Les neurones granulars de cerebel es generen a la capa granular externa i es diferencien i migren a traves de la capa molecular per donar lloc a la capa granular interna durant el desenvolupament postnatal del cerebel. Durant aquest procés de maduració,aquestes neurones necessiten l'aportació constant d'estímuls tròfics. Si no és el cas, moren per apoptosi. Aquesta situació que es dóna in vivo és mimetitzable en un cultiu de CGCs. Aquestes neurones són sensibles a les concentracions extracel·lulars de potassi i moren per apoptosi quan són exposades a 5mM de KCl (K5). Per contra, si s'addiciona al medi factors que s'han descrit que participen del seu manteniment in vivo com IGF-1, BDNF, PACAP, l'estimulació amb l'agonista glutamatèrgic NMDA o KCl 25 mM (K25) aquestes es desenvolupen i sobreviuen durant el cultiu. Les BMPs tenen un paper important en la regulació de la diferenciació de les CGCs i se'ls hi ha atribuït efectes anti-apoptòtics en diferents sistemes. En aquest treball ens varem plantejar l'estudi de les BMPs com a possibles factors tròfics per les CGCs. BMP-6 protegeix les CGCs en front de K5 en estadis madurs del cultiu, mentre que BMP-2 i BMP-7 no. Les BMPs senyalitzen a traves de tetràmers de receptors tipus I i II i l'activació d'aquests promou l'activació i translocació al nucli de les proteïnes Smads. La maquinària de resposta a les BMPs s'expressa en les CGCs in vitro. Tot i així, no detectarem diferències en l'estat d'activació de les Smads en les diferents condicions testades. La supervivència d'aquestes neurones s'ha relacionat principalment a l'activació de tres vies de cinases com són la PI3K-Akt, la via de MEK/ERK i la de JNK. Varem estudiar el grau d'activació d'aquestes en K5 i la possible modulació pel tractament amb BMP-6. Mentre que el tractament amb BMP-6 no produeix diferències en l'activació de les vies PI3K-Akt i JNK, sí que indueix una forta activació a temps curts de la via MEK/ERK quan es compara amb K5. Mitjançant l'ús d'inhibidors de la via hem observat com aquesta és la principal mediadora de l'efecte de BMP-6. En aprofundir en la senyalització que es desencadena per sota l'activació de MEK/ERK hem identificat a CREB com a factor de transcripció involucrat en l'efecte. La seva activació resulta en la regulació a l'alça dels nivells de la proteïna anti-apoptòtica Bcl-2 que resulta en la inhibició de l'activació de la caspasa-3 per K5 i la reducció dels nuclis apoptótics. Per altre banda, en la recerca del nexe d'unió entre l'activació del receptor i l'activació de la via MEK/ERK també hem descrit com BMP-6 és capaç d'activar a Rap-1 deixant la porta oberta a la participació d'aquesta proteïna G monomèrica en l'efecte de BMP-6. Així doncs, les nostres dades suggereixen un paper nou de BMP-6 com a factor tròfic en el desenvolupament de les CGCs i que realitzaria aquesta funció a través de l'activació de la via MEK/ERK/CREB. El tractament amb NMDA promou la supervivència de les CGCs en cultiu. Estudis previs en el nostre laboratori i en altres han relacionat l'activació de la via de PI3K-Akt i la inhibició de JNK amb l'efecte protector del NMDA. L'activació o inhibició de vies de cinases cursa en la modulació de l'activitat de factors de transcripció que resulta en canvis en el transcriptoma. Així, varem estudiar els canvis en l'expressió gènica induïts pel tractament amb NMDA.. Varem observar una inducció de gens corresponents a programes de desenvolupament neuronal, neurogènesi i anti-apoptosi. Mitjançant estudi comparatiu amb el treball de Zhang i cols. obtinguérem una llista de candidats a mediar l'efecte del NMDA: atf3, bdnf, cdp, Crem, Fos, Homer1, Nfil3, Pcsk1, Plagl1, Rem2, Snf1lk, vgf i NR4A1-3(Nur77, Nurr1 i NOR-1). Tot i que tots ells presentaven funcions relacionables amb supervivència cel·lular, ens varem centrar en l'estudi dels membres de la família de NR4a pel seu paper desconegut en el desenvolupament del cerebel. Encara que l'expressió dels missatgers de Nur77, Nurr1 i NOR-1 es correspon amb les dades del array, a nivell proteic només Nurr1 presenta una pujada en els seus nivells després del tractament amb NMDA. La reducció dels nivells de Nurr1 mitjançant shRNA resulta en una reducció de l'efecte de NMDA. Tanmateix, hem descrit que CREB és el responsable de la inducció de Nurr1 en resposta a NMDA i que la reducció en l'efecte del NMDA en presència del shRNA de Nurr1 ve acompanyat per una reducció en els nivells de BDNF. A més a més, Nurr1 i BDNF presenten un patró d'expressió correlatiu en el cerebel durant els dies postnatals que s'atribueixen a la migració de les CGCs des de la EGL a la IGL. Donant força a Nurr1 com a mediador de l'efecte supervivència de l'estimulació del NMDAR durant el desenvolupament del cerebel. / Cerebellar granule neurons (CGCs) are generated in the external granule layer (EGL) and they differentiate and migrate trough the molecular layer to form the internal granule layer (IGL) during the postnatal development of the cerebellum. During its maturation they need trophic support to survive. Otherwise, they die by apoptosis. That situation that occurs in vivo can be mimicked in a culture of CGCs. These neurons are sensitive to extracellular potassium concentrations and they die by apoptosis when they are exposed to low potassium concentrations (5 mM KCl, K5). In contrast, the presence in the media of molecules that have been described to participate in hte maintenance of these neurons in vivo like IGF-1, BDNF, PACAP, glutamatergic stimulation with the agonist NMDA or depolarizing concentrations of potassium promote the survival of CGCs during the days in vitro.BMPs have an important role in the regulation of CGCs differentiation and they have been described to promote survival against some pro-apoptotic paradigms. In these work we planned to study the eventual effect of BMPs on CGCs survival. BMP-6 protects from K5 induced apoptosis while BMP-2 and -7 do not. We analyzed the presence of the cannonical signaling machinery associated to BMPs in the CGCs in vitro and we observed that all the elements where expressed. However, they do not participate in BMP-6 effect as we do not observe an increase in the nuclear localization of smads in presence of BMP-6. The survival of CGCs have been closely related with the activation status of some signaling pathways like JNK, PI3K/Akt and MEK/ERK. In order to see if they where involved in BMP-6 effect we analyzed their activation. We didn't detect any difference in the JNK and PI3K/Akt pathways in presence or absence of BMP-6. By contrast MEK/ERK pathway was activated in BMP-6 treated cells. We Took in advance of inhibitors to determine the participation in BMP-6 effect and we observed that BMP-6 was mediate by MEK/ERK pathway. We went further in the study of the signaling involved in BMP-6 effect and we have described that CREB is downstream of MEK/ERK pathway activation and that its activation promotes an increase in Bcl-2 levels that results in the inhibition of caspase-3 induced activation of K5 and the reduction of apoptotic nuclei. Moreover, we show that Rap-1 can be a good candidate to be mediating MEK/ERK activation after BMP-6 treatment. Taking together, our data suggest that BMP-6 could be participating in CGCs maintenance during their development in vivo an that this function would be performed by the activation of MEK/ERK/CREB pathway.NMDA treatment promotes CGCs survival in culture. Previous studies in our laboratory have related the activation of PI3K/Akt and the inhibition of JNK with NMDA protective effect. The activation and inhibition of these pathways results in changes in the activation status of transcription factors that promote changes in the transcriptome. In order to analyze the expression changes after NMDA treatment we performed an array with the Genechip® Rat genome 230 Affymetrix platform. We found an enrichment of neuronal development, neurogenesis and anti-apoptotic programs. Moreover, we performed a comparative analysis with the work of Zhang and cols (Zhang et al., 2007) and we obtained a list o f candidates to mediate NMDA effect: atf3, bdnf, cdp, Crem, Fos, Homer1, Nfil3, Pcsk1, Plagl1, Rem2, Snf1lk, vgf i NR4A1-3(Nur77, Nurr1 i NOR-1). All of them are involved in cellular processes that could be related to CGCs survival. However, we focused our attention in Nr4a subfamily members as their role in cerebellum development haven't been explored. We detected the increase in the expression of Nur77, Nurr1 i NOR-1, although only Nurr1 protein levels were increased in presence of NMDA. Reduction of Nurr1 levels by shRNA revealed its participation in NMDA neuroprotection. Additionally, we described that Nurr1, regulated by CREB in NMDA treated cells, promotes an increase in BDNF levels to develop its function in NMDA effect. We also performed a translation to the in vivo situation and as a first approach we studied the expression of Nurr1 and BDNF in the cerebellum during the postnatal development. Both proteins present a similar kinetic and they are induced in the time that is believed to be when CGCs migrate from the EGL to the IGL. In conclusion, this is the first time that Nurr1 have been described as a mediator of NMDA neuroprotection and our results suggest that this situation could be also occurring in vivo.

Els teixits d'inervació tenen una funció esencial a la regulació de les poblacions neuronals definitives mitjançant el control del fenòmen de la mort neuronal fisiològica, basat en el subministrament limitat de neurotrofines (NT's) a les neurones embrionàries. Al cas de les motoneurones (MTN's) de la medul.la espinal, encara no s'ha establert amb precissió la identitat de les molècules neurotròfiques derivades del múscul que governen aquest procès. La primera part d'aquest estudi parteix del desenvolupament d'un model de cultiu de MTN's espinals d'embrió de pollastre. La tècnica utilitzada -de sedimentació sobre un gradient de densitat- permet obtenir una població pura de MTN's embrionàries d'acord amb criteris morfològics, bioquímics i immunocitoquímics. S'ha usat aquest sistema in vitro per la caracterització del procès de mort fisiològica de les MTN's com apoptòtic, i l'estudi de la dependència de les MTN's per a la seva supervivència de les activitats tròfiques presents al teixit muscular esquelètic. Així mateix, s'han analitzat alguns dels mecanismes implicats a la mort de les MTN's per deprivació neurotròfica, rebent especial atenció la participació del metabolisme de les pirimidines al control de la supervivència de les MTN's embrionàries. Durant el desenvolupament embriològic, les MTN's espinals modifiquen els seus requeriments tròfics. A les etapes tardanes del periode de mort fisiològica, aquestes neurones adquireixen la capacitat de respondre a les NT's BDNF, NT-3 i NT-4/5. En aquest estudi, s'ha correlacionat aquesta resposta amb el patró d'expressió dels receptors TrkB i TrkC a la superfície de les MTN's espinals. La seva activació pels factors corresponents comporta la fosforilació i, presumiblement, l'activació de les kinases citosòliques MAPK's. D'altra banda, emprant com a model el receptor TrkA present a la superfície de les neurones simpàtiques del gangli cervical superior de l'embrió de rata i de les cèl.lules PC12, s'ha comprovat com l'autofosforilació dels receptores Trk és necessària per les respostes de supervivència i diferenciació neuronal induïdes per les NT's, encara que d'una manera diferent. L'activitat bioelèctrica també sembla participar a la regulació de la supervivència neuronal embrionària. La despolarització crònica de la membrana cel.lular amb concentracions elevades de K + estimula la supervivència de les MTN's espinals embrionàries mitjançant l'increment de la [Ca 2+ ]i en relació amb l'activació de canals de Ca 2+ dependents de voltatge de tipus L. Així mateix, comporta l'activació de la via de transducció p21ras-MAPK, independentment de l'estimulació dels receptors Trk presents a la superfície de les MTN's. / Los tejidos de inervación tienen una función esencial en la regulación de las poblaciones neuronales definitivas a través del control del fenómeno de la muerte neuronal fisiológica, basado en un suministro limitado de neurotrofinas (NT's) a las neuronas embrionarias. En el caso de las motoneuronas (MTN's) de la médula espinal, aún no se ha establecido con precisión la identidad de las moléculas neurotróficas derivadas del músculo que gobiernan dicho proceso. La primera fase de este estudio parte del desarrollo de un modelo de cultivo de MTN's espinales de embrión de pollo. La técnica usada -de sedimentación sobre un gradiente de densidad- permite obtener una población pura de MTN's embrionarias según criterios morfológicos, bioquímicos e inmunocitoquímicos. Este sistema in vitro ha sido utilizado para caracterizar el proceso de muerte fisiológica de las MTN's como apoptótico, y estudiar la dependencia de las MTN's para su supervivencia de las actividades tróficas presentes en el tejido muscular esquelético. Asimismo, se han analizado algunos mecanismos implicados en la muerte de las MTN's por deprivación neurotrófica, mereciendo especial atención la participación del metabolismo de las pirimidinas en el control de la supervivencia de las MTN's embrionarias. Durante el desarrollo embrionario, las MTN's espinales modifican sus requerimientos tróficos. En las etapas tardías del período de muerte fisiológica, estas neuronas adquieren la capacidad de responder a las NT's BDNF, NT-3 y NT-4/5. En este estudio, se ha correlacionado dicha respuesta con el patrón de expresión de los receptores TrkB y TrkC en la superficie de las MTN's espinales. Su activación por los correspondientes ligandos comporta la fosforilación y, presumiblemente, activación de las kinasas citosólicas MAPK's. Por otra parte, tomando como modelo el receptor TrkA presente en la superficie de las neuronas simpáticas del ganglio cervical superior del embrión de rata y de las células PC12, se ha comprobado cómo la autofosforilación de los receptores Trk es necesaria para las respuestas de supervivencia y diferenciación neuronal inducidas por las NT's, aunque de forma diferente. La actividad bioeléctrica también parece participar en la regulación de la supervivencia neuronal embrionaria. La despolarización crónica de la membrana celular con elevadas concentraciones de K + estimula la supervivencia de las MTN's espinales embrionarias a través del incremento de la [Ca 2+ ]i en relación con la activación de canales de Ca 2+ dependientes de voltaje tipo L. Asimismo, comporta la activación de la vía de transducción p21ras-MAPK, independientemente de la estimulación de los receptores Trk presentes en la superficie de las MTN's. / Neuronal targets of innervation are major determinants in the regulation of the final neuronal populations by controlling naturally-occurring cell death. Such phenomenon is based upon the limited supply of neurotrophins (NT's) to embryonic neurons. The identity of muscle-derived neurotrophic molecules involved in the control of naturally-occurring cell death of motoneurons (MTN's), has not yet been established. First, a culture system for chick embryo spinal MTN's was developed. The methodology employed -a density-gradient sedimentation technique- yields a pure population of embryonic MTN's according to morphological, biochemical, and immunocytochemical criteria. This in vitro system was then used to characterize naturally-occurring death of MTN's as apoptotic, and to study the dependence of MTN's for survival on the trophic activities derived from skeletal muscle tissue. Moreover, some of the mechanisms mediating MTN death upon trophic deprivation were analyzed. The relevance of pyrimidine metabolism to this type of neuronal death merited special attention. Spinal MTN's switch their trophic requirements throughout embryonic development. Late during naturally-occurring death, these neurons become responsive to the NT's BDNF, NT-3, and NT-4/5. In this study, this property was correlated with the presence on the surface of spinal MTN's of receptors TrkB and TrkC. Their activation by the corresponding neurotrophic factors was shown to cause the phosphorylation and, presumably, activation of cytosolic MAPK's in cultured spinal MTN's. Furthermore, by using TrkA receptors present on the membrane surface of sympathetic superior cervical ganglion neurons and PC12 cells as an experimental model, autophosphorylation of Trk receptors was demonstrated to be necessary for both survival and differentiation induced by NT's, although in not in the same manner. Bioelectric activity also seems to participate in the regulation of neuronal survival during embryonic development. Chronic cell membrane depolarization with high concentrations of K + was found to stimulate survival of embryonic spinal MTN's. This effect was mediated by a rise in [Ca 2+ ]i related to the activation of type-L voltage-gated Ca 2+ channels. Moreover, membrane depolarization caused the activation of the p21ras-MAPK signal transduction pathway, which occurred independently of the stimulation of Trk receptors present on the surface of cultured MTN's.

La gènesi i manteniment del sistema nerviós estan regulats per una sèrie de factors neurotròfics, d' entre els quals destaquen les neurotrofines (NGF, BDNF, NT-3 i NT-4/5) i els lligands de la família del GDNF o GFLs (GDNF, NRTN, PSPN i ARTN). Durant els darrers anys, s'han anat caracterizant les cascades de senyalització intracel·lular responsables dels efectes biològics exercits per aquests factors, amb especial atenció a l'NGF i les vies MEK/MAPK i PI 3-K/Akt, dues de les millors caracteritzades. En aquest treballs'han analitzat les vies de traducció de senyal engegades per TrkB (el receptor de BDNF i NT-4/5) i Ret el component comú del receptor per a tots els GFLs) i la seva participació en els processos de supervivència i creixement neurític en diversos paradigmes experimentals. En el cas de TrkB, i utilizant com a modelcèl·lules de neuroblastoma humà SH-SY5Y pre-tractades amb àcid retinoïc (RA), s'ha determinat que la via PI3-K/Akt és el principal mitjançador de la supervivència cel·lular, mentre que la via MEK/MAPK és necessària per als processos de creixement neurític. A més, s'ha caracteritzat el fenotip de les cèl·lules H-SY5Y pre-tractades amb RA i exposades durant temps llargs a BDNF, tot observant-se que aquestes es diferencien cap a un fenotip neuronal, expressant diversos marcadors neuronals específics i restant aturades en la fase G1 del cicle cel·lular. En el cas de Ret, s'ha observat que l'activitat PI 3-K és necessària per a la supervivència de motoneurones espinals de pollastre, neurones granulars del cerebel i neurones del gangli cervical superior, mentre que la via MEK/MAPK no sembla ésser important en els processos de supervivència. A més, c-Src sembla ser un mitjançador important en la senyalització per GFLs, estant implicat tant en la supervivència (actuant per sobre de PI 3-K) i el creixement neurític. La implicació de c-Src en aquests procesos, a més, podria ser específica dels GFLs, donat que aquesta proteïna no sembla estar implicada en la supervivència induïda per NGF. / La génesis y mantenimiento del sistema nervioso están regulados por una serie de factores neurotróficos, de entre los que destacan las neurotrofinas (NGF, BDNF, NT-3 y NT-4/5) y los ligandos de la familia del GDNF o GFLs (GDNF, NRTN, PSPN y ARTN). Durante los últimos años, se han ido caracterizando lascascadas de señalización intracelular responsables de los efectos biológicos ejercidos por estos factores, con especial atención al NGF y las vías MEK/MAPK y PI 3-K/Akt, dos de las mejores caracterizadas. En el presente trabajo se han analizado las vías de traducción de señal iniciadas por TrkB (el receptor de BDNF y NT-4/5) y Ret (el componente común del receptor para todos los GFLs) y su participación en los procesos de supervivencia y crecimiento neurítico en diversos paradigmas experimentales. En el caso deTrkB, y utilizando como modelo células de neuroblastoma humano SH-SY5Y pretratadas con ácido retinoico (RA), se ha determinado que la vía PI3-K/Akt es el principal mediador de la supervivencia celular, mientras que la vía MEK/MAPK es necesaria para los procesos de crecimiento neurítico. Además, se ha caracterizado el fenotipo de las células SH-SY5Y pretratadas con RA y expuestas durante tiempos largos a BDNF, observándose que éstas se diferencian hacia un fenotipo neuronal, expresando varios marcadores neuronales específicos y quedando detenidas en la fase G1 del ciclo celular. En el caso de Ret, se ha observado que la actividad PI 3-K es necesaria para la supervivencia de motoneuronas espinales de pollo, neuronas granulares del cerebelo y neuronas del ganglio cervical superior, mientras que la vía MEK/MAPK no parece ser importante en los procesos de supervivencia.Además, c-Src parece ser un mediador importante en la señalización por GFLs, estando implicado tanto en la supervivencia (actuando por encima de PI 3-K) y el crecimiento neurítico. La implicación de c-Src en estos procesos, además, podría ser específica de los GFLs, dado que esta proteína no parece estarimplicada en la supervivencia mediada por NGF. / The generation and maintenance of the nervous system is regulated by a series of neurotrophic factors that include the neurotrophins (NGF, BDNF, NT-3, and NT-4/5) and the GDNF family ligands (GFLs; GDNF, NRTN, PSPN, and ARTN). During the last years, the signaling cascades responsible for the biologic effects exerted by these factors are being characterized, with special attention to NGFand MEK/MAPK and PI 3-K/Akt pathways. In this work we have analyzed the transduction pathways engaged by TrkB (the receptor for BDNF and NT-4/5) and Ret (the common component of the receptor for GFLs) and their involvement in the processes of survival and neurite outgrowth in several experimental paradigms. Using SH-SY5Y human neuroblastoma cells pretreated with retinoic acid (RA) as a model system, we have determined that PI 3-K/Akt pathway is necessary for TrkB-induced survival, whereas MEK/MAPK pathway is necessary for neurite outgrowth. Moreover, we have characterizedthe phenotype of these cells after sequential RA pre-treatment and long-term BDNF exposure. Cells treated in that way differentiate towards a neuronal phenotype, express several neuronal markers, and are arrested at the G1 phase of the cell cycle. We have also observed that PI 3-K/Akt, but not MEK/MAPK pathway, is necessary for Ret-mediated survival in chicken spinal cord motor neurons, as well as in rat cerebellar and sympathetic neurons. Moreover, c-Src appears to mediate GFLs signaling, being involved in both neuronal survival (acting upstream of PI 3-K) and neurite outgrowth. The involvement of c-Src in such processes seems to be specific for GFLs, since this kinase is not needed for NGF-mediated survival.

Thèse de doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie.Neurosciences : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 14 p.

In this thesis it is demonstrated that leptin and insulin hyperpolarise hypothalamic glucose responsive neurones via the activation of the large conductance ATP-sensitive (K_APT) channel. This channel was potassium selective, had a single channel conductance of 150 pS and channel activity was inhibited by micromolar tolbutamide and millimolar internal ATP. Brain cortical cell bodies and nerve terminals possess a large-conductance calcium-activated potassium (BK) channel. The nerve terminal BK channel switched from high to low activity modes, whereas cell body BK channel activity inactivates during depolarisation. Furthermore, BK channel inactivation was abolished by internal trypsin treatment, suggesting an inactivating particle was associated with the channel. Internal application of alkaline phosphatase irreversibly removed mode switching and inactivation of cortical BK channels. Blocking the cell body BK channel pore with 100 mM intracellular tetraethylammonium (TEA) prevented alkaline phosphatase removal of inactivation, indicating that the phosphatase site of action was located close to the pore. Finally, protein kinase A (PKA) increased the occurrence of the high BK channel activity mode whereas PKA retarded the full recovery of BK inactivation induced by hyperpolarisation. In a separate study it was demonstrated that stably expressed human brain BK (<I>hSlo</I>) channels inactivate in a trypsin-insensitive manner. This inactivation was not due to barium contamination, since 5 μM internal barium blocked <I>hSlo</I> channels only during strong depolarisations, yet inactivation was observed at less positive potentials. Furthermore co-expression of either <I>hSlo</I>β-1, or voltage-gated potassium (Kv) β1.1 or β2.1 subunits with the <I>hSlo</I> α-subunit did not affect the extent or rate of channel inactivation. Finally, the Kvβ-subunits moved the calcium and voltage curves of <I>hSlo</I> to more negative voltages and altered the activation and deactivation kinetics in a manner almost identical to that observed on co-expression of <I>hSlo</I>β-1 subunit with <I>hSlo</I> or by increasing the internal calcium concentration.

Les malalties cerebrovasculars constitueixen la patologia neurològica més freqüent i representen la tercera causa de mort en els països desenvolupats. Entre elles la patologia vascular isquèmica constitueix el grup més important ja que representa les 3/4 parts del total de pacients. L'objectiu central d'aquesta tesi ha estat l'estudi de determinats aspectes de la patologia vascular cerebral isquèmica mitjançant l'ús d'un model experimental, el jerbu, el qual per les seves caracteristiques anatòmiques permet reproduïr la mateixa lesió en els diferents animals estudiats.A la gènesi de la mort cel·lular secundària a la isquèmia s'han implicat múltiples factors, entre ells l'augment de les concentracions intracel·lulars de calci. En aquest sentit, la presència de determinades substàncies tamponadores, com les proteïnes fixadores de calci, poden proporcionar una major resistència a les cèl·lules en front a situacions adverses com la isquèmia.Per altra part, les cèl·lules de l'hipocamp presenten, després d'una isquèmia cerebral transitòria, una mort retardada per maduració. Aquest fenomen de mort pot estar relacionat amb la síntesi de determinades proteïnes que condicionen la mort cel·lular d'una forma activa de manera similar al que succeeix a l'apoptosi.Els primers canvis morfològics en els jerbus adults van ser visibles per microscopia òptica a partir de les 24-48 hores postisquèmia. Aquestes alteracions eren molt més evidents a partir del 3r-4t dia de supervivència, sobretot a la regió CAl de l'hipocamp. Les alteracions morfològiques de les neurones de la regió CAl de l' hipocamp al cap de 4 dies de supervivència es caracteritzaven per una condensació puntejada de la cromatina nuclear i un encongiment citoplasmàtic. Així mateix, un petit grup de neurones disperses per la regió CAl, mostraven un nucli uniformement condensat i de coloració molt fosca. En cap cas es va observar fragmentació del nucli, la qual cosa és característica de l'apoptosi.En estudiar la immunoreactivitat per a parvalbúmina a l'hipocamp del jerbu adult després d'isquèmia cerebral transitòria es va observar, a totes les regions de l'hipocamp, una disminució d'immunoreactivitat, amb un màxim al cap de 6 hores de supervivència postisquèmia. Posteriorment, a partir de les 24 hores postisquèmia, s'observà una progressiva recuperació de la immunoreactivitat, que es iniciar a la regió CA3 i fascia dentada afectant finalment també a la regió CAL. Aquest augment condiciona que al cap de 7 dies de supervivència postisquèmia, el número de neurones amb immunoreactivitat per a parvalbúmina era superior a l'observat en el grup control. Aquests resultats suggereixen que les neurones de la regió CAl de l'hipocamp del jerbu adult que contenen pnrvalbúmina presenten una major supervivència en relació a la isquèmia que les neurones de projecció.Per tal d'estudiar la implicació de la síntesi de proteïnes en la gènesi de la MCR, així com analitzar les similituds i diferències entre MCR i apoptosi, es va administrar un inhibidor de la síntesi de proteïnes, la cicloheximida, a diferents dosis i pautes després de la isquèmia. Els resultats ens mostraren que la cicloheximida administrada a dosis altes produïa un augment significatiu del número de cèl·lules mortes. No obstant, si s'administrava a dosis baixes disminuïa de forma molt discreta el número total de cèl·lules mortes a la regió CAl.En comparar els mecanismes implicats en la MCR i en la mort induïda per radiacions durant el desenvolupament, el qual és un model d'apoptosi, varem observar que la MCR induïda per isquèmia presenta característiques morfològiques diferents de l'apoptosi.Per altra part, s'han utilitzat diferents dosis i vies d'administració (intraperitoneal i intratecal) de la Fructosa-1,6-bisfosfat en el jerbu després d'isquèmia cerebral transitòria per tal d'avaluar els seus efectes sobre la MCR. No es van observar diferències significatives entre el grup control i els grups que havien rebut FBP en quant al número de cèl·lules mortes a la regió CAl de l' hipocamp, el que suggereix que la FBP no ofereix cap efecte beneficiós sobre la NCR en el jerbu després d'isquèmia global transitòria.Considerant el patró de vulnerabilitat en front a isquèmia transitòria durant el desenvolupament de l'hipocamp del jerbu, no es pot correlacionar el contingut intracel.lular de parvalbúmina amb la mort induïda per isquèmia. Així mateix, tampoc no hi ha relació entre el contingut de calbindina i la vulnerabilitat a la isquèmia de l'hipocamp durant el desenvolupament postnatal del jerbu.Finalment, la producció d' APP després de la isquèmia està associada amb l'hiperplàsia dels astròcits però no amb hipertrofia astroglial. / Parvalbumin immunoreactivity is examined in the hippocampus of the Mongolian gerbíl ("Meriones unguiculatus") in controls and in animals subjected to 20 minutes of forebrain ischaemia produced by bilateral clipping of the carotids.Parvalbumin immunoreactivity is rapidly and ephemerally increased in the hippocampus 15 minutes after reperfusion. Later on, there is a transitory decrease of parvalbumin immunoreactivity which is followed by an increase six hours later in the "stratum granulare", "hilus" and CA3 area, and not until the first and second day in the CAl area. On the other hand, GABA-immunoreactive neurons in CAl are preserved during the first week after reperfusion, although an increase in the number of these cells occurs at the end of this period. Delayed neuronal death occurs in the CAl area 48 h after ischaemia, and marked reduction in the number of CAl neurons is found by the end of the first week. These findings indicate that GABAergic neurons in CAl are preserved after forebrain ischaemia, and that parvalbumin in Cal neurons is associated with survival.The effects of the protein synthesis inhibitor cycloheximide on delayed neuronal death following 20 minutes of bilateral forebrain ischemia were examined in the gerbil hippocampus at the fourth day of reperfusion. The results indicate that the effects of cycloheximide are dose dependent, low doses reduce, high doses increase cell death. These findings also indirectly suggest that protein synthesis may play a role in the extent of delayed neuronal death.Vulnerability following transient forebrain ischemia and the maturation of parvalbumin or calbindin D-28K immunoreactivity, was examined in the hippocampus of gerbils during postnatal development. The findings show that the pattern of selective vulnerability following transient ischemia is different in young and adult gerbils, and suggest that no correlation exist between resistance to ischemic damage and calcium-binding protein content.Sprague-Dawley rats aged from 1 to 15 days were irradiated with a single dose of 200 cGy X-rays and killed at different intervals. X-ray-induced cell death in the hippocampal complex of the developing rat is subjected to determinate temporal and regional patterns of vulnerability; it is an active process mediated by protein synthesis.

Certains neuropeptides, comme les orexines, pourraient être impliqués dans les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent la dépression majeure. Nous avons utilisé un modèle murin de dépression, le stress chronique imprédictible modéré, pour étudier précisément le rôle du système orexinergique dans la dépression. Les souris stressées présentaient une augmentation de l’activation des neurones orexinergiques dans la partie dorsomédiale et périfornicale de l’hypothalamus, ainsi que des changements de l’expression des récepteurs orexine-2, contrecarrés par un traitement chronique avec un antidépresseur. De plus, le blocage pharmacologique du système orexinergique chez des souris stressées a engendré des effets antidépresseurs sous-tendus par le rétablissement du rétrocontrôle négatif de l’axe HPA indépendamment d’une augmentation de la neurogenèse hippocampique. Ces résultats montrent que le système orexinergique pourrait être impliqué dans la physiopathogenèse des troubles dépressifs. / Neuropeptides, especially orexins, could be involved in the neurobiological mechanisms underlying maj or depression. We used a mouse mode! of depression, the unpredictable chronic mild stress, to specifically study the role ofthe orexinergic system in depression. Stressed mice showed an increase of orexinergic neuronal activation in the dorsomedial and perifornical hypothalamus, as well as change in orexin receptor-2 expression, reversed by chronic treatment with an antidepressant. In addition, pharmacological blockade ofthe orexinergic system in stressed mice induced antidepressant-like effects, underpinned by the restoration ofthe HPA axis negative feedback, independently of an increase of hippocampal neurogenesis. These results show that the orexinergic system could be involved in the pathophysiology of depressive disorders.

Le facteur XII (FXII) est une sérine protéase de 80 kDa produite et sécrétée par le foie qui initie la voie intrinsèque de la coagulation. Diverses études ont montré un rôle délétère du FXII dans des pathologies cérébrales telles que l'accident vasulaie cérébral, la maladie d'Alzheimer et la slérose en plaques. Néanmoins, l'impact direct du FXII sur le devenir des cellules neuronales reste inconnu. De plus, l'expression du FXII dans le système nerveux central (SNC) n'a pas encore été étudiée. Le premier objectif de nos travaux a été d'étudier le rôle du FXII dans l'apoptose neuronale puis dans un second temps d'étudier l'expession du FXII dans le SNC. Dans notre étude, nous avons constaté que le FXII protège les neurones en culture de la mort apoptotique. Les effets bénéfiques du FXII résultent de l'interaction directe du FXII avec le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR). L'activation de l'EGFR par le FXII déclenche les voies signalétiques antiapoptotiques MAPK. Il est intéressant de noter que la forme double chaîne du FXII, αFXIIa, exerce des effets protecteurs complémentaires en convertissant le précurseur du facteur de croissance hépatocytaire en sa forme mature, ce qui active à son tour le récepteur MET. Enfin, dans notre étude, nous avons observé que le FXII était exprimé dans le SNC (à la fois l'ARNm et la protéine). Cette expression est notamment retrouvée au niveau des neurones corticaux. Ce travail décrit un nouveau mécanisme d'action du FXII et décrit les neurones en tant que cellules cibles pour les effets facteur de croissance du FXII. Dans l'ensemble, ces travaux devraient donc aider à mieux comprendre comment le FXII agit dans les pathologies cérébrales en tant que sérine-protéase unique à l'interface de la thrombose, de l'inflammation et de la survie cellulaire. / Factor XII (FXII) is an 80 kDa serine protease produced and secreted by the liver that participates in the intrinsic coagulation pathway. Various studies have shown a deleterious role of FXII in cerebral pathologies like stroke, Alzheimer disease and multiple sclerosis. Nevertheless, the direct impact of FXII on neuronal cell fate remains unknown. In addition, the expression of FXII in the central nervous system (CNS) has not been investigated yet. The first objective of our work was to study the role of FXII in neuronal apoptosis and then to study the expression of FXII in the CNS. In our work, we found that FXII protects cultured neurons from apoptotic death by a growth factorlike effect. The beneficial effects of FXII result from the direct interaction with the epidermal growth factor receptor (EGFR). Activation of EGFR by FXII triggers antiapoptotic signaling MAPK pathways. Iteestigl, the to hai fo of FXII, αFXIIa, eets opleeta potetie effets oetig the hepatocyte growth factor (HGF) precursor into its mature form, which in turn activates MET receptor. Finally in our work we observed FXII expression in the CNS (both mRNA and protein). This expression is particularly found in cortical neurons. This work describes a novel mechanism of action of FXII and discloses neurons as target cells for growth factor effects of FXII. Overall, these works should thus help further understanding how FXII acts in brain diseases as a unique serine-protease at the interface of thrombosis, inflammation and cell survival.

Les canaux ioniques de détection d'acide (ASIC) font partie de la famille des canaux ioniques degenerin-épithéliaux Na⁺ (DEG-ENaC), dont les principaux ligands connus sont les protons. Les canaux ASIC sont préférentiellement perméables au sodium (Na⁺) et, dans une moindre mesure, à d'autres cations, tels que le potassium (K⁺), le lithium (Li⁺) et le proton (H⁺). Les sous-unités ASIC peuvent être combinées pour donner des canaux homotrimaires ou hétérotrimaires avec différents seuils d'activation activation par l'acidite, ce qui conduit à une sensibilité distincte au pH des canaux ASIC en fonction de leur composition, ce qui fait d'eux des détecteurs de pH polyvalents. Quatre gènes (Asic1-4) exprimés dans tout le système nerveux, codant pour au moins 6 sous-unités (ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 et ASIC4) par épissage alternatif, ont été découverts chez les rongeurs et les humains. Plus précisément, au niveau des ganglions rachidiens du système nerveux périphérique, nous avons signalé que les ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b et ASIC3 jouent un rôle important dans plusieurs fonctions dont la nociception. Même si des études antérieures ont exploré l'implication de ces canaux dans plusieurs fonctions somatosensorielles, une analyse détaillée de leur mode d'expression dans des populations distinctes de neurones sensoriels primaires n'a pas été réalisée à ce jour en raison de la disponibilité limitée d'anticorps spécifiques commerciaux. La première étude, présentée au chapitre 1, visait à révéler le profil d'expression complet des cinq sous-unités ASIC dans trois populations différentes de neurones sensoriels primaires. Une approche d'hybridation in situ (RNAscope) a été utilisée pour cibler les sous-unités ASIC, combinée à l'immunohistochimie pour révéler des populations spécifiques. Plus précisément, je me suis concentrée sur deux types principaux de nocicepteurs ciblant les nocicepteurs non peptidergiques non myélinisés expriment le récepteur à l'isolectine B4 (IB4), et les nocicepteurs peptidergiques non myélinisés exprimant le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP). De plus, j'ai ciblé les neurones multimodaux myélinisés en utilisant le neurofilament 200 (NF200). Compte tenu du rôle des ASIC dans la nociception et de leur implication dans la douleur neuropathique, j'ai également étudié comment la lésion des nerfs périphériques (induite par le menottage du nerf sciatique) affecte l'expression de chaque sous-unité dans différents segments des ganglions de la racine dorsale au sein des deux populations nociceptives. Mes résultats ont mis en évidence un profil d'expression complexe des ASIC dans des conditions naïves en fonction de la population étudiée, et une régulation différentielle des sous-unités ASIC spécifique à la région et au type de cellule après l'induction d'une lésion du nerf périphérique. La deuxième étude consiste en une investigation détaillée du profil d'expression des sous-unités ASIC1, ASIC2 et ASIC3 dans les ganglion rachidien humain. Plus spécifiquement, j'ai mené plusieurs expériences sur la co-expression des ASIC dans les neurones sensoriels primaires, en plus de l'exploration de leur profil d'expression dans les nocicepteurs peptidergiques et non peptidergiques. Cette étude, en conjonction avec mes travaux précédents, a mis en évidence des divergences et des similitudes entre les espèces qui devraient être prises en considération au cours du processus translationnel de cibles analgésiques précliniques jusqu'en traitements cliniques efficaces. / Acid-Sensing Ion Channels (ASICs) are members of the degenerin-epithelial Na⁺ channel (DEG-ENaC) family of ion channels with protons being their main known ligands. ASIC channels are preferentially permeable to sodium (Na⁺), and to a lesser extent, other cations, such as potassium (K⁺), lithium (Li⁺), and proton (H⁺). ASIC subunits can be combined giving homotrimeric or heterotrimeric channels with various acidity activation threshold, leading to distinct pH sensitivity of ASIC channels based on their composition, which makes them versatile pH sensors. Four genes (Asic1-4) expressed throughout the nervous system, encode at least 6 subunits (ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 and ASIC4) through alternative splicing, and have been discovered in rodents and humans, among other species. More specifically, in the dorsal root ganglia (DRG) of the peripheral nervous system (PNS) of rodents, ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, and ASIC3 have been reported, playing an important role in several functions including nociception. Even though previous studies have explored the channels' involvement in several somatosensory functions, a detailed analysis of their expression pattern in distinct populations of primary sensory neurons has not been conducted up to date due to the limited commercial availability of specific antibodies. The first study presented in Chapter 1, aimed to reveal the comprehensive expression pattern of the five ASIC subunits in three different populations of primary sensory neurons. An in situ hybridization approach (RNAscope) was used to target the ASIC subunits, combined with immunohistochemistry to reveal specific populations. Namely, I focused on two main types of nociceptors targeting non-myelinated non-peptidergic nociceptors with Isolectin B4 (IB4), and peptidergic non-myelinated nociceptors with calcitonin gene-related peptide (CGRP). Moreover, I targeted myelinated multimodal neurons using neurofilament 200 (NF200). Considering the role of ASICs in nociception and their involvement in neuropathic pain, I also investigated how peripheral nerve injury (induced by placing a tight cuff around the sciatic nerve) affects the expression of each subunits in different DRG segments within the two nociceptive populations. My results uncovered a complex expression pattern of ASICs in naïve conditions depending on the population under investigation, and a regional and cell type specific differential regulation of ASIC subunits after induction of peripheral nerve injury. The second study consists of a detailed investigation of the expression pattern of ASIC1, ASIC2 and ASIC3 subunits in human DRG. More specifically I conducted several experiments investigating the co-expression of ASICs in primary sensory neurons in addition to exploring their expression pattern in peptidergic and non-peptidergic nociceptors. This study, in conjunction with my previous work, uncovered species divergence and similarities that should be taken under consideration during the translational process of successful preclinical analgesic targets to effective clinical treatments.

Ce mémoire traite de l’organisation anatomique et fonctionnelle de la voie corticosubthalamique chez le singe macaque. Cette projection neuronale, aussi connue sous le nom de voie hyperdirecte, a été étudiée grâce à une méthode de marquage neuronal unitaire. L’injection d’un traceur antérograde, la biotine dextran amine, dans la couche V du cortex moteur primaire de quatre singes cynomolgus (Macaca fascicularis) par microiontophorèse nous a permis de tracer en détails l’arborisation axonale de 28 axones corticofuges composants la voie hyperdirecte. Les principaux résultats de cette étude montrent que la projection corticosubthalamique est essentiellement ipsilatérale et que la population de neurones à l’origine de cette projection est indépendante de celle composant la voie corticostriée. Après avoir quitté le cortex, les axones de fort calibre (jusqu’à 3.7 μm de diamètre) de la voie hyperdirecte voyagent le long de la capsule interne jusqu’au tronc cérébral. À la hauteur du noyau subthalamique, ces axones émettent des collatérales de plus petit diamètre qui innervent non seulement le noyau subthalamique, mais également la zona incerta, le noyau rouge, les noyaux pontiques supérieurs et le noyau réticulaire du thalamus. Dans le noyau subthalamique, les fines collatérales de la voie hyperdirecte s’arborisent profusément au sein du territoire sensorimoteur. Les résultats obtenus dans le cadre de la présente étude par marquage neuronal unitaire révèlent, pour la toute première fois chez le singe, que la voie « hyperdirecte » est majoritairement « indirecte » puisque celle-ci provient essentiellement de collatérales d’axones principaux qui innervent les étages inférieurs du tronc cérébral. En outre, cette projection ne semble pas exclusive au noyau subthalamique puisque les axones qui la composent ciblent plusieurs autres régions motrices cérébrales. / This thesis deals with the anatomical and functional organization of the corticosubthalamic pathway in macaque monkey. This neuronal projection, which is also known as the hyperdirect pathway, was investigated with the help of a single-cell labeling method. An anterograde tracer, biotin dextran amine, was microiontophoretically delivered in layer V of the primary motor cortex in four cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis), allowing us to trace in detail the axonal arborization of 28 corticofugal axons forming the hyperdirect pathway. The main results of this study indicate that the corticosubthalamic pathway is essentially ipsilateral and that the population of neurons at the origin of this projection is distinct from those giving rise to the corticostriatal projection. After leaving the cortex, the large caliber axons (up to 3.7 μm in diameter) that form the hyperdirect pathway travel along the internal capsule, heading toward the brainstem. At the subthalamic nucleus level, these axons emit some small-diameter collaterals that innervate the zona incerta, the red nucleus, the superior pontine nuclei, the thalamic reticular nucleus, and the subthalamic nucleus. In the latter structure, thin collaterals of the corticosubthalamic projection arborize principally within its sensorimotor territory. The results of the present single-axons tracing study reveal, for the very first time in primates, that the so called “hyperdirect” pathway is largely “indirect” since it is mainly composed of collaterals of main axons that travel downward to the brainstem. Moreover, this projection does not seem exclusive to the subthalamic nucleus since it targets several other cerebral motor nuclei.