Die Abschätzung der Prognose für Patienten, insbesondere Kinder mit onkologischen Erkrankungen stellt eine große Herausforderung an die behandelnden Ärzte dar. Vor Beginn einer Therapie werden daher viele Informationen gesammelt, um einen Patienten möglichst gut in eine vordefinierte Risikogruppe stratifizieren und dementsprechend eine mehr oder weniger intensive Therapie anbieten zu können. Diese Einteilungen sind allerdings für keinen Malignomtyp mit 100%-iger Sicherheit möglich. Das ist die Ursache dafür, dass auch in niedrige Risikogruppen eingeteilte Patienten nicht auf die Therapie ansprechen und einen unvorhergesehen schlechten Verlauf zeigen können. Auf der anderen Seite scheint es Patienten zu geben, die trotz initial schlecht eingeschätzter Prognose einen überaschend guten Verlauf nehmen, auf die Therapie gut ansprechen und letztlich geheilt werden können. Einen Beitrag zu leisten, um die Stratifizierung für Kinder, die an einem Neuroblastom erkrankt sind, zu verbessern und damit zu vermeiden, dass einige Patienten unter- oder andere Patienten übertherapiert werden müssen, ist das Ziel dieser Habilitationsarbeit. Zu diesem Zweck wurden differentielle, molekulare Marker in primären humanen Neuroblastomen identifiziert und deren prognostische Bedeutung dargestellt. Einzelne dieser Marker (differentiell expremierte mRNAs) wurden in Zellkultursystemen funktionell untersucht, um deren zellbiologische Funktion, die der jeweiligen prognostischen Bedeutung zugrunde liegen kann zu erklären. Desweiteren konnten genomische Merkmale des amplifizierten genomischen Abschnittes auf Chromosom 2p25 um MYCN beschrieben werden. Darauf basierend konnte eine patientenindividuelle und tumorzellspezifische PCR entwickelt werden (AFS-PCR), die sich als Marker für den Nachweis einer minimalen Resterkrankung eignet.

The aim of the current study is to study characteristics of high-risk cancer cells within the childhood disease neuroblastoma (NB) by mapping regrowth after treatment with the chemotherapy doxorubicin (doxo). The cell-line SK-N-BE(2)-C (BE(2)-C) was used as a model. Results from a previous study by Hultman et al., (2018) have indicated that while a majority of BE(2)-C cells could be shown resilient to a 1 μM dose of doxorubicin (doxo), only a very small fractions had the capacity for immediate replication following a single or double treatment of doxo (“remaining replicating cells”; RRC). The current study aims to investigate if RRC are responsible for regrowth. Cultured BE(2)-C cells were exposed to doxo and labelled with the nucleoside analogues EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) and BrdU (5-bromo-2-deoxyuridine). The results from the current study indicated that the RRC subpopulation might not be responsible for regrowth since the nucleoside labelling was not shown to be present in the cells of the regrowing colonies. However, technical challenges, e.g. the settings of thresholds for EdU and BrdU detection, in combination with the dilution of DNA markers in replication, call for further studies using additional methods, e.g. isotope markers, in order to firmly conclude that other subpopulation(s) than the RRC population are responsible for regrowth. Apart from studying cell populations responsible for regrowth, a pilot study was performed including another combination of treatment using an ATM-inhibitor (KU-60019) together with the chemotherapy doxo. There were some measurement points missing, but the current results indicate that regrowth is postponed when the ATM-inhibitor is added in combination with single or double treatment of doxo. The research procedures and processes involved in this thesis, are similar to those included in the syllabi for the natural science subjects for the upper secondary school. This underlines the importance of studying inquiry and laboratory work. A literature review was performed, analysing current research on open-and closed ended laboratory work. Ten research articles were collected and characterized by natural science subject, type of laboratory style (open or closed) and student learning competences. Findings from the current study indicate that open-ended laboratory work promotes student interest in the subject. The learning competences problem-solving ability and procedure ability are most commonly studied in laboratory work based on the results from the current study. / Syftet med studien är att studera hög-risk cancerceller inom barncancersjukdomen neuroblastom (NB), genom att kartlägga återväxt efter kemoterapi-behandling med doxorubicin (doxo). En multiresistent neuroblastom cell-linje med hög-risk egenskaper, SK-N-BE(2)-C( BE[2]-C), användes som modell. Enligt en tidigare studie på BE(2)-C celler, utförd av Hultman et al., (2018), kan efter en enkel eller dubbelbehandling med doxo majoriteten av cellerna överleva, men endast en mycket liten andel kan också omedelbart fortsätta dela sig. Dessa celler benämndes som ”kvarvarande replikerande celler” (RRC). I denna studie undersöktes hypotesen att RRC är ansvariga för återväxt efter doxo-terapi, hypotetiskt återspeglande situationen vid återfall hos patienten. BE(2)-C celler odlades in vitro i petriskålar, behandlades med doxo, och analyserades sedan i mikroskop genom att använda två kemiska markörer för cell-delning; EdU (5-etynyl-2’-deoxyuridin) och BrdU (5-bromo-2-deoxyuridin). Intressant nog, men något oväntat, indikerar resultaten att RRC troligen inte är ansvariga för återväxt. Detta skulle då tyda på att återväxten orsakas av andra cellpopulationer, utan förmåga att omedelbart efter kemoterapin fortsätta dela sig. Dock förekom tekniska utmaningar med valda metoder, t.ex. gränsvärdena för EdU- och BrdU-detektering, i kombination med utspädningen av DNA-markörer vid replikation. Därför krävs ytterligare studier med användning av andra metoder, t.ex. isotopmarkörer, för att fastställa vilka subpopulationer som är ansvariga för återväxt. Utöver att studera cellpopulationer ansvariga för återväxt så genomfördes även en pilotstudie med en kombination av doxo och annan typ av kemoterapi riktad mot cellens förmåga att reparera DNA skador; en ATM-inhibitor (KU-60019). Pilotstudien indikerar att återväxten av BE(2)-C förskjuts vid närvaro av KU-60019, både i kombination med enkel eller dubbelbehandling av kemoterapin doxo. Det naturvetenskapliga arbetssättet i denna studie, vilket inkluderas i ämnesplanerna för de naturvetenskapliga ämnena för gymnasieskolan, understryker betydelsen av att studera laborativt arbete. En litteraturstudie genomfördes med fokus på öppna och slutna laborationer. Tio forskningsartiklar analyserades och karaktäriserades; typ av laborationsstil (öppen eller sluten) och elevers lärandekompetenser. Resultatet från denna studie indikerar att öppna laborationer bidrar till att öka elevers intresse. Vidare visar resultatet att laborativt arbete i skolan inkluderar utvecklingen av främst problemlösningsförmågan och procedurförmågan. Forskningsprocedurer och processer involverade i detta examensarbete diskuteras.

Neuroblastom är en barncancer som uppstår ur det sympatiska nervsystemet och drabbar omkring 15 barn i Sverige varje år. Högriskvarianten är associerad med mycket hög dödlighet och risk för återfall, vilket tros ha att göra med att tumörernas ovanligt heterogena sammansättning tillåter resistenta subpopulationer att motstå konventionella behandlingsmetoder. Tidigare forskning har identifierat rubbade mekanismer för celldelning som ett tillvägagångssätt för tumörcellerna att överleva DNA-skador som kemoterapeutiska droger orsakar. I detta masterprojekt analyserades fem ultra-högrisk neuroblastomcellinjer i syfte att belysa deras progression genom celldelningen efter behandling med doxorubicin och/eller gemcitabin. Vidare identifierades ataxia telangesia mutated (ATM) serine/threonine kinase som ett essentiellt protein vid inhibering av celldelningen och i samband med reparation av DNA-skador, vilket bekräftades av förhöjt uttryck av fosforylerat ATM i alla fem cellinjer efter behandling med doxorubicin, gemcitabin, och/eller en kombination av båda. Återväxt av tumörcellerna efter inhibering av fosforylerat ATM i kombination med doxorubicin och gemcitabin analyserades sedan, och fördröjd återväxt noterades i en av cellinjerna efter kombinationsbehandling. Sammantaget har nya mekanismer för behandlingsresistens hos tumörceller identifierats och alternativa kombinationsbehandlingar har visat effekt på en av fem testade neuroblastomcellinjer. / Neuroblastoma is a pediatric cancer of the sympathetic nervous system that afflicts around 15 children annually in Sweden. Despite aggressive treatment, high-risk neuroblastoma is associated with a mortality of 50% and relapse rate of up to 60%, emphasizing the need for novel treatment options. In this study, fluoresce activated cell sorting was used to analyze cell cycle progression in five ultra-high-risk neuroblastoma cell lines: BE(2)-C, Kelly, SK-N-AS, SK-N-DZ, and SK-N-FI, post-treatment with doxorubicin and gemcitabine. In line with previous research, doxorubicin primarily induced cell cycle arrest in G2/M-phase and gemcitabine in the S-phase. Combined, the compounds induced varied effects, with accumulation primarily in the G1-and S-phase. Immunoblotting revealed elevated levels of phosphorylated ATM (pATM), a key regulator of cell cycle arrest and DNA damage signaling, across all five cell lines post-treatment to doxorubicin, gemcitabine, and/or the combination, indicating its vital role in their survival. Kelly stood out in both cell cycle progression and ATM phosphorylation, exhibiting minimal to no changes in cell cycle accumulation or pATM expression when exposed to the combined treatment, despite reacting to both monotherapies. These results may indicate that Kelly might implement an alternative mechanism of regulation compared to the remaining cell lines. To explore targeted inhibition of pATM, we employed the ATM kinase inhibitor KU-55933, which in BE(2)-C cells reduced expression levels of pATM when combined with doxorubicin, but not gemcitabine or the combination. Regrowth assays showed increased efficacy of doxorubicin and gemcitabine upon addition of the ATM kinase inhibitor KU-55933 in one of the tested cell lines in comparison to doxorubicin alone. However, longer incubation time is needed before the effect can be fully evaluated. These findings shed light on the differential cell cycle behavior in high-risk neuroblastoma cell lines exposed to combination therapy and suggest a vital role of ATM in the DNA damage response following doxorubicin and gemcitabine treatment. Further investigations are warranted to explore alternative strategies for enhancing the effectiveness of doxorubicin and gemcitabine in the treatment of this aggressive cancer subtype.

7 Abstract Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor of childhood. Despite advances in cancer diagnosis and therapy, the treatment of some forms of neuroblastoma is still complicated. One of the major complications of the chemotherapy is a developed drug resistance. This master thesis deals with the effect of cytostatics on protein and gene expression of selected proteins, which may contribute to chemoresistance of the human neuroblastoma cell line UKF-NB-4. The sensitive line UKF-NB-4 and the resistant line UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO and UKF-NB-4ELLI were exposed to cisplatin, doxorubicin, ellipticine for 24, 48 and 72 hours. The Western blot analysis showed that cytostatic agents cisplatin, doxorubicin or ellipticine added to the sensitive neuroblastoma cell line UKF-NB-4 in amounts which are added to resistant neuroblastoma cell lines in order to maintain resistance induced expression of p53 and reduced expression of retinoblastoma protein pRb after 72 hours of cultivation. Differences in the expression of RAS protein, cytochrome P450 1A1, 3A4 and cytochrome b5 has not been shown. Changes in the expression of the studied proteins in resistant lines UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO and UKF-NB-4ELLI cultured with and without cytostatic agents were not detected by the Western blot analysis....

Das Neuroblastom (NB) ist ein solider, extrakranieller Tumor neuroektodermalen Ursprungs, der sich im Kleinkindalter manifestiert. Ein etabliertes Zielantigen für die passive Immuntherapie beim NB ist das Disialogangliosid GD2. Aufgrund der geringen oder fehlenden Expression von MHC Klasse I Molekülen sowie der Tatsache, dass die Lyse von NB-Zellen durch verschiedene Mechanismen der natürlichen Zytotoxizität von NK-Zellen vermittelt werden kann, stellt eine auf NK-Zellen basierende Therapie einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung dieser Erkrankung dar. Auf dieser Grundlage wurde eine NK-Zelllinie generiert, die einen GD2-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimiert (NK-92-scFv(ch14.18)-zeta). Die Hauptbestandteile dieses CARs sind ein Einzelkettenantikörper, welcher die variablen Regionen des GD2-spezifischen Antikörpers ch14.18 enthält, und die CD3ζ-Kette als signaltransduzierende Komponente. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass NK-92-scFv(ch14.18)-zeta in der Lage sind, auch Chemotherapie-resistente GD2-positive NB-Zelllinien effektiv abzutöten und dass dabei die Interaktion des CARs mit GD2 den Hauptmechanismus darstellt. Die anti-tumorale Wirkung von NK-92-scFv(ch14.18)-zeta in vivo wurde in einem Chemotherapie-resistenten GD2-positiven Xenograft-Mausmodell gezeigt. Die wiederholte Applikation von NK-92-scFv(ch14.18)-zeta in Kombination mit IL-2 resultierte in einem signifikant verlangsamten Tumorwachstum und einem verbesserten Überleben. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen, dass GD2-spezifische NK-92 das Potential für eine zukünftige klinische Anwendung besitzen. Demnach stellt der Einsatz einer solchen GD2-spezifischen NK-Zelllinie, die unter GMP-Bedingungen expandiert werden kann und zu jeder Zeit in einer standardisierten Qualität verfügbar wäre, eine vielversprechende Alternative zur Behandlung von Hochrisikopatienten dar, deren Erkrankung nicht mehr auf die Standardtherapie anspricht. / Neuroblastoma (NB) is a solid extracranial childhood malignancy of neuroectodermal origin. The Disialoganglioside GD2 is an established antigen for passive immunotherapy of NB. Cellular therapy of NB with natural killer (NK) cells is especially appealing because MHC class I expression is absent or low in most NB, rendering this tumor sensitive to NK cell recognition. Additionally, natural cytotoxicity of NK cells, mediated by interaction of activating NK cell receptors and their respective ligands on tumor cells, has been shown to play a role in lysis of NB cells. It is therefore tempting to assume that a combination of passive immunotherapy with GD2-specific antibodies and adoptive transfer of NK effector cells would result in an improved NB therapy. To achieve this goal an NK cell line expressing a GD2-specific chimeric antigen receptor (CAR) was engineered: NK-92-scFv(ch14.18)-zeta. This CAR consists of a GD2-specific scFv-fragment, which was generated from ch14.18, and the CD3ζ-chain as intracellular signal-transducing domain. Within this thesis, GD2-specificity of NK-92-scFv(ch14.18)-zeta as well as efficacy towards GD2-expressing NB cell lines, including relapse cell lines that exhibit partial or multidrug resistance were demonstrated. Blocking the interaction between the CAR and GD2 resulted in almost complete abrogation of NK-92-scFv(ch14.18)-zeta-mediated lysis of GD2-positive NB cell lines in vitro, indicating that this interaction is the main mechanism of activation of NK-92-scFv(ch14.18)-zeta. Importantly, repeated application of NK-92-scFv(ch14.18)-zeta in combination with IL-2 significantly decreased tumor growth and prolonged survival of mice in an aggressively growing drug-resistant xenograft NB mouse model. These findings suggest that GD2-specific NK-92 has potential for a future clinical application as NB-specific effector cells that would be ready on demand in a standardized quality.

Das Neuroblastom, ein embryonaler Tumor des sympathischen Nervensystems, stellt durch seine außerordentliche Heterogenität klinisch eine große Herausforderung dar. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression der GATA-Transkriptionsfaktoren GATA-2, -3, -4 und des Kofaktors friend-of-GATA (FOG)-2 im Neuroblastom und im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem zu vergleichen. Davon ausgehend wurde die Rolle der Proteine im Neuroblastom näher untersucht. Es wurde gezeigt, dass alle vier Proteine in humanem Neuroblastom-Gewebe sowie in einer humanen Neuroblastom-Zelllinie (SH-SY5Y) exprimiert werden und nukleär lokalisiert sind. Lediglich Gata-4 wurde jedoch im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem der Maus nicht exprimiert. Die Einzigartigkeit von GATA-4 bestätigte sich auch durch Microarray-Analysen von 251 Neuroblastom-Proben. Während GATA-2, -3 und FOG-2 signifikant mit Markern für eine günstige Prognose assoziiert wurden, korrelierte die GATA-4 Expression mit MYCN-Amplifikation. Interessanterweise führte die lentivirale Überexpression von GATA-4 zu einer Proliferationsinhibition humaner Neuroblastomzellen (SH-SY5Y und SH-EP) sowie zu der verstärkten Expression von DPYSL3 und Bcl-2. Zudem konnte durch das Differenzierungsagens Retinsäure die GATA-4 Expression induziert werden. So wurde in dieser Arbeit bestätigt, dass normale Entwicklungsprozesse in prognostisch günstigen Neuroblastomen intakt sind. Umgekehrt sind in Tumoren mit schlechterer Prognose diese Prozesse gestört. Die in vitro verlangsamte Proliferation sowie die Induktion von Bcl-2 nach Überexpression von GATA-4 könnten in vivo bei der schlechteren Therapierbarkeit der prognostisch ungünstigen Neuroblastome eine Rolle spielen. Es ist bekannt, dass die Behandlung mit Retinsäure u. a. durch Bcl-2 zu einer Chemoresistenz führen kann. Da die Expression von GATA-4 durch Retinsäure induziert werden und GATA-4 die Expression von Bcl-2 verstärken kann, könnte GATA-4 an der Chemoresistenz beteiligt sein. / Neuroblastoma, an embryonal tumor of the sympathetic nervous system, remains clinically challenging due to its extreme heterogeneity. The aim of this study was to compare the expression of GATA transcription factors GATA-2, -3, -4 and the cofactor friend-of-GATA (FOG)-2 in neuroblastoma and in the developing sympathetic nervous system. The functional role of these proteins in neuroblastoma was subsequently investigated based on the results of the GATA expression studies. The analysis showed that all four proteins are expressed in human neuroblastoma tissue as well as in a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) and are localized in the cell nuclei. Only Gata-4, however, was not expressed in the developing murine sympathetic nervous system. Its uniqueness was also confirmed by microarray analyses of 251 neuroblastoma specimens. While GATA-2, -3 and FOG-2 were significantly associated with favorable prognostic markers, GATA-4 expression correlated with MYCN-amplification. Interestingly, lentiviral GATA-4 overexpression led to inhibited proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y and SH-EP) as well as to increased expression of DPYSL3 and Bcl-2. In addition, GATA-4 expression could be induced by the differentiation agent retinoic acid. In conclusion, it was confirmed that normal developmental molecular pathways are intact in prognostically favorable neuroblastoma. In contrast, these developmental processes seem to be defective in tumors with unfavorable prognosis. The slowed proliferation, as observed in vitro, as well as the induction of Bcl-2 brought about by GATA-4 overexpression may contribute in vivo to the difficult treatability of prognostically unfavorable neuroblastoma. It is known that treatment of neuroblastoma with retinoic acid can lead to chemoresistance, mediated by Bcl-2 amongst others. Since retinoic acid can induce the expression of GATA-4 and GATA-4 itself can enhance the expression of Bcl-2, GATA-4 could be involved in chemoresistance.

Das Neuroblastom ist der am weitesten verbreitete solide, extrakranielle Tumor im Kindesalter. Trotz intensiver Forschung sind die Überlebensraten von Patienten mit fortgeschrittenem Tumorwachstum nach wie vor schlecht. Die Idee, eine zelluläre, langanhaltende Immunantwort im Körper zu induzieren, vermittelt durch zytotoxische CD8+T-Zellen, die sich gegen den Tumor richten, scheint dabei besonders attraktiv. Als tumorassoziiertes Antigen (TAA) wurde zu diesem Zweck für diese Arbeit die murine Tyrosinhydroxylase (mTH), das Schrittmacherenzym der Katecholaminbiosynthese, gewählt, da sie in der Mehrzahl der Neuroblastome stark überexprimiert ist. Für die Impfexperimente wurden sog. DNA-Minigen-Vakzine, die für Peptide aus der mTH-Sequenz kodieren, konstruiert. Die Auswahl Minigen-Peptide erfolgte mit dem MHC-Klasse-I-Liganden-Vorhersageprogramm syfpeithi, welches drei vorhergesagte starke H2-Kk-Liganden lieferte (mTH3k). Außerdem wurden zwei weitere Vakzine hergestellt: als Negativkontrolle das Vakzin mTHlowest, dessen mTH-Peptide laut syfpeithi schlechte MHC-Klasse-I-Liganden darstellen und das Vakzin Ersatzepis, dessen Peptide auf der Oberfläche von murinen NXS2-Neuroblastomzellen aus MHC-Klasse-I-Komplexen isoliert werden konnten. Sowohl in prophylaktischen als auch therapeutischen Impfversuchen in Mäusen konnte das Tumorwachstum und die spontane Metastasierung in sekundäre Organe wie die Leber signifikant verhindert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, daß der Antitumoreffekt auf der Induktion mTH-spezifischer, zytotoxischer CD8+T Zellen (CTLs) beruht. Zusätzlich und insbesondere interessant für eine eventuelle klinische Anwendung eines auf der TH basierenden DNA-Vakzins verursachte das mTH-Minigen-Vakzin zumindest in Mäusen keine Aktivierung selbst-reaktiver CD8+T-Zellen. Alles in allem lassen die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse den Schluß zu, daß sich die Tyrosinhydroxylase als TAA in Form eines DNA-Vakzins zur adjuvanten Therapie des Neuroblastoms eignet. / Therapeutic vaccination against tumor antigens without induction of autoimmunity remains a major challenge in cancer immunotherapy. Here, we demonstrate for the first time effective therapeutic vaccination followed by eradication of established spontaneous neuroblastoma metastases using a tyrosine hydroxylase (TH) DNA minigene vaccine. We identified three novel mouse TH (mTH3) derived peptides with high predicted binding affinity to MHC class I H2-Kk according to prediction program syfpeithi and computer modeling of epitopes into MHC class I binding groove. Subsequently, a DNA minigene vaccine based on pCMV-F3Ub encoding for mutated ubiquitin (G76 to A76) and mTH3 was generated. Prophylactic and therapeutic efficacy of this vaccine was established following oral delivery using attenuated Salmonella typhimurium SL7207. Only mice immunized with mTH3 were free of spontaneous liver metastases. This effect was clearly dependant on ubiquitin and high affinity of the mTH epitopes to MHC class I. Specifically, we demonstrated a crucial role for minigene expression as a stable ubiquitin-Ala76 fusion peptide for vaccine efficacy. Interestingly, the unstable wild type ubiquitin-Gly76 vaccine was completely ineffective. The immune response following mTH3 DNA minigene vaccination was mediated by CD8+ T-cells as indicated by infiltration of primary tumors and TH specific cytolytic activity in vitro. Importantly, no infiltration was detectable in TH expressing adrenal medulla, indicating the absence of auto immunity. In summary, we demonstrate effective therapeutic vaccination against neuroblastoma with a novel rationally designed tyrosine hydroxylase minigene vaccine without induction of autoimmunity providing an important base line for clinical application of this strategy.

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Das Neuroblastom ist der dritthäufigste maligne Tumor im Kindesalter und ist für 15% der Todesfälle durch Krebs bei Kindern unter 14 Jahren verantwortlich. Viele molekularbiologische Vorgänge, die zu der heterogenen Prognose der Patienten beitragen, sind noch nicht verstanden. Als Hauptrisikomerkmal stellt sich die Amplifikation und erhöhte Expression von MYCN dar. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Prof. Christiansen zeigte MYCN Einfluss auf die Genregion von Thyroid Cancer 1 (TC1), das als neuer Marker für maligne Schilddrüsenkarzinome erkannt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurden erste Untersuchungen zur prognostischen Bedeutung von TC1 im Neuroblastom, sowie die Charakterisierung eines TC1 Überexpressionsphänotyps humaner Neuroblastomzelllinien unter Einfluss von MYCN durchgeführt. Es wurde ein Überexpressionsvektor von TC1 in die Neuroblastomzelllinie SH-EP eingebracht, welche über ein aktivierbares MYCN- Konstrukt verfügt. Dieser neue Phänotyp wurde bezüglich der Proliferation, des Zellzyklus und der Apoptose im Vergleich zu einer Kontrollzelllinie ohne Überexpression untersucht. Eine In-silico Recherche in der Versteeg Neuroblastomdatenbank ergab eine deutlich bessere Überlebenswahrscheinlichkeit für Patientin mit hoher TC1 Expression. Es konnte gezeigt werden, dass MYCN Amplifikation und Expression in einem Panel von Neuroblastom Zelllinien nicht mit der TC1 Expression korrelieren. Die spezifische Aktivierung von MYCN führte hingegen zu einer Expressionssteigerung von TC1. Weiterhin zeigte sich, dass eine TC1 Überexpression die Proliferation hemmt, indem es die MYCN induzierte G1- S- Phasen- Transition inhibiert. TC1 zeigt antiproliferative Eigenschaften im Zellkulturmodell und stellt sich als neuer prognostisch günstiger Parameter im Neuroblastom dar.

The childhood cancer neuroblastoma mostly affects children under the age of 2 and comprises 6% of all childhood cancers. Neuroblastoma has very diverse phenotypes caused by both inter- and intra-tumour heterogeneities. The phenotypes are classified as being either low- or high-risk. This project focuses on high-risk NB cell lines with various chemotherapy sensitivity. Titration studies with chemotherapy agents cisplatin or doxorubicin showed a proneness of p53 mutated cell lines to arrest in either the S- and/or the G2/M-phase, depending on the drug and the drug dosage, indicating on a dose-dependent cell cycle response. To potentially inhibit the cells from arresting a treatment assay with 3 cell cycle key-components, pATM, Chk1 and Wee1 inhibitors was done. An initial immunocytochemistry staining of the expression levels of pATM and Wee1 showed that pATM was upregulated for 5 out 7 tested cell lines, namely SK-N-SH, SK-N-FI, Kelly, SK-N-DZ and BE(2)-C, upon chemotherapy treatment with doxorubicin. Wee1 was however only upregulated for 3 out 7 cell lines; Kelly, SK-N-DZ and BE(2)-C. The upregulation of pATM and Wee1 showed a potential confirmation of their involvement in CT induced cell cycle arrest. Upon inhibition of pATM, Chk1 and Wee1 diverse effects were observed for each cell line (SK-N-SH, SK-N-AS, SK-N-FI, Kelly, SK-N-DZ and BE(2)-C). Wee1 showed the most promising results were the cell viability decreased for all 5 p53 mutated cell lines and the confluency over time decreased for 4 out 5 p53 mutated cell lines. The p53 wild type cell line SK-N-SH was less sensitive towards Chk1 and Wee1 inhibition indicating that cell lines with functional p53 might not be as dependent on the Chk1 and Wee1 pathways compared to cell lines with non-functional p53. Thus, targeting the cell cycle arrest might be a promising therapeutic target for high-risk neuroblastoma. / Barndomscancern neuroblastom utgör 6% av all barncancer. Majoriteten av de drabbade är under 2 år. Neuroblastom har en stor mångfald av fenotypiska utryck som orsakas av dess inter- och intra-tumör heterogenitet. Fenotyperna klassificeras antigen som låg- eller högrisk. Här har 7 högrisks-neutoblastom cellinjer med varierande grad av känslighet mot kemoterapi analyserats. Titreringsstudier med kemoterapierna cisplatin och doxorubicin påvisade en benägenhet för de p53 muterade cellinjerna att arrestera i S- och/eller i G2/M-fasen, beroende på behandlingen samt behandlingsdosen, vilket indikerar på en dos-beroende cellcykel respons. En behandlingsanalys med de 3 nyckelkomponenterna fosforylerat ATM, Chk1 samt Wee1 gjordes för att potentiellt inhibera cellerna från att arrestera. Efter en initial immunocytokemi infärgning av pATM samt Wee1 visade 5 av 7 cellinjer (SK-N-SH, SK-N-FI, Kelly, SK-N-DZ samt BE(2)-C) en uppreglering av pATM-uttryck till följd av doxorubicin behandling. Däremot var Wee1 endast uppreglerat för 3 av 7 cell linjer (Kelly, SK-N-DZ samt BE(2)-C). Uppregleringen av pATM och Wee1 påvisar ett potentiellt samband mellan kemoterapi-inducerad cellcykelarrest och ökat utryck av pATM och Wee1. Vid inhibering av pATM, Chk1 samt Wee1 gav Wee1 de mest lovande resultaten där cellviabiliteten minskade för samtliga 5 p53-muterade cellinjer och där konfluensen över tid minskade för 4 av 5 p53-muterade cellinjer. SK-N-SH med funktionerande p53 var mindre känslig gentemot Chk1 och Wee1 inhibering, vilket indikerar att cellinjer med funktionerande p53 inte är lika beroende av reaktionsvägarna för Chk1 och Wee1 jämfört med cellinjer som har icke-funktionerande p53. Därmed kan riktad behandling mot cellcykelarrest vara en lovande behandling för högrisks-neuroblastom.