynecological malignancies. This cancer is characterized by being diagnosed in advanced stages, due to its nonspecific symptoms, and have a poor response to therapy. Because of this, it is important to understand the mechanisms of both the genesis and development of this pathology. Currently, there are many information regarding the effect of growth factors involved in EOC progression as well as those growth factors that play a critical role in ovarian carcinogenesis. It is known that in EOC the signaling pathway of TGF-β is altered then could be involved in the progression of this disease. On the other hand, NGF and TRKA receptor are involved in ovarian cancer progression due to its role in cellular proliferation and angiogenesis. Studies in our laboratory have reported that during epithelial ovarian cancer progression, there is an increase in VEGF, NGF, TRKA and p-TRKA levels. In other pathologies, it has been demonstrated that TGF-β1 is able to increase cyclooxygenase-2 (COX-2) levels and that NGF can also induce this enzyme in bovine ovary. COX-2 plays an important role in many cancers and is essential in prostaglandin synthesis from arachidonic acid, where PGE2 is the most common and ubiquitously produced. It has been reported that this prostaglandin induces VEGF expression and thus promote tumor angiogenesis. Hypothesis: In epithelial ovarian cancer, there is an increase of COX-2 levels, and the growth factors NGF and TGF-β1, independently, increase COX-2 and PGE2 levels, inducing an increase in VEGF levels in ovarian cancer cell lines. Objectives: To evaluate whether the presence and change in COX-2 levels are associated with EOC progression; also to determine whether TGF-β1 or NGF increase COX-2 and PGE2 synthesis, and if the latter induces an increase in VEGF levels in human ovarian surface epithelium (HOSE) and human epithelial ovarian cancer (A2780) cell lines. Methods: In ex vivo experiments COX-2 levels were evaluated in 36 ovarian tissue samples (6 OVI; TBE 6; 6 TBO; 6 COE I; 6 COE II and 6 COE III) by immunohistochemistry, western blot and RT-PCR. In relation to in vitro experiments, both cell lines were stimulated with TGF-β1 or NGF to determine COX-2 levels by RT-PCR and western blot, and PGE2 and VEGF levels secreted into the culture medium by immunoassay. Results: Immunohistochemical detection of COX-2 in ovarian tissue samples shows an increase in protein levels of this enzyme with the progression of epithelial ovarian cancer. According to the above, by RT-PCR and western blot, higher COX-2 levels are observed in ovarian cancer compared to inactive ovary tissue samples. In ovarian cell lines, only A2780 cancer cell line responded to the treatment with NGF or TGF-β1 for 2 hours, observing an increase in transcript and protein COX-2 and PGE2 levels. Finally, when a COX-2 inhibitor is used, there is no decrease in VEGF secretion levels, by NGF or TGF-β1 effect. This results suggest that the increase of VEGF by NGF found and published by our group may be without the participation of PGE2. Projections: From the clinical standpoint, it would be interesting to evaluate what processes such as proliferation, migration or invasion is modulating COX-2 and PGE2, by effect of NGF or TGF-β1 in A2780 cells. Additionally, it would be important to determine what signaling pathway is mediating such processes, since it would be important to have a better understanding of the mechanisms involved in this pathology. Considering the above, it could propose new therapeutic targets to improve the survival of patients suffering this cancer / Fondecyt

Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer ovárico epitelial (COE) representa el 90% de los cánceres de ovario. Esta enfermedad presenta un transcurso silencioso y por lo tanto una detección tardía; es altamente angiogénico y tiene una pobre respuesta a la terapia con una baja sobrevida. Existen varias hipótesis sobre la etiología del COE, una de ellas postula que los andrógenos estimulan la proliferación de células epiteliales del ovario dentro de los quiste de inclusión y también del epitelio transformado. Con el fin de dilucidar el mecanismo molecular por el cual los andrógenos contribuyen al desarrollo del carcinoma ovárico, se realizaron estudios relacionando los andrógenos con vías de señalización de moléculas como el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1), el cual es un inhibidor de la proliferación celular. Además, existen reportes sobre el efecto de los andrógenos sobre factores pro-angiogénicos como NGF y VEGF. Estos antecedentes, sugieren que los andrógenos podrían estar participando de la génesis del cáncer y podrían ser responsables de cambios importantes en los niveles de expresión de moléculas como TGF-β1, NGF y VEGF. Por este motivo, se planteó la siguiente hipótesis; el andrógeno dihidrotestosterona (DHT) inhibe el efecto antiproliferativo de TGF-β1 e induce la expresión de factores angiogénicos, favoreciendo la proliferación celular y la angiogénesis en células de cáncer ovárico epitelial. El objetivo de este estudio fue evaluar la participación de DHT en la vía de señalización de TGF-β1 y en la expresión de factores angiogénicos en células de cáncer de ovárico epitelial. Para abordar este objetivo, la metodología fue diseñada en dos partes: 1.- experimentos ex-vivo, para lo cual se trabajó con muestras de ovario normal inactivo (OI) y cáncer ovárico epitelial pobremente diferenciado (COE) en donde se evaluó por IHQ los niveles de AR y de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 por IHQ y W-B. 2.- experimentos in-vitro con dos líneas celulares, HOSE (células epiteliales de la superficie ovárica) y A2780 (células de cáncer ovárico epitelial), las cuales fueron estimuladas con 0, 10 y 100 nM de DHT, por 48 y 72 h para evaluar las mismas proteínas que se evaluaron en tejidos por las técnicas de ICQ y W-B. Además, se realizaron experimentos con siRNA del receptor de andrógenospara confirmar la acción de los andrógenos en cáncer ovárico epitelial. Adicionalmente, se evaluó el ciclo celular por citometría de flujo, así como también, se evaluó los niveles de p21 por WB Resultados de nuestro trabajo, indicarían un aumento de los niveles del AR y una disminución de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 en COE versus OI. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las líneas celulares, donde también encontramos un aumento de los AR y una disminución de estas proteínas (TGFBR1 y TGFBR2) en la línea celular de cáncer ovárico epitelial A2780 versus la línea celular de epitelio normal de la superficie ovárica HOSE. Por otra parte, cuando estimulamos las células A2780 con DHT, observamos que los niveles de mRNA de TGF-β1 no fueron modificados por este andrógeno, sin embargo, los niveles de los receptores I y II de TGF-β1 disminuyeron significativamente (*p<0,05) a las 72 h con 100 nM de DHT. Estos resultados sugieren que el AR y TGF-β1 podrían participar en la regulación de la homeostasis tisular en el COE. Además, la disminución en los niveles de los receptores de TGF-β1 por efecto de DHT, sugiere que los andrógenos alterarían la vía de señalización de TGF-β1, lo que podría explicar el aumento en la proliferación celular de esta patología. El estudio del ciclo celular indicó que hay un aumento del porcentaje de células en fase S en las líneas celulares A2780, sin embargo, no se logró relacionar el efecto de DHT y TGF- β1 en la proliferación, probablemente por la cantidad de factores que están involucrados en este proceso. Por otra parte, se analizaron los niveles proteicos de p21 y se encontró que el tratamiento con DHT provocó una disminución en los niveles de p21, lo que podría relacionarse con una falla en la regulación del ciclo celular en células A2780, sin embargo, este efecto no se observó en las células HOSE. Finalmente, se analizó el efecto de DHT sobre los niveles de expresión de NGF y VEGF sin encontrar cambios en los niveles de mRNA y proteína de NGF en ninguna de las líneas celulares en estudio. Por otro lado cuando se analizó la secreción de VEGF, se observó una mayor secreción de este factor en células A2780 tratadas con DHT en comparación con las células HOSE en las mismas condiciones. En conclusión, los resultados obtenidos en tejido de COE y en la línea celular A2780 sugieren que la vía de señalización canónica de TGF-β estaría alterada en COE, donde los andrógenos podrían desempeñar un papel importante regulando negativamente la expresión de sus receptores (TGFBR1) lo que significaría que DHT al bloquear la vía de señalización canónica de TGF-β podría estar involucrado en la disminución de los niveles de p21. También es importante destacar que DHT tendría una participación importante en el proceso de angiogénesis, aumentando los niveles de VEGF, según lo encontrado en este trabajo. Estas fallas, entre otras, podrían contribuir a la progresión del cáncer de ovárico epitelial, siendo interesante dilucidar los mecanismos implicados en futuros estudios para contribuir con nuevas y efectivas terapias anti-carcinogénicas / Epithelial ovarian cancer (EOC) represents 90% of ovarian cancers. This disease has a silent course, a late detection. It is highly angiogenic and has a poor response to therapy, therefore a low survival. There are several hypotheses about the etiology of the EOC, one of them postulates that androgens stimulate the proliferation of epithelial cells within the ovary inclusion cyst and epithelium transformed. To elucidate the molecular mechanism by which androgens contribute to the development of ovarian cancer, studies were related the androgen with signaling pathway, such as transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), which is a cell proliferation inhibitor. In addition, there are reports on the effect of androgens on pro-angiogenic factors such as VEGF and NGF. These facts suggest that androgens could be involved in the genesis of cancer and could be responsible for significant changes in expression levels of molecules such as TGF-β1, NGF and VEGF. For these reasons, the following hypothesis is raised; the androgen dihydrotestosterone (DHT) inhibits the antiproliferative effect of TGF-β1 and induces the expression of angiogenic factors promoting cell proliferation and angiogenesis in epithelial ovarian cancer cells. The objective of this study was to evaluate the participation of DHT in the signaling pathway of TGF-β1 and expression of angiogenic factors in cells of epithelial ovarian cancer. To address this goal, the methodology was designed in two parts: 1. ex-vivo experiments with samples of inactive normal ovary (IO) and poorly differentiated epithelial ovarian cancer (EOC) and 2. Experiments in vitro with two cell lines, HOSE (ovarian epithelial cell surface) and A2780 (epithelial ovarian cancer cells), which were stimulated with 0, 10 and 100 nM DHT for 48 and/or 72 h. To answer each of the objectives, conventional RTPCR, qPCR, blot, immunocytochemistry, immunohistochemistry and western were used. The results indicate an increase of AR levels and a decreased of TGF-β1 receptors I and II (TGFBR2 and TGFBR1) in EOC versus IO. These results are in agreement with those obtained in cell lines, where we also found an increase in AR and a decrease in TGF-β1 receptors (TGFBR1 and TGFBR2) in epithelial ovarian cancer cells A2780 versus HOSE cells. Moreover, when stimulate A2780 cells with DHT, the mRNA levels of TGF-β1 were not modified by this androgen, however, the levels of TGF-β1 receptors I and II decreased significantly (* p <0.05) at 72 h with 100 nM DHT. These results suggest that AR and TGF-β1 may be involved in regulating tissue homeostasis in the EOC. Furthermore, decreased levels of TGF-β1 receptors and the effect of DHT in TGF-β1 canonical sinaling pathway, suggests that androgen could increase cell proliferation in this pathology. The cell cycle studies indicated that there is an increase in the percentage of cells in S phase in the cell lines A2780, however, failed to relate the effect of DHT and TGF-β1 in proliferation, probably because the number of factors are involved in this process. Moreover, the protein levels of p21 were analyzed and was found that the DHT treatment caused a decrease in p21 levels, which could be related to a failure in cell cycle regulation in A2780 cells, this effect was not observed in the HOSE cells. Finally, the effect of DHT on NGF and VEGF expression levels was analyzed. No changes were observed in mRNA levels or of NGF protein levels in both cells lines studied. Furthermore when VEGF protein levels were analyzed, it was found that the secretion of this factor was greater in A2780 cells treated with DHT compared to HOSE cells under the same conditions. In conclusion, these results of tissue and cell line A2780 suggest that the TGF-β canonical signaling pathway would be altered in EOC where androgens may play a role downregulating expression of its receptors (TGFBR1) and this could potentially be involved in the reduction of p21 levels. Is also important highlight as found in this investigation, androgens have an important role in the angiogenesis process, increasing the levels of VEGF. These failures, among others, could contribute to the progression of epithelial ovarian cancer, it is interesting to elucidate the mechanisms involved in future studies to contribute with new and effective anti-carcinogenic therapies / Fondecyt; Fondap