Zugl.: Siegen, Univ., Diss., 2007

Zugl.: Siegen, Universiẗat, Diss., 2007.

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008.

Heidelberg, Univ., Diss., 2007. / Online publiziert: 2008.

Diplomarbeit Hochschule für Angewandte Psychologie Zürich, 2007.

Die schnelle und präzise Informationsverarbeitung unseres Nervensystems basiert auf hochfrequenter synaptischer Übertragung zwischen Nervenzellen. Hierbei löst der Einstrom von Calcium-Ionen (Ca2+) die Fusion Transmittergefüllter Vesikel an spezialisierten präsynaptischen Nervenendigungen aus. Obwohl viele der hieran beteiligten Proteine bekannt sind, ist deren zeitliches und räumliches Zusammenspiel und deren Regulation durch Ca2+ bisher ungenügend verstanden. Mit präsynaptischen Ableitungen von hippokampalen Moosfasersynapsen wurde ein großer Vorrat an fusionsbereiten Vesikeln gefunden, die schnell fusionieren können. Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die an der Fusion einer hohen Anzahl synaptischer Vesikel innerhalb weniger Millisekunden beteiligt sind, wurden die genetischen Möglichkeiten der Fruchtfliege Drosophila melanogaster genutzt. Es zeigte sich, dass das Protein Bruchpilot in Drosophila am Aufbau der Cytomatrixstruktur beteiligt ist, dass die Anreicherung von Bruchpilot an der Freisetzungsstelle und die Größe des postsynaptischen Glutamatrezeptorfeldes lokal äußerst spezifisch aufeinander abgestimmt werden, und dass Bruchpilot maßgeblich an der Vesikelnachladung beteiligt ist. Die Funktion der Vesikelnachladung konnte auf intramolekularem Niveau einem bestimmten Teil des Bruchpilot Moleküls (dem C-Terminus) zugeordnet werden. Um diese an Invertebraten gewonnen Befunde auf Synapsen des zentralen Nervensystems von Wirbeltieren zu übertragen, wurden cerebelläre Moosfasersynapsen untersucht, an denen hochfrequente synaptische Übertragung und schnelle Vesikelnachladung beschrieben wurden. Obwohl das Drosophila-Protein Bruchpilot kein direktes Sequenzhomolog bei Vertebraten hat, erschien das Invertebraten-spezifische Cytomatrixprotein Bassoon ein interessanter Kandidat zu sein, der bei der hochfrequenten synaptischen Übertragung eine ähnliche Funktion ausführen könnte. In der Tat zeigte die mechanistische Untersuchung von Bassoonmutanten, dass Bassoon die Nachladerate an Synapsen des zentralen Nervensystems beschleunigt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind von Bedeutung für unser Verständnis schneller Informationsverarbeitung in unserem Nervensystem und sollten neue Aspekte für unser Verständnis der Pathophysiologie neurologischer Erkrankungen eröffnen.

In nervous systems, synapses precisely orchestrate information transfer and memory formation. Active zones (AZ) are specialized subcellular compartments at the presynaptic mesoscale which process synaptic transmission on an ultrastructural level. The AZ cytomatrix including the essential scaffold protein Rab3 interacting molecule (RIM) enables exocytosis of synaptic vesicles. A deficiency of the locally most abundant protein isoform RIM1α diminishes long-term potentiation in a complex central mammalian synapse – the connection of hippocampal mossy fiber boutons (MFB) to cornu ammonis (CA)3 pyramidal neurons. Behaviourally, these mice present with learning impairment. The present MD thesis addresses the so far unknown three-dimensional (3D) AZ ultrastructure of MFBs in acute hippocampal slices of wild-type and RIM1α-/- mice. In a first set of experiments, a standardized protocol for near-to-native synaptic tissue preparation at MFBs using high-pressure freezing and freeze substitution and 3D modelling using electron tomography was developed and established. Based on the excellent preservation of synaptic tissue using this protocol, the AZ ultrastructure in both genotypes was quantified in detail up to an individual docked synaptic vesicle using custom-written programming scripts. The experiments demonstrate that deficiency of RIM1α leads to multidimensional alter-ation of AZ 3D ultrastructure and synaptic vesicle pools in MFBs. (Tightly) docked synaptic vesicles – ultrastructural correlates of the readily releasable pool – are reduced, decentralized, and structurally modified, whereas the more distant vesicle pool clusters more densely above larger and more heterogenous AZ surfaces with higher synaptic clefts. The present thesis contributes to a more comprehensive understanding regarding the role of RIM1α for (tight) vesicle docking and organization at MFBs. Furthermore, the precise 3D ultrastructural analysis of MFB AZs in this thesis provides the necessary mor-phological basis for further studies to correlate synaptic ultrastructure with presynaptic plasticity and memory dysfunction in RIM1α-/- mice using advanced electrophysiological and behavioral techniques. / In Nervensystemen bedürfen Informationsweitergabe und Gedächtnisformation eines präzisen Zusammenspiels von Synapsen in Zeit und Raum. Synaptische Transmission basiert strukturell auf mesoskopischen cytosolischen Kompartimenten an der präsynaptischen Membran, sogenannten Aktiven Zonen (AZ). Ihre Cytomatrix, bestehend aus zentralen Gerüstproteinen wie Rab3 interacting molecule (RIM), ermöglicht eine schnelle Freisetzung synaptischer Vesikel. Die Defizienz der lokal häufigsten Isoform RIM1α resultiert an einer komplexen zentralen Säugersynapse, die des hippocampalen Moosfaserboutons (MFB) zu im Cornu ammonis (CA)3 befindlichen Pyramidalzellen, in einer dezimierten Langzeitplastizität. Auf Verhaltensebene zeigen diese Mäuse eine reduzierte Lernfähigkeit. Die vorliegende Dissertation widmet sich grundlegend der bisher unbekannten dreidimensionalen (3D) AZ-Ultrastruktur des MFB in akuten Hippocampusschnitten der adulten Wildtyp- und RIM1α-Knock-Out-Maus (RIM1α\(^{-/-}\)). In einer methodischen Entwicklungsphase wurde ein neuartiges, anspruchsvolles Protokoll der nahezu artefaktfreien (near to native) Synapsenpräparation am MFB mittels Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution sowie der 3D-Modellierung mittels Elektronentomographie etabliert. In einer zweiten Experimentier- und Analysephase ermöglichte die hochwertige synaptische Gewebeerhaltung in beiden Genotypen eine standardisierte, auf Programmierskripten basierte Quantifizierung der AZ-Ultrastruktur bis auf die Ebene eines individuell gedockten synaptischen Vesikels. Dieser Dissertation gelingt der Nachweis, dass eine Defizienz von RIM1α zu einer multidimensionalen ultrastrukturellen Veränderung der AZ und ihres Vesikelpools am MFB führt. Neben einer Reduktion, Dezentralisierung und strukturellen Veränderung (eng) gedockter Vesikel – der ultrastrukturellen Messgrößen von unmittelbar freisetzungsfähigen Vesikeln – verdichtet sich der distaler lokalisierte Vesikelpool auf zugleich größeren, heterogenen AZ-Flächen mit erweitertem synaptischem Spalt. Vorliegende Untersuchungen tragen zum Verständnisgewinn über eine zentrale Rolle von RIM1α für das Docking und die Organisation von Vesikeln der AZ im MFB bei. Darüber hinaus stellen die präzisen ultrastrukturellen Analysen eine morphologische Grundlage für weiterführende Studien mit Hilfe modernster Techniken dar, beispielsweise über die Auswirkungen der geänderten RIM1α\(^{-/-}\) AZ-Ultrastruktur auf die präsynaptische Plastizität sowie in Korrelation zum Gedächtnis und Lernen der Tiere.

Short functional peptidic probes can maximize the potential of high-end microscopy techniques and multiplex imaging assays and provide new insights into normal and aberrant molecular, cellular and tissue function. Particularly, the visualization of inhibitory synapses requires protocol tailoring for different sample types and imaging techniques and relies either on genetic manipulation or on antibodies that underperform in tissue immunofluorescence. Starting from an endogenous activity-related ligand of gephyrin, a universal marker of the inhibitory post-synapse, I developed a short peptidic multivalent binder with exceptional affinity and selectivity to gephyrin. By tailoring fluorophores to the binder, I have obtained Sylite, a probe for the visualization of inhibitory synapses, with an outstanding signal-to-background ratio, that bests the “gold standard” gephyrin antibodies both in selectivity and in tissue immunofluorescence. In tissue Sylite benefits from simplified handling, provides robust synaptic labeling in record-short time and, unlike antibodies, is not affected by staining artefacts. In super-resolution microscopy Sylite precisely localizes the post-synapse and enables accurate pre- to post-synapse measurements. Combined with complimentary tracing techniques Sylite reveals inhibitory connectivity and profiles inhibitory inputs and synapse sizes of excitatory and inhibitory neurons in the periaqueductal gray brain region. Lastly, upon probe optimization for live cell application and with the help of novel thiol-reactive cell penetrating peptide I have visualized inhibitory synapses in living neurons. Taken together, my work provided a versatile probe for conventional and super-resolution microscopy and a workflow for the development and application of similar compact functional synthetic probes. / Kurze funktionelle peptidische Sonden können das Potenzial von High-End-Mikroskopietechniken und Multiplex-Imaging-Assays maximieren und neue Erkenntnisse über normale und abweichende Molekulare-, Zelluläre- und Gewebefunktionen liefern. Insbesondere die Visualisierung inhibitorischer Synapsen erfordert eine Anpassung des Protokolls an verschiedene Probentypen und Bildgebungsverfahren und ist entweder auf genetische Manipulationen oder auf Antikörper angewiesen, die in der Gewebeimmunfluoreszenz unterdurchschnittlich abschneiden. Ausgehend von einem endogenen aktivitätsbezogenen Liganden von Gephyrin, einem universellen Marker der hemmenden Postsynapse, habe ich einen kurzen peptidischen multivalenten Binder mit außergewöhnlicher Affinität und Selektivität zu Gephyrin entwickelt. Durch die Anpassung von Fluorophoren an das Bindemittel habe ich Sylite erhalten, eine Sonde für die Visualisierung inhibitorischer Synapsen mit einem hervorragenden Signal-Hintergrund-Verhältnis, das die "Goldstandard"-Gephyrin-Antikörper sowohl in der Selektivität als auch in der Gewebe-Immunfluoreszenz übertrifft. Im Gewebe profitiert Sylite von einer vereinfachten Handhabung, bietet eine robuste synaptische Markierung in rekordverdächtig kurzer Zeit und wird im Gegensatz zu Antikörpern nicht durch Färbungsartefakte beeinträchtigt. In der Super-Resolution-Mikroskopie lokalisiert Sylite präzise die Post-Synapse und ermöglicht genaue Messungen von Prä- zu Postsynapse. In Kombination mit ergänzenden Tracing-Techniken deckt Sylite die hemmende Konnektivität auf und erstellt Profile der hemmenden Eingänge und Synapsengrößen von erregenden und hemmenden Neuronen in der periaquäduktalen Grau Hirnregion. Schließlich habe ich nach Optimierung der Sonde für die Anwendung in lebenden Zellen und mit Hilfe eines neuartigen thiolreaktiven zelldurchdringenden Peptids hemmende Synapsen in lebenden Neuronen visualisiert. Insgesamt lieferte meine Arbeit eine vielseitige Sonde für konventionelle und superauflösende Mikroskopie und einen Arbeitsablauf für die Entwicklung und Anwendung ähnlicher kompakter funktioneller synthetischer Sonden.

The origin and development of human cerebral asymmetries is yet a debated issue. One prominent manifestation of cerebral asymmetry is handedness with humans showing a dextral population bias. Handedness in humans is not fully established before the age of six. However, head turning preference in newborns is thought to be an important factor in the development of later handedness. If this head turning preference did not disappear completely during development but would prevail into adulthood it might, thus, be associated with handedness. Therefore, this study aimed to assess head turning preference in adults and to relate a possibly emerging bias to handedness. Forty-two adults (6 females, aged 23- 63, mean age = 35) participated in the study. Head turning preference was assessed by means of a move during Ju Jutsu martial arts training, which requires the trainee to move the head to either left or right. The direction of head movement is not specified for this move, leaving the choice to the trainee. Handedness was measured by the Edinburgh Handedness Inventory. Results did not reveal a profound head turning bias in adults. Contrary to the dextral bias in handedness, in this study a leftward bias in head turning emerged from those participants who showed a head turning preference. Head turning bias did not depend on handedness. The finding of a nearly absent and predominantly leftward head turning bias in this sample is discussed in the context of the Ju Jutsu task, training experience and trainer bias. It is concluded that the Ju Jutsu move is not a sufficient task to assess head turning preference in humans. Thus, to further illuminate the relation between head turning preference and handedness, studies are needed which assess head turning preference in adults in an un-trainable and unbiased situation.

This dissertation describes the development and implementation of advanced slice-accelerated (SMS) MRI methods for imaging blood perfusion and water diffusion in the human brain. Since its introduction in 1977, Echo-Planar Imaging (EPI) paved the way toward a detailed assessment of the structural and functional properties of the human brain. Currently, EPI is one of the most important MRI techniques for neuroscientific studies and clinical applications. Despite its high prevalence in modern medical imaging, EPI still suffers from sub-optimal time efficiency - especially when high isotropic resolutions are required to adequately resolve sophisticated structures as the human brain. The utilization of novel slice-acceleration methods can help to overcome issues related to low temporal efficiency of EPI acquisitions. The aim of the four studies outlining this thesis is to overcome current limitations of EPI by developing methods for slice-accelerated MRI. The first experimental work of this thesis describes the development of a slice-accelerated MRI sequence for dynamic susceptibility contrast imaging. This method for assessing blood perfusion is commonly employed for brain tumor classifications in clinical practice. Following up, the second project of this thesis aims to extend SMS imaging to diffusion MRI at 7 Tesla. Here, a specialized acquisition method was developed employing various methods to overcome problems related to increased energy deposition and strong image distortion. The increased energy depositions for slice-accelerated diffusion MRI are due to specific radiofrequency (RF) excitation pulses. High energy depositions can limit the acquisition speed of SMS imaging, if high slice-acceleration factors are employed. Therefore, the third project of this thesis aimed at developing a specialized RF pulse to reduce the amount of energy deposition. The increased temporal efficiency of SMS imaging can be employed to acquire higher amounts of imaging data for signal averaging and more stable model fits. This is especially true for diffusion MRI measurements, which suffer from intrinsically low signal-to-noise ratios. However, the typically acquired magnitude MRI data introduce a noise bias in diffusion images with low signal-to-noise ratio. Therefore, the last project of this thesis aimed to resolve the pressing issue of noise bias in diffusion MRI. This was achieved by transforming the diffusion magnitude data into a real-valued data representation without noise bias. In combination, the developed methods enable rapid MRI measurements with high temporal efficiency. The diminished noise bias widens the scope of applications of slice- accelerated MRI with high temporal efficiency by enabling true signal averaging and unbiased model fits. Slice-accelerated imaging for the assessment of water diffusion and blood perfusion represents a major step in the field of neuroimaging. It demonstrates that cur- rent limitations regarding temporal efficiency of EPI can be overcome by utilizing modern data acquisition and reconstruction strategies.