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Agrin and neuregulin are neurotrophic molecules well known for their roles at synapses in the peripheral and central nervous systems. The expression of these two molecules is not restricted to these sites however, as they are broadly expressed across multiple organ systems. What roles do agrin and neuregulin play within these alternate systems; what is the function of these molecules outside the nervous system? Here I investigate potential roles for agrin and neuregulin in inflammation. Inflammation is an immediate response by innate immune cells, primarily macrophages, to infection and is characterized by the synthesis of pro-inflammatory mediators. The innate immune system possesses multiple redundant mechanisms to locally control inflammation. The neuro-immune axis is one means of control. Often called the cholinergic anti-inflammatory pathway, it acts to regulate local inflammation via nerve-secreted acetylcholine signaling through the homopentameric α7 nicotinic acetylcholine receptors (α7nAChR) present on macrophages. Both agrin and neuregulin have been independently described to share an intricate relationship with acetylcholine receptors (AChR) in the nervous system. Agrin is best known for its role in AChR aggregation at the neuromuscular junction while neuregulin has related roles in AChR transcription, cell survival, communication and differentiation. Based on the common characteristics of synapses in the nervous and immune systems we were curious to see if agrin and neuregulin played analogous roles on macrophages. Here we show that agrin and its receptor dystroglycan are expressed on RAW264.7 macrophages. In addition, agrin treated macrophages demonstrate increased endogenous agrin and α7nAChR expression. By blocking α-dystroglycan (α-DG), a receptor for agrin, with an anti-α-DG antibody we further saw a reduction in agrin expression. We also show that agrin is able to aggregate surface α7nAChRs and transmembrane agrin co-localizes with α7nAChRs therein. Agrin appears to induce approximately a 15-fold increase in anti-inflammatory cytokine IL-10 in macrophages but does not increase pro-inflammatory cytokine TNF-α or IL-6 synthesis. Agrin-treated macrophages challenged with LPS, a potent activator of inflammation, exhibit a 57% decrease in IL-6. Macrophages treated with agrin also exhibit a 4-fold increase in STAT3, a regulator of anti-inflammatory action. The potential anti-inflammatory effects of agrin in the periphery parallel previous work describing the effects of neuregulin in the brain. Previous work completed by our lab suggests a role for neuregulin in augmenting the expression of α7nAChRs on microglia, the macrophages of the brain, but not in peripheral macrophages. Here we show that treatment of LPS challenged microglia with neuregulin produces an 88% decrease in IL-6 and a 33% decrease in TNF-α. These results indicate both agrin and neuregulin are able to induce an increase in α7nAChRs and augment the synthesis of pro- and anti-inflammatory cytokines in their respective systems. These results also further the support the evidence of neuro-immune crosstalk in the immune system. Taken together these results present two novel players in inflammatory regulation by macrophages in the periphery and CNS.

[Truncated abstract] Olfactory ensheathing glia (OEG) have been demonstrated to improve functional and anatomical outcomes after injury to the nervous system and are currently being trialled clinically. This thesis presents the investigation of two important issues in OEG biology. The first study (Chapter 2) investigates effects of different members of the neuregulin (NRG) family of molecules on the proliferation of OEG, as a means of quickly obtaining large numbers of cells for clinical or experimental use. We report that NRG-1β, but not NRG- 2α or NRG-3, has a significant proliferative effect. Furthermore, we report for the first time that use of different mitogens (forskolin and pituitary extract) commonly used to expand these cells in vitro, can have a significant effect on the responsiveness of OEG to added NRG in subsequent mitogenic assays. OEG grown initially with forskolin and pituitary extract exhibited increased basal proliferation rates in comparison to OEG originally expanded without these factors, and this increased rate of proliferation was sustained for at least 6 days following their withdrawal from the culture medium. We also report for the first time the expression pattern of ErbB2, ErbB3 and ErbB4 receptors on p75-selected OEG, and investigate their contribution to the NRG mitogenic effect by the use of inhibitory ErbB antibodies. Our second study (Chapter 3) seeks to clarify the role of OEG in promoting myelination of central nervous system neurons. In this study we have investigated the myelinating ability of OEG derived from embryonic (EEG), postnatal (PEG) and adult tissue (AEG) both in vitro and in vivo. OEG selected by p75-immunopanning were co-cultured with dissociated cultures of TrkA-dependant embryonic dorsal root ganglion (DRG) neurons. EEG, but not AEG or PEG, successfully myelinated DRG neurons in the presence of serum and/or ascorbate. AEG also failed to myelinate GDNF-dependant embryonic DRG cultures, and growth factor-independent adult DRG cultures. Transplantation of OEG into lysolecithin demyelinated spinal cord demonstrated distinct ultrastructural differences between transplants of OEG derived from animals of different ages. Furthermore, we demonstrate that clearance of degraded myelin from the lesion site appears to be more effective when animals are transplanted with EEG rather than AEG or Schwann cell preparations. These results suggest that myelinating potential of OEG in vitro and behaviour of these cells following transplantation in vivo are developmentally regulated.

[Truncated abstract] Neuregulins (NRG’s) are pleiotropic growth factors that participate in a wide range of biological processes. The family of membrane-bound growth factors bind to and activate ErbB receptors on adjacent target cells, mediating multiple biological processes. NRG-1, NRG-2 and NRG-3 are all highly expressed in the nervous system, where it has been shown that NRG-1 is important for neuronal development, migration, synapse formation and glial cell proliferation. Little is known, however, on the specific roles of NRG-2 and NRG-3, although it is apparent that despite similar expression patterns and overlapping receptor specificity, NRG-2 and NRG-3 do not compensate for the loss of NRG-1 and mediate their own distinct activities. … Subcellular localisation experiments showed that this domain is important for trafficking of the fulllength protein to various intracellular compartments in an activity dependent manner. In addition, the ICD is required to elicit a cell death response in cultured cells and provoke an elevated α-amino-3-hydroxyl-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA) response in organotypic neuronal cultures following transient expression of NRG-3. A yeast two-hybrid screen identified 14-3-3ζ and PICK1 as two proteins that interacte with the human NRG-3 ICD. These interactions were confirmed both in vitro and in vivo, and were further characterised at a molecular level. This study demonstrates the ability of NRG-3 to mediate signal transduction through a biologically active ICD; a conclusion supported by identifying cytoplasmic proteins that interact with the ICD. These observations point to an additional layer of complexity where bi-directional signalling contributes to the full repertoire of NRG-3 functions.

OBJETIVO: avaliar o efeito das neuregulinas 1-alfa e 1-beta na regeneração de nervos ciáticos de camundongos C57BL/6J, adultos, machos, através da técnica de tubulização. MÉTODOS: Utilizaram-se 18 animais, divididos em 3 grupos, implantando-se prótese de polietileno em falhas de 4,0 mm no nervo ciático esquerdo: grupo 1 contendo apenas colágeno purificado (Vitrogen®); grupo 2, colágeno associado a neuregulina 1-alfa; grupo 3 com colágeno e neuregulina 1-beta. O grupo controle foi formado por 6 segmentos de nervos ciáticos direitos. Após 4 semanas, os animais foram sacrificados; extraiu-se segmento do ponto médio do nervo regenerado no interior das próteses, padronizaram-se cortes histológicos e confecção das lâminas para análise histomorfométrica. Confrontaram-se os resultados estatisticamente. RESULTADOS: Os animais tratados com neuregulinas tiveram maior número de axônios mielinizados, com diferença estatisticamente significante quando comparados ao grupo colágeno. Não houve diferença estatística entre os grupos de neuregulinas 1-alfa e 1-beta. CONCLUSÃO: a adição de neuregulinas proporcionou aumento significativo do número de fibras mielinizadas. / PURPOSE: To evaluate the effect of neuregulins 1-alpha and 1-beta on the regeneration the sciatic nerves of male adult C57BL/6J mice, using the tubulization technique. METHODS: Eighteen animals were used, divided into three groups. A polyethylene prosthesis was implanted in a 4.0 mm defect of the left sciatic nerve, as follows: group 1 containing only purified collagen (Vitrogen®); group 2, collagen with neuregulin 1-alpha; group 3, collagen with neuregulin 1-beta. The control group was formed by six segments of right sciatic nerves. Four weeks later, the animals were sacrificed. A segment from the midpoint of the nerve regenerated inside the prostheses was extracted, histological sections were standardized and slides were made up for histomorphometric analysis. The results were statistically compared using the Tukey multiple comparisons test and Students t test. RESULTS: The animals treated with neuregulins had greater numbers of myelinized axons, with a statistically significant difference in relation to the collagen-only group. There was no statistical difference between the neuregulin 1-alpha and 1- beta groups. CONCLUSION: It was concluded that the addition of neuregulins provided a significant increase in the number of myelinized fibers.

Die Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung (CMT) stellt die häufigste erbliche periphere Polyneuropathie des Menschen dar. Betroffene leiden unter einer symmetrischen distal ausgeprägten Muskelatrophie, die mit motorischen und sensorischen Defiziten einhergeht. Bis heute existieren keine kurativen Therapieoptionen. Das liegt unter anderem daran, dass die Pathomechanismen der CMT und vor allem die Reaktion der Schwannzellen in chronischen Neuropathien noch nicht ausreichend verstanden sind. In einem Mausmodell der CMT1A, der häufigsten Subform der CMT, konnte gezeigt werden, dass die Ablation des Myelindicke-regulierenden Wachstumsfaktors Neuregulin 1 (Nrg1) eine Verbesserung der typischen Krankheitsmerkmale hervorruft. Dies zeigt, dass es in der CMT1A einen Zusammenhang zwischen der übermäßigen Expression des gialen Nrg1 und der pathologischen Schwannzell-Reaktion gibt. Die CMT1B ist der dritthäufigste CMT-Subtyp, welcher durch Mutationen im MPZ (Myelin Protein Zero) - Gen verursacht wird. Um zu untersuchen, ob ein Knockout von glialem Nrg1 auch in der CMT1B Erkrankung zu einer Verbesserung der Symptomatik führt, wurden in dieser Arbeit der Phänotyp, die Histopathologie und die Genexpression auf mRNA-Ebene in einem CMT1B Mausmodell analysiert: Nach Ablation von glialem Nrg1 zeigten die Versuchstiere eine herabgesetzte motorische Leistung im Griffstärke- und Rotarod-Test. Passend dazu ergab sich eine Verlängerung der M- und F-Wellendauer in den elektrophysiologischen Untersuchungen sowie eine erhöhte Anzahl a- und demyelinisierter Axone in den histologischen Untersuchungen. Interessanterweise war die Zahl der Schwannzellen und Zwiebelschalenformationen nach Ablation von glialem Nrg1 trotz Verschlechterung des Phänotyps stark rückgängig. Dies lässt den Schluss zu, dass diese für die CMT typischen histopathologischen Merkmale in der CMT1B – im Gegensatz zur CMT1A – nur eine geringe Rolle für die Krankheitsausprägung und -progression spielen. Vielmehr scheinen in der CMT1B Erkrankung de- und remyelinsierende Prozesse im Vordergrund zu stehen. Die Beobachtung, dass die Ablation der glialen Neuregulin 1 Signalwirkung die Anzahl der a- und demyelinsierten Axone signifikant erhöht, lässt die Vermutung zu, dass gliales Neuregulin 1 für die Remyelinisierung von Axonen in der CMT1B Erkrankung essentiell ist. Die Ergebnisse legen zudem nahe, dass Remyelinisierungsprozesse in chronischen Neuropathien einen wesentlichen Einfluss auf die Krankheitsausprägung und den klinischen Phänotyp haben. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass therapeutische Ansätze, die die Remyelinisierung fördern nicht nur im ZNS, sondern grundsätzlich auch im PNS erfolgreich sein könnten. Im Vergleich zu demyelinsierenden Erkrankungen des ZNS wird dem Prozess der Remyelinisierung in peripheren Neuropathien bis dato jedoch kaum Beachtung geschenkt. Des Weiteren wurden die Histopathologie und die Genexpression im longitudinalen Verlauf untersucht. Die proximal gelegenen Nerven, insbesondere die Vorderwurzeln, sind sowohl histopathologisch als auch auf Ebene der Schwannzell-Transdifferenzierungsfaktoren deutlich stärker betroffen als die distal gelegenen Nerven. Diesem Phänomen könnten unterschiedliche Ursachen zu Grunde liegen: Vorstellbar wäre eine Heterogenität in der Schwannzellpopulation entlang der peripheren Nerven, deren Folge verschiedene molekulare Charakteristika sowie eine divergierende Vulnerabilität für bestimmte pathologische und genetische Veränderungen sein könnte. Eine derartige Heterogenität könnte in der Entwicklung der Schwannzellen begründet sein. So entwickeln sich zwar alle Schwannzellvorläufer aus Zellen der Neuralleiste, die Schwannzellen der spinalen Nervenwurzeln entstammen jedoch speziellen Derivaten der Neuralleistenzellen, den sogenannten Boundary-Cap-Zellen. Neben unterschiedlichen Schwannzellpopulationen im proximalen und distalen Nerv - also primär intrinsischen Faktoren - könnte auch die Interaktion der Gliazellen mit anderen zellulären Komponenten im peripheren Nerv für den beobachteten Gradienten in der histologischen Krankheitsausprägung verantwortlich sein. Interessant erscheint hier insbesondere die Rolle der Axon-Glia-Interaktion und die Funktion axonaler Signale für die Integrität und Vulnerabilität der Schwannzelle. Zusammenfassend scheint es sehr vielversprechend die beobachteten Unterschiede im longitudinalen Verlauf weiter zu untersuchen, um die Pathogenese der CMT besser zu verstehen und somit die Grundlage für die Entwicklung suffizienter Therapieansätze zu schaffen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis I 1. Einführung 1 1.1 Das Nervensystem 1 1.2 Schwannzell-Entwicklung und Myelinisierung 3 1.3 Neuregulin 1 6 1.4 Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung 9 1.4.1 Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung 1B 13 1.4.2 Verbesserung der klinischen und histopathologischen Erkrankungssymptomatik im CMT1A Tiermodell nach Ablation von Nrg1 in Schwannzellen 15 2. Aufgabenstellung 17 3. Material und Methoden 18 3.1 Material 18 3.1.1 Chemikalien und Reagenzien 18 3.1.2 Verbrauchsmaterialien 19 3.1.3 Enzyme, Nukleinsäuren und Reaktionssysteme (Kits) 20 3.1.4 Puffer und Lösungen 20 3.1.5 Oligonukleotide 22 3.1.6 Geräte 24 3.1.7 Software 25 3.2 Methoden 26 3.2.1 Versuchstiere 26 3.2.2 Rotarod- und Griffstärke-Test 28 3.2.3 Elektrophysiologische Untersuchung 28 3.2.4 Histologische Methoden 30 3.2.5 Molekularbiologische Methoden 33 3.2.6 Statistik 41 4. Ergebnisse 42 4.1 Verschlechterung des Phänotyps im CMT1B Mausmodell nach konditionaler Ablation von glialem Neuregulin 1 42 4.2 Zunahme der Demyelinisierung sowie Abnahme der Zellkerne und Zwiebelschalenformationen in peripheren Nerven nach Nrg1-Ablation in Schwannzellen 47 4.3 Die Schwannzell-Transdifferenzierung ist nach Deletion von glialem Neuregulin 1 in proximalen Nerven rückläufig 55 4.4 Proximale Anteile in der longitudinalen Analyse peripherer Nerven von CMT1B Mäusen deutlich stärker betroffen 58 5. Diskussion 62 5.1 Im Gegensatz zum CMT1A Modell führt die Ablation von glialem Neuregulin 1 im CMT1B Modell zu einer Verschlechterung des Phänotyps 62 5.2 Die Expression von Transdifferenzierungsmarkern wird durch Ablation von Schwannzell Nrg1 reduziert 64 5.3 Proximale Anteile peripherer Nerven sind in der CMT1B stärker betroffen als weiter distal gelegene Anteile 67 6. Zusammenfassung 69 Abbildungsverzeichnis 71 Literaturverzeichnis 72 Anlagen 79

Neureguline (NDF, Heregulin, GGF ARIA, oder SMDF) sind EGF-ähnliche, extrazelluläre Signalmoleküle, die mit transmembranären Tyrosinkinaserezeptoren der ErbB-Familie interagieren. Neuregulin-1/ErbB Signale steuern während der Embryonalentwicklung und im adulten Organismus vielfältige zelluläre Prozesse, wie z. B. Proliferation, Migration und Differenzierung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des Neuregulin-1/ErbB Signalsystems in der Entwicklung von Neuralleistenzellen und sich daraus entwickelnden Komponenten des peripheren Nervensystems (sympathisches Nervensystem und periphere Glia) untersucht. Neuregulin-1 Signale werden in Neuralleistenzellen und ihren Gliaderivaten durch ErbB2/ErbB3 Rezeptor-Heterodimere übertragen. Mit Hilfe von Mäusen mit gezielter Mutation (knock-out) des Neuregulin-1, ErbB2 oder ErbB3 Gens wurde gezeigt, daß Neuregulin-1/ErbB2/3 Signale die Migration sympathogener Neuralleistenzellen steuern. Mutante Tiere entwickeln daher eine hochgradige Hypoplasie des sympathischen Nervensystems. Neuregulin-1 Signale kontrollieren darüber hinaus die Entwicklung von Schwann Zellen. Die Unterbrechung des Neuregulin-1/ErbB2/3 Signalwegs in mutanten Mäusen führt zum Verlust von Schwann Zellen während der Embryogenese. Es wurde außerdem gezeigt, daß der Transkriptionsfaktor Sox10 die Expression von ErbB3 in Neuralleistenzellen kontrolliert. Sox10 und ErbB3 Mutanten besitzen daher übereinstimmende Defekte in der Neuralleistenzellentwicklung. Neben den ErbB3-abhängigen Funktionen von Sox10 wurde eine ErbB3-unabhängige Schlüsselfunktion von Sox10 bei der Differenzierung von Neuralleistenzellen zu peripherer Glia identifiziert. Das Neuregulin-1/ErbB2/3 Signalsystem und der Transkriptionsfaktor Sox10 besitzen also gemeinsam zentrale Funktionen in der Entwicklung peripherer Glia, steuern diesen Prozess aber über unterschiedliche Mechanismen und während unterschiedlicher Entwicklungsphasen. Sox10, ErbB2 und ErbB3 mutante Mäuse entwickeln neben dem Verlust von Schwann Zellen eine sekundäre Degeneration begleitender sensorischer und motorischer Neurone. Dies zeigt, daß periphere Glia Signale generiert, die essentiell sind für Integrität und Überleben begleitender Neurone. / Neuregulins (NDF, heregulin, GGF ARIA, or SMDF) are EGF-like growth and differentiation factors that signal through tyrosine kinase receptors of the erbB family. The neuregulin-1 proteins and their receptors play essential roles during embryonic development and in the adult. Functions of the neuregulin/erbB signaling system in developing neural crest cells and their derivatives (sympathetic nervous system, peripheral glial cells) were analyzed in mice with targeted mutations in the erbB2, erbB3, or neuregulin-1 genes. All three mutations cause severe hypoplasia of the primary sympathetic ganglion chain, and migration of sympathogenic neural crest cells to their target sites, where they differentiate into sympathetic neurons, depends on neuregulin-1 and its receptors. Neuregulin-1 signals are also essential for the development of Schwann cells. As a consequence, mice with targeted mutations in the neuregulin-1/erbB signaling system completely lack Schwann cells. Moreover, the HMG-box transcription factor sox10 is shown to control expression of erbB3 in neural crest cells. In accordance, sox10 and erbB3 mutant mice share phenotypes in the developing neural crest. Additionally, a novel, erbB3-independent developmental function of sox10 was identified: Sox10 is a key regulator for glial fate determination in undifferentiated neural crest cells. Thus, the transcription factor sox10 and the neuregulin-1/erbB signalling system both serve critical functions during development of peripheral glial cells. However, they act via different cellular mechanisms and during different developmental stages. At later developmental stages lack of peripheral glial cells in sox10, erbB2 and erbB3 mutant mice results in a severe degeneration of sensory and motor neurons. The comparison of the mutant phenotypes demonstrates, that peripheral glial cells generate essential signals for the survival and maintenance of accompanying neurons.

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