O câncer de mama é um dos tumores malignos mais comuns e que afeta um grande número de mulheres da população mundial. O processo inflamatório gerado juntamente com o crescimento descontrolado das células tumorais promove um estresse metabólico no microambiente tumoral levando ao acúmulo de adenosina extracelular decorrente da hipóxia tecidual. A adenosina gerada e seus efeitos mediados via receptor A2A (A2AR) interfere em vários subtipos celulares. Neste trabalho, avaliamos o papel do receptor A2A na indução de uma resposta de células Th17 durante o carcinoma mamário experimental, visto que estas desempenham um importante papel no crescimento e na progressão do tumor de mama invasivo. Para isso, utilizamos o modelo de carcinoma mamário murino que desenvolve (4T-1) e o que não desenvolve metástase (67NR). Nossos resultados mostraram que o tumor mamário 4T-1 apresenta alta expressão do receptor A2A comparado com o tumor 67NR. A deficiência do receptor A2a preveniu o crescimento do tumor mamário 4T- 1 e de colônias de células tumorais em sítios secundários da doença, concomitante com a diminuição da resposta de perfil Th17 e do recrutamento de neutrófilos para o sitio primário. Ainda, que as células tumorais 4T-1 apresentaram uma alta expressão dos receptores de adenosina e das ectonucleotidases (CD73 e CD39), sugerindo que a via de sinalização de adenosina exerce um efeito direto nessas células. A administração de adenosina ou AMP (trifosfato de adenosina) em culturas de células tumorais 4T-1 induziu xvi um aumento da expressão de IL-6, CCL20 e CXCL1, mediadores importantes para o recrutamento de linfócitos T produtores de IL-17 e de neutrófilos. Além disso, durante o crescimento do tumor 4T-1, observamos uma alta expressão da enzima ciclooxigenase 2 (Cox-2) comparado com o tumor 67NR. No entanto, os animais deficientes geneticamente do receptor A2A apresentaram uma redução significativa da expressão de Cox-2 no microambiente tumoral comparados com os animais BALB/c. A inibição da enzima Cox-2 com indometacina ou celecoxicib (inibidor seletivo) em animais com tumor 4T-1 preveniu o crescimento do tumor primário e, consequentemente, resultou na redução da expressão de moléculas relacionadas como o perfil de resposta de células Th17 tais como IL-6, CCL20, IL-17A e Ror?t. Esses resultados indicam que o bloqueio da via de sinalização do receptor A2A interfere na indução de resposta de células Th17, abrindo novas perspectivas para o desenvolvimento de terapias alternativas para o controle de tumores invasivos / Breast cancer is one of the most common and aggressive malignant tumors, affecting a large number of women in the worldwide population. The inflammatory process generated along with the uncontrolled growth of tumor cells promotes metabolic stress in the tumor microenvironment leading to the accumulation of extracellular adenosine due to the generation of tissue hypoxia. The generated adenosine and its effects mediated by A2A (A2AR) interfere in several cell subtypes. In this study, we evaluated the role of A2A receptor in the induction of a Th17 cell response in experimental breast carcinoma, given that these cells play an important role in invasive breast tumor growth and progression. For this, we employed the murine mammary metastatic (4T-1) and nonmetastatic carcinoma (67NR) model. Our results showed that there is high expression of adenosine A2A receptor in breast tumor 4T-1 compared to 67NR. The A2AR deficiency prevented the growth of metastatic breast tumor 4T-1 and tumor cell colonies in secondary disease sites, together with a decrease in Th17 response profile and in the neutrophils recruitment to the primary site. The tumor cells 4T-1 presented high expression of adenosine receptors and ectonucleotidases (CD73 and CD39), suggesting that the adenosine signaling pathway has a direct effect on these cells. Adenosine or AMP (adenosine triphosphate) administration in tumoral 4T-1 cell cultures induced an increase in IL-6, CCL20 and CXCL1 expression, important mediators in the recruitiment of IL-17 producing T lymphocytes and neutrophils. Besides that, during 4T-1 tumor growth we observed high expression of cyclooxygenase 2 (Cox-2) compared to 67RN tumor. However A2A deficient mice showed a significative reduction in Cox-2 expression in tumoral microenvironment compared to BALB/c mice. Cox-2 inhibition with indometacine or celecoxib (selective inhibitor) in mice with 4T-1 tumor prevented primary tumor growth and, consequently, resulted in reduction of the expression of molecules related to the Th17 profile, as IL-6, CCL20, IL-17A and Ror?t. These results indicate that the blockade of the A2A signaling pathway interfere on the induction of Th17 cells response, opening new perspectives for the development of alternative therapies to the control of invasive tumors

O melanoma é uma neoplasia de pele invasivo, com maior taxa de morte, sem tratamento efetivo. Nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (LNC) tem sido empregadas com sucesso como carreadores de fármacos hidrofóbicos. Como o eugenol é um composto hidrofóbico com atividades antiproliferativas e pró-apoptóticas em células cancerosas, visamos avaliar os efeitos dos tratamentos com acetileugenol (AC), LNC ou LNC contendo acetileugenol (LNC-AC) em modelo de melanoma in vivo em camundongos C57B6, e a citotoxicidade dos mesmos em células endoteliais (HUVEC) e de melanoma (SK-Mel-28) in vitro. Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamentos i.p. com as LNC ou com LNC-AC (50 mg/kg, 3-10 dia de indução do tumor) induziram toxicidade sistêmica e, somente o tratamento com LNC inibiu o desenvolvimento do melanoma. O tratamento com LNC, mas não com a mistura de triglicerídeos de cadeia média, por via oral, inibiu o desenvolvimento tumoral, sem toxicidade. Adicionalmente, os tratamentos com AC, LNC ou LNC-AC não foram eficazes quando administrados em fase tardia de evolução tumoral (50 mg/kg, 7-17 dia de indução do tumor, via oral); 2) os tratamentos agudos com AC, LNC ou LNC-AC (20 mg/kg, 200 µL, e.v.) não alteraram o número de leucócitos circulantes, mas os tratamentos com LNC ou com LNC-AC reduziram o comportamento de rolling dos leucócitos em vênulas póscapilares do músculo cremaster e causaram hemólise, sendo que este último efeito também foi observado após tratamento in vitro em hemácias murinas; 3) Os estudos in vitro mostraram que as LNC e LNC-AC foram captadas pelas células HUVEC e SK-Mel-28 após 1 hora de incubação; que a incubação com LNC-AC induziu apoptose tardia e necrose com maior eficácia em SK-Mel-28 do que em HUVEC; que as incubações com LNC ou LNC-AC exerceram efeitos antiproliferativos, induzindo parada na fase G2/M do ciclo celular das duas linhagens de células avaliadas; que somente a incubação com AC ou LNC-AC inibiu a adesão ao Matrigel® com maior eficácia na linhagem SK-Mel-28 do que HUVEC; que somente a incubação com as LNC reduziram a expressão de VCAM-1 em HUVEC e que as incubações com LNC ou LNC-AC reduziram a expressão de β3 integrina em SK-Mel- 28; que nenhum dos tratamentos alterou a migração celular das HUVEC ou SK-Mel- 28; que somente a incubação com LNC-AC reduziu os níveis de espécies reativas de oxigênio em HUVEC e SK-Mel-28; que a incubação com LNC ou LNC-AC aumentou a produção de óxido nítrico (NO) pelas duas linhagens de células avaliadas; que o tratamento com L-NAME reverteu os níveis de NO e a inibição sobre a proliferação celular induzida pela incubação com LNC ou LNC-AC e; que o tratamento de células de melanoma murino com LNC ou LNC-AC parece alterar a polarizar os neutrófilos para o fenótipo N1. Associados, os resultados obtidos mostram o tratamento oral com LNC inibe o crescimento do melanoma sem induzir efeitos tóxicos, e que este efeito benéfico pode ser dependente, pelo menos em parte, da nanoencapsulação dos triglicerídios de cadeia média e da supraestrutura da formulação, com toxicidade direta sobre as células de melanoma e possível modulação do microambiente tumoral. / Melanoma is the most invasive skin cancer, with high rates of death without effective treatment. Polymeric lipid-core nanocapsules (LNC) has been successfully used as carriers of hydrophobic drugs. As eugenol is an hydrophobic compound with antiproliferative and pro-apoptotic activity in cancer cells, here we aimed to evaluate the effects of treatments with acetyleugenol (AC), LNC or LNC containing acetyleugenol (LNC-AC) in an in vivo melanoma model in C57BL6 mice and the cytotoxicity of the treatments in vitro, using endothelial (HUVEC) and melanoma (SK-Mel- 28) cells. The results obtained showed that: 1) i.p. treatments with LNC or LNCAC (50 mg/kg, 3-10 days of tumor injection) induced systemic toxicity and, only the treatment with LNC inhibited the melanoma development. Treatment with LNC, but not with mix of triglycerides of medium chain, by oral route, inhibited the tumor development, without toxicity. In addition, the treatments with AC, LNC or LNC-AC were not effective when administered in the late stage of tumor evolution (50 mg/kg, 10-20 days of tumor induction, oral route); 2) the acute treatments with AC, LNC or LNC-AC (20 mg/kg, 200 µL, intravenous route) did not altered the number of circulating leukocytes, but the treatments with LNC or LNC-AC reduced the rolling behavior of leukocytes in postcapillary venules of the cremaster muscle and induced hemolysis. The latter effect was also observed after in vitro treatment using murine erythrocytes; 3) In vitro studies showed that the LNC and LNC-AC suffered uptake by HUVEC and SK-Mel-28 cells after 1 hour of incubation; that the incubation with LNC-AC induced late apoptosis and necrosis more effectively in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that the incubation with LNC or LNC-AC presented antiproliferative effects, by inducing G2M arrest in cell cycle in both cells lines evaluated; that only the incubation with AC or LNC-AC inhibited the adhesion in Matrigel® with more efficaccy in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that only incubtion with LNC reduced the VCAM-1 expression in HUVEC and the incubation with LNC or LNC-AC reduced the β3 integrin expression in SK-Mel-28 cells; that any treatment affected the HUVEC or SK-Mel- 28 migration; that only the incubation with LNC-AC reduced the levels of reactive species of oxygen in HUVEC and SK-Mel-28 cells; that the incubation with LNC or LNC-AC increased the nitric oxide (NO) production by both cell lines used; that the treatment with L-NAME reversed the NO levels and the inhibition on cell proliferation induced by incubation with LNC or LNC-AC and; that the in vitro treatment of murine with LNC or LNC-AC altered the neutrophil polarization to N1 phenotype. Together, results obtained show that the oral treatment with LNC inhibit the melanoma growth without any toxic effect, and that the beneficial effect could be dependent, at least in part, of nanoencapsulation of medium chain triglycerides and the supraestrucuture of the formulation, with direct toxicity on melanoma cells and possible modulation of tumor microenvironment.

Introdução: O Reiki está entre as terapias baseadas em energia mais frequentes. Estudar terapias com bases em mecanismos holísticos complexos e dinâmicos, influenciados por diferentes fatores individuais e ambientais exige uma série de avaliações em diferentes modelos experimentais. Neste contexto, o estudo in vitro permite o controle dos fatores externos às células, evita a alta variabilidade individual, propiciando resultados em menor tempo. Dentre os leucócitos, os neutrófilos são aqueles que estão presentes em maior quantidade no sangue periférico, atuando de maneira importante nas fases iniciais das reações inflamatórias, como mecanismo de defesa, estando no rol das primeiras células do sistema imune que se deslocam dos vasos para os tecidos. Objetivo: Avaliar o efeito do Reiki sobre a viabilidade celular e a atividade da enzima mieloperoxidase de neutrófilos humanos in vitro. Método: É um estudo laboratorial, experimental, duplo cego, com abordagem quantitativa. Foi realizado no Laboratório de Fisiologia Celular e Biologia Molecular da Universidade Cruzeiro do Sul - Campus Anália Franco São Paulo SP. A amostra de sangue humano foi obtida de cinco voluntários saudáveis. O ensaio necessitou de 20mL de sangue obtido por punção venosa periférica. Critério de inclusão: adulto, do sexo masculino, saudável na faixa dos 20 aos 40 anos. Critérios de exclusão: problema de saúde referido, uso de medicamentos, uso de terapia complementar (como terapias energéticas, fitoterapia, meditação e outras). O grupo experimental recebeu aplicação de Reiki, em temperatura ambiente, por meio da imposição de mãos, a 15 cm de distância por 15 minutos. A aplicação de Reiki foi realizada uma vez ao dia, durante três dias consecutivos, em sessões a cada 24 horas. O grupo controle permaneceu pelo mesmo tempo e nas mesmas condições ambientais do grupo de intervenção, sem a aplicação da técnica de biocampo. As células foram avaliadas pela técnica de exclusão do corante azul de Tripan, que permite diferenciar células vivas e mortas, pela exclusão do corante pelas células viáveis, e contadas em câmara de Neubauer. A atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) foi avaliada por meio do ensaio de quimiluminescência. A análise da viabilidade celular foi feita em triplicata utilizando-se como resultado a média. Análise de dados. Medidas de variabilidade e tendência central, modelo de equações de estimação generalizadas para distribuição binomial nos dados de viabilidade para comparar os grupos longitudinalmente e um modelo de ANOVA para medidas repetidas não paramétrico para o MPO, ao nível de significância de 5%. Resultados: As médias da viabilidade celular foram superiores no grupo experimental, quando observadas a média dos cinco ensaios para cada momento de aferição segundo o grupo estudado, com diferença estatisticamente significante (p = 0,0040). A atividade da MPO, expressa em Unidades Relativas de Luminescência foi superior no grupo experimental (p = 0,0020). Conclusão: Houve aumento tanto da viabilidade celular, quanto da atividade da enzima mieloperoxidase dos neutrófilos in vitro pertencentes ao grupo experimental quando comparados ao grupo controle. / Introduction: Reiki is within as more frequent energy-based therapies. Studying therapies based on complex and dynamic holistic mechanisms, influenced by different individuals and environmental factors, requires a series of assessments in different experimental models. In this context, in vitro studies allow the control of cells external factors, avoiding the high individual variability, providing results in a shorter time. Among leukocytes, neutrophils are those present in greater amounts in the peripheral blood, acting in the main role in the early stages of inflammatory reactions, as a defense mechanism, being in the rank of the first cells of the immune system that move from the vessels to the tissues. Objective: Evaluate the effect of Reiki on cell viability and myeloperoxidase activity of human neutrophils in vitro. Method: It is an experimental, double-blind, laboratory study with a quantitative approach. It was done at Laboratory of Cellular Physiology and Molecular Biology of Cruzeiro do Sul University - Anália Franco Campus - São Paulo - SP. The human blood samples were obtained from five healthy volunteers. The test required 20mL of blood obtained by peripheral venous puncture. Inclusion criteria: adult, male, between the ages of 20 and 40 years. Exclusion criteria: volunteers reporting health problems, use of medications and use of complementary therapy (as energy therapies, phytotherapy, meditation and others). The experimental group received the Reiki application, at room temperature, by means of the laying on of hands to 15 cm of distance by 15 minutes. A Reiki application was performed once a day, for three consecutive days, in sessions every 24 hours. The control group remained at the same period and at the same environmental conditions as the intervention group, but without any application of the biofield technique. The cells were evaluated through the technique of the Trypan blue exclusion test, that allows to differentiate alive and dead cells, through dye exclusion by viable cells, and counted in Neubauers chamber. The activity of the myeloperoxidase (MPO) enzyme was evaluated by chemiluminescence assay. The analysis of cell viability was done in triplicate using as the result the measures average. Data analysis. Measurements of variability and central tendency, generalized estimation equation model equations for binomial distribution of cell viability data for a longitudinal comparison of groups and ANOVA model for non-parametric repeated measures for MPO, at a significance level of 5%. Results: The cellular viability means were higher in the experimental group when evaluated the mean of the five experimental assays in each measurement moment according to the group studied, with a statistically significant difference (p = 0.0040). MPO activity, expressed in Relative Luminescence Units, was higher in the experimental group, except in the fifth assay, and with an exacerbation of enzyme activity in the third assay, with a statistically significant difference (p = 0.0020). Conclusion: There was an increase in both cell viability and myeloperoxidase enzyme in vitro neutrophils from experimental group when compared to the control group, both with statistically significant differences.

O sistema imune inato é organizado por processos complexos que envolvem os diversos tipos celulares que culminam na eliminação de uma variedade de microorganismos a fim de proteger o organismo de infecções. Os neutrófilos são células importantes neste sistema, sendo capazes de migrar rapidamente ao foco da infecção. Estas células reconhecem e fagocitam partículas estranhas e atuam no sentido de elimina-los através da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), proteínas antimicrobianas e enzimas proteolíticas dos grânulos, que são liberadas no fagossomo e no espaço extracelular. Entretanto, em algumas doenças inflamatórias e autoimunes têm sido encontradas lesões nos tecidos envolvendo a produção excessiva de EROs pelos neutrófilos, desencadeada por imunocomplexos (ICs) via receptores Fc gama (Fc) e de complemento (CR). Assim, a modulação da ativação destes receptores e da produção de EROs é importante na manutenção da homeostasia. Nas últimas décadas, flavonóides são considerados como metabólitos secundários promissores mostrando atividade antioxidante e imunomodulatória. Neste trabalho foi avaliado o efeito modulatório dos flavonóides galangina, kaempferol, quercetina e miricetina em algumas funções efetoras de neutrófilos humanos, como o metabolismo oxidativo estimulado via receptores de membrana Fc e/ou CR, fagocitose e atividade microbicida, além do efeito citotóxico, antioxidante e inibitório dessas substâncias sobre a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e NADPH oxidase. Os flavonóides analisados mostraram um efeito modulatório negativo no metabolismo oxidativo dos neutrófilos humanos na seguinte ordem: galangina> kaempferol> quercetina > miricetina. Embora a galangina tenha exercido maior atividade, sua ação antioxidante e inibitória na atividade das enzimas MPO e NADPH oxidase foi a menos efetiva dentre os flavonóides avaliados. Além disso, esta substância inibiu de maneira mais acentuada a resposta celular mediada por ambos os receptores Fc e CR quando comparado a estimulação destes receptores individualmente. As substâncias contendo o grupo catecol, quercetina e miricetina mostraram elevada eficiência na inibição da atividade das enzimas NADPH oxidase e MPO, e na redução do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). De maneira geral, os flavonóides não interferiram no processo fagocítico e no mecanismo microbicida, e não induziram toxicidade e morte celular por apoptose ou necrose. Os resultados apresentados neste trabalho mostram uma possível aplicação destes flavonóides como fármacos de origem natural em doenças inflamatórias que apresentem acúmulo de neutrófilos, sendo uma ferramenta promissora para o tratamento efetivo destas doenças. / The innate immune system is composed of complex biological processes involving a variety of cell types that eliminate invading microorganisms to protect the host against infection. Neutrophils are key effector cells of this system, being able to migrate rapidly to infection sites. These cells recognize and engulf foreign particles by phagocytosis, and act to destroy them through production and release of reactive oxygen species (ROS), antimicrobial proteins and proteolytic granule enzymes, which are delivered to the phagossomes and to the extracellular environment. However, tissue damage related to excessive neutrophil ROS production triggered by immune complexes (ICs) via Fc-gamma (FcR) and complement receptors (CR) has been found in some inflammatory and autoimmune diseases. So, modulation of both the activation of these receptors and ROS generation are important to the maintenance of body homeostasis. In the last decades, flavonoids have been considered promising plant secondary metabolites with antioxidant and immunomodulatory activity. This study evaluated the modulator effect of four flavonoids (galangin, kaempferol, quercetin and myricetin) in some human neutrophil effector functions, such as the oxidative metabolism stimulated via FcR and CR classes of membrane receptors, phagocytosis and microbicidal activity, as well as the cytotoxic, antioxidant and inhibitory effect of these compounds in the MPO and NADPH oxidase activity. The flavonoids studied showed a negative modulator effect in the human neutrophils oxidative metabolism in the following ranking order: galangin > kaempferol > quercetin > myricetin. Although galangin had shown the highest activity, it was the least effective antioxidant and inhibitor of MPO and NADPH oxidase activity among the flavonoids tested herein. Furthermore, this compound inhibited more the cellular response mediated by both Fc and CR receptors than by each one of them individually. The flavonoids bearing the catechol group, quercetin and myricetin, had a high efficiency to inhibit NADPH oxidase and MPO activity, as well as to reduce the 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazil (DPPH) free radical. In general, the flavonoids did not interfere in the phagocytic process and microbicidal mechanism, and also did not induce toxicity and cell death by apoptosis or necrosis. The group of results presented here provides a possible application of these flavonoids as drugs of natural source in inflammatory diseases with excessive neutrophil infiltration, being a promising tool for an effective treatment of these illnesses.

O neutrófilo é a célula predominante no sangue circulante e medeia as primeiras respostas da imunidade inata contra infecções, graças a sua capacidade de fagocitar e destruir patógenos. A mieloperoxidase (MPO) é a proteína mais abundante do neutrófilo e a sua potente atividade microbicida está relacionada à sua participação na geração de moléculas oxidantes capazes de degradar uma ampla variedade de estruturas biológicas. Contudo, à MPO também tem sido atribuído um papel deletério nos processos inflamatórios por mediar danos ao endotélio e amplificar a inflamação. A liberação da MPO do neutrófilo diretamente sobre o endotélio depende da interação célula-célula mediada pela integrina CD11b/CD18 (também conhecida como receptor do complemento tipo 3, CR3) expressa nos neutrófilos e pela molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) no endotélio, sugerindo um papel importante para o CR3 em mediar o dano tecidual em condições inflamatórias crônicas. A cadeia CD11b (?M) do CR3 é codificada pelo gene ITGAM (Integrin Alpha M) e um polimorfismo devido à troca de um único nucleotídeo, G328A, resulta na substituição de uma arginina por uma histidina na posição 77 no domínio extracelular da molécula CD11b, levando à existência de duas variantes polimórficas (R77 e 77H). Este polimorfismo recebe o número de referência rs1143679. A variante 77H está associada à suscetibilidade ao lúpus eritematoso sistêmico (LES), mas o comprometimento funcional desta variante ainda não é compreendido. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar se o polimorfismo da cadeia CD11b influencia o burst oxidativo dependente de MPO em neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis. Os genótipos foram determinados por reação em cadeia da polimerase para identificação das variantes alélicas; os neutrófilos foram estimulados com zimosan opsonizado com soro humano normal; a expressão do CR3 foi avaliada por citometria de fluxo com anticorpo monoclonal específico; a avaliação da atividade da enzima MPO foi realizada através da quantificação indireta de seu produto, o ácido hipocloroso, pelo método da taurina-cloramina; o burst oxidativo foi medido por quimioluminescência (QL) dependente de luminol e de lucigenina. Não houve diferença estatística na atividade da MPO entre os grupos, contudo a presença da variante 77H nos neutrófilos mostrou uma menor liberação de MPO quando comparada aquela de neutrófilos com a variante R77. Esta diminuição da liberação da MPO não foi relacionada à diferença de expressão do CR3, uma vez que a análise da expressão do CR3 nos neutrófilos não mostrou diferenças entre os grupos. Nenhuma diferença foi observada na medida de QL. Levando-se em consideração as funções imunomodulatórias da MPO, dependentes e independentes da sua atividade catalítica, nas interações entre neutrófilo e endotélio mediadas pelo CR3, nosso resultado mostra a necessidade de investigar se pequenas diferenças entre a liberação de MPO por neutrófilos, expressando a variante 77H da cadeia CD11b, pode explicar a associação deste polimorfismo com a suscetibilidade ao LES e/ou outras doenças. / The neutrophils are the predominant cells in the circulating blood and mediates the first responses of innate immunity against infections, thanks to their ability to phagocyte and destroy pathogens. The myeloperoxidase (MPO) is the most abundant protein in the neutrophils and its potent microbicidal activity is related to its participation in the generation of oxidant molecules capable of degrading a wide variety of biological structures. However, the MPO has also been attributed a deleterious role in mediating inflammatory processes at endothelial damage and amplifying inflammation. The release of MPO from neutrophils depends directly on the endothelial cell-cell interaction mediated by the integrin CD11b / CD18 (also known as the complement receptor type 3, CR3) expressed in neutrophils and the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in the endothelium, suggesting an important role for CR3 in mediating tissue damage in chronic inflammatory conditions. The CD11b chain (?M) of CR3 is encoded by the gene ITGAM (Integrin Alpha M) and a polymorphism due to the exchange of a single nucleotide, G328A, results in the substitution of an arginine by a histidine at position 77 in the extracellular domain of the CD11b molecule, leading to the existence of two polymorphic variants (R77 and 77H). This polymorphism receives the reference numeral rs1143679. The 77H variant is associated with susceptibility to systemic lupus erythematosus (SLE), but the functional impairment of this variant is not yet understood. In this context, the aim of this study was to evaluate the polymorphism of the CD11b chain influences the oxidative burst dependent MPO in human neutrophils from healthy individuals. The genotypes were determined by polymerase chain reaction to identify the allelic variants; neutrophils were stimulated with opsonized zymosan with normal human serum; of CR3 expression was assessed by flow cytometry with specific monoclonal antibody; evaluating the MPO enzyme activity was performed by indirect measurement of your product, hypochlorous acid, the method of taurine-chloramine; The oxidative burst was measured by chemiluminescence (Q) dependent luminol and lucigenin. There was no statistical difference in MPO activity between the groups, but the presence of the 77H variant in neutrophils showed a lower release of MPO compared that of neutrophils with the R77 variant. This reduction of MPO release was not related to the difference CR3 expression, since the analysis of CR3 expression on neutrophils showed no differences between groups. No difference was observed in the extent of QL. Taking into account the immunomodulatory functions of MPO-dependent and independent of its catalytic activity, interactions between neutrophils and the endothelium mediated CR3, our result shows the need to investigate whether small differences between the MPO release by neutrophils, expressing the variant 77H of the CD11b chain, may explain the association of this polymorphism with susceptibility to SLE and / or other diseases.

A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelos neutrófilos, que representa um mecanismo essencial da imunidade inata contra agentes infecciosos, pode ser desencadeada por imunocomplexos (IC) associados ou não com componentes do sistema complemento. Os IC são normalmente eliminados da circulação pela ligação aos receptores de complemento do tipo 1 em eritrócitos, que os transportam até o baço e o fígado, onde são fagocitados por macrófagos residentes. Porém, defeitos neste mecanismo de eliminação podem levar à deposição de IC nos vasos e tecidos. Em algumas doenças inflamatórias, onde ocorre uma intensa deposição de IC, pode acontecer o recrutamento e a ativação maciça de neutrófilos pelos IC. Nessa situação, os mecanismos endógenos de defesa tecidual não conseguem controlar as alterações desencadeadas pelos fatores oxidantes e líticos liberados pelos neutrófilos, levando à possível lesão tecidual e consequências funcionais e estruturais para o organismo. Nessa perspectiva, tem-se intensificado, nos últimos anos, a procura por novos compostos terapêuticos com capacidade de reduzir os danos aos tecidos adjacentes ao acúmulo de IC, neutrófilos, ERO e enzimas líticas, expostos a níveis deletérios desses componentes. Assim, neste trabalho foi avaliado o potencial antioxidante de um conjunto de dez derivados 3-fenilcumarínicos no metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos estimulados por ICs, empregando-se o ensaio de quimioluminescência dependente de luminol e de lucigenina (QLlum e QLluc, respectivamente). Posteriormente, foi avaliada a citoxicidade das amostras, através do ensaio de exclusão do azul de tripan e medida da atividade da lactato desidrogenase liberada, bem como sua capacidade de sequestrar HOCl e inibir a atividade das enzimas NADPH oxidase e mieloperoxidase (MPO). Observou-se que todas as amostras avaliadas inibiram a QLlum e a QLluc, sendo que cinco delas tiveram efeito inibitório maior que ou igual a 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. Este efeito biológico não foi mediado pela citotoxicidade das 3-fenilcumarinas, nas condições avaliadas. Dentre essas amostras, o derivado 3-fenilcumarínico C13, que foi o mais efetivo em inibir a QLluc, possui duas características que parecem estar relacionadas com tal efeito: um grupo substituinte orto-diidroxi no esqueleto cumarínico e um grupo metilenodioxila no anel fenílico. Além do mais, todas as substâncias que possuem o grupo metilenodioxila no anel fenílico (C1, C6, C6a, C13, C13a) apresentaram efeito inibitório da QLluc maior que as respectivas análogas sem este substituinte (C15, C18, C18a, C24, C24a). A inibição da QLluc parece ser independente da inibição da atividade da NADPH oxidase, visto que as substâncias apresentaram efeito inibitório discreto no consumo de O2 pelos neutrófilos estimulados por IC. Por outro lado, as amostras C13 e C24, que têm em comum a presença do grupo substituinte 6,7-diidroxi, apresentaram os maiores efeitos inibitórios sobre a QLlum, apresentando IC50 semelhante. Essas duas substâncias também foram as mais ativas em inibir a atividade da enzima MPO e em sequestrar o HOCl. Para esses dois ensaios, a atividade biológica observada foi dependente do número de hidroxilas na estrutura do derivado 3-fenilcumarínico. Os resultados deste trabalho mostram que a atividade antioxidante dos derivados 3-fenilcumarínicos sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos está relacionada às características estruturais dessas moléculas. Dentre a série de substâncias avaliadas, C13 e C24 são as amostras mais promissoras para uso como protótipos de moléculas com aplicação terapêutica na modulação desta função neutrofílica. / Production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils, which is an essential mechanism of innate immunity against infectious agents, can be triggered by immune complexes (IC) associated or not with components of the complement system. IC are normally cleared from the circulation by binding to complement receptor type 1 on erythrocytes and transport to spleen and liver, where they are phagocytized by resident macrophages. However, defects in this clearance mechanism can lead to deposition of IC in vessels and tissues, favoring neutrophil chemotaxis. In some inflammatory diseases there is intense deposition of IC, which triggers massive recruitment and activation of neutrophils. In these situations, the endogenous tissue defense mechanisms are not able to regulate the local disorders provoked by the oxidant and lytic compounds released by neutrophils, and tissue damage as well as structural and functional consequences to the organism might occur. In this perspective, the last years have been marked by an intense search for new therapeutic compounds able to reduce the damage to tissues surrounding the site of accumulation of IC, neutrophils, ROS and lytic enzymes, exposed to deleterious levels of these components. So, the present work reports the evaluation of the antioxidant potential of ten 3-phenylcoumarin derivatives in the neutrophil oxidative metabolism stimulated with IC, through the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence assay (QLlum and QLluc, respectively). Further, cytotoxicity of the samples was evaluated by the trypan blue exclusion assay and measurement of lactate dehydrogenase activity, as well as their ability to scavenge HOCl and inhibit NADPH-oxidase and myeloperoxidase (MPO) activity. We found that all the samples inhibited QL-lum and QLluc, being the inhibitory effect of five of them higher than or equal to 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. This biological effect was not mediated by cytotoxicity of the 3-phenylcoumarins, under the conditions assessed. Compound C13, which was the most effective inhibitor of QLluc among the set of phenylcoumarins tested, has two structural features that seem to be related to this effect: an orto-dihydroxyl group in the coumarin moiety and a methylenedioxyl group attached to the phenyl ring. Moreover, the inhibitory effect of all 3-phenylcoumarins bearing the methylenedioxyl group (C1, C6, C6a, C13, C13a) was higher than that found to their analogues without this group (C15, C18, C18a, C24, C24a). The CLluc inhibition by phenylcoumarins seems to be independent of inhibition of NADPH-oxidase activity, since these compounds had a slight inhibitory effect in the O2 consumption by IC-stimulated neutrophils. On the other hand, compounds C13 and C24, which shares the 6,7-dihydroxyl group, had the highest inhibitory effects on CLlum with similar IC50 values among the samples tested. These compounds were also the most active ones to inhibit MPO activity and scavenge HOCl. Such biological effects were dependent on the number of hydroxyl groups in the 3-phenylcoumarin moiety. The results of this work show that the antioxidant activity of 3-phenylcoumarin derivatives in the oxidative metabolism of human neutrophils is related to the structural characteristics of these molecules. Among the set of compounds evaluated, C13 and C24 are the most promising samples to be used as prototypes of moleculse with therapeutic application in the modulation of neutrophil function.

O objetivo deste estudo foi caracterizar as respostas das células mesenquimais indiferenciadas derivadas do ligamento periodontal (PDLSCs) ao extrato proteico total de Porphyromonas gingivalis (PgPE) e avaliar seu impacto nas propriedades biológicas das células leucêmicas promielocíticas humanas HL-60. PDLSCs enriquecidas com CD105 foram semeadas em placas de 6 poços durante 24h. Em seguida, as células foram desafiadas com PgPE (0 e 2 mg/ml) durante 3h (período de exposição). Os sobrenadantes foram então descartados; PDLSCs foram lavadas com PBS e cultivadas por 18h adicionais. Por fim, os sobrenadantes foram coletados. Os níveis de citocinas e quimiocinas nos sobrenadantes foram avaliados por ensaios multiplex. Na sequência, o efeito dos sobrenadantes derivados de PDLSCs (tratadas ou não com PgPE) sobre a ativação, o recrutamento e a resposta inflamatória de HL-60 foi avaliado. PDLSCs responderam ao tratamento com PgPE. RANTES, eotaxina e IP-10 (proteína produzida por IFN-?) foram detectados apenas em sobrenadantes de PDLSCs/PgPE. Além disso, PgPE induziu maior secreção de proteína quimiotática de neutrófilos (MCP)-1, intérferon (IFN)-?, interleucina (IL)-6, IL-8 e IL-1ra (p> 0,05). O recrutamento de HL-60D aumentou 4,7 vezes quando estas células foram expostas a sobrenadantes PDLSCs/PgPE, enquanto que os sobrenadantes de PDLSCs não afetaram a quimiotaxia de HL-60D. Sobrenadantes PDLSCs promoveram uma redução de 16% na produção de espécies de oxigênio reativo (ROS) por HL-60D estimuladas por PMA (p=0,013). Em contraste, sobrenadantes PDLSCs/PgPE promoveram um aumento de 1,78±1,04 vezes (p=0,046) na produção de ROS. Finalmente, tanto sobrenadantes PDLSCs, como sobrenadantes PDLSCs/PgPE, não influenciaram a produção de fator de necrose tumoral (TNF)-? e IL-1? pelas HL-60D em resposta ao lipopolissacarídeo (LPS). Esses achados sugerem um importante papel das PDLSCs no reconhecimento de P. gingivalis, recrutamento de células imunes inatas e ativação de mecanismos antimicrobianos. / The aim of this study was to characterize periodontal ligament-derived mesenchymal stem cells (PDLSCs) responses to Porphyromonas gingivalis total protein extract (PgPE) and its impact on human leucocyte promyelocyte cells HL-60 biological properties. CD105-enriched PDLSCs were seeded in 6-well plates for 24h. Next, cells were challenged with PgPE (0 and 2mg/ml) for 3h (exposure period). Supernatants were then discarded, cells were washed with PBS, and cultured further for 18h before supernatants were collected. Supernatants\' cytokine and chemokine levels were assessed by bead-based multiplex assays. The effect of supernatants collected from untreated and PgPE-treated PDLSCs on HL-60D activation, recruitment and inflammatory responses was determined. PDLSCs were responsive to PgPE treatment. RANTES, eotaxin, and interferon-inducible protein (IP)-10 were detected only in supernatants collected from PgPE treated cells. Moreover, PgPE induced higher monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, interferon (IFN)-?, interleukin (IL)-6, IL-8 and IL-1ra secretion (p > 0.05). HL-60D recruitment was increased by 4.7 fold when exposed to PDLSCs/PgPE supernatants, whereas PDLSCs supernatants did not affect HL-60D chemotaxis. PDLSCs supernatants promoted a 16% reduction in radical oxygen species (ROS) production by PMA-stimulated HL-60D (p=0.013). On the contrary, PDLSCs/PgPE supernatants promoted a 1.78 ± 1.04 fold increase (p=0.046) in ROS production. Finally, both PDLSCs and PDLSCs/PgPE supernatants had no effect on HL-60D tumor necrosis factor (TNF)-? and IL-1? responses to lipopolysaccharide (LPS). These findings strongly suggest an important role of PDLSCs in the recognition of P gingivalis, recruitment of innate immune cells and activation of antimicrobial mechanisms.

A malária causa complicações envolvendo diversos órgãos, inclusive o fígado, onde se sabe que ocorrem inflamação e dano hepáticos, os quais contribuem para a severidade da doença. A interleucina (IL)-1 α é uma citocina pró-inflamatória que pertence à família da IL-1 e que pode ser produzida e liberada tanto por células não-hematopoiéticas, como hematopoiéticas em contextos como dano tecidual, infecção e doenças autoimunes em diversos órgãos. O presente estudo tem como objetivo avaliar a produção e o papel da IL-1 na imunopatogênese e na proteção durante a malária experimental. A produção da IL-1 foi investigada durante a inflamação e necrose no fígado em camundongos C57BL/6 infectados com o estágio eritrocítico do Plasmodium chabaudi. A fonte de IL-1 no fígado dos camundongos infectados foi determinada por imunofluorescência e citometria de fluxo. Camundongos IL1A-/- foram utilizados para avaliar o papel da IL-1 neste contexto. Durante a infecção aguda com o P. chabaudi, a inflamação hepática e o desenvolvimento das lesões necróticas são acompanhados pelo aumento nos níveis de IL-1 no fígado, que ocorre de forma independente do inflamassoma NLRP3 (Nod-like receptor protein 3). Os neutrófilos foram identificados como sendo a fonte de IL-1 α no fígado dos camundongos C57BL/6 infectados. De forma sistêmica, a deficiência em IL-1 α resultou numa diminuição da perda de peso e da hipotermia causados pela malária, mas teve um efeito menos significativo no controle da parasitemia. No fígado, a ausência de IL-1 reduziu o número de células TUNEL+, atenuando a necrose induzida pela infecção. A melhora no dano hepático nos camundongos IL1A-/- infectados está associada com uma menor resposta inflamatória em comparação aos camundongos C57BL/6 infectados, incluindo uma menor produção do TNF- α (Tumor necrosis factor alpha), citocina associada à apoptose de hepatócitos e, consequentemente, à necrose do tecido hepático durante a malária causada pelo P. chabaudi. Apesar de exercer um importante papel na imunopatogênese do dano e inflamação do fígado durante a fase eritrocítica da infecção pelo P. chabaudi, a ausência da IL-1 α não impediu a proteção conferida pela presença das formas eritrocíticas contra a reinfecção com esporozoítos. Em conclusão, neutrófilos produzem IL-1 α no fígado durante a fase aguda da malária causada pelo P. chabaudi. Esta citocina amplifica a resposta inflamatória à infecção e promove a necrose hepática, assim como exacerba a perda de peso e a hipotermia. / Malaria causes complications involving several organs, including the liver, where there are inflammation and damage that contribute to the disease severity. Interleukin (IL)-1 is a pro-inflammatory cytokine from the IL-1 family that can be released by non-hematopoietic or hematopoietic cells during tissue damage, infection and autoimmune diseases in different organs. The present study aims to evaluate the production and the role of IL-1 in the immunopathogenesis and in the protection during experimental malaria. IL-1 production was assessed during hepatic inflammation and necrosis in C57BL/6 mice infected with blood stages of Plasmodium chabaudi. The source of IL-1 in the liver of infected mice was determined by immunofluorescence and flow cytometry analyses. IL1A-/- mice were used to assess the role of IL-1 in this context. During acute P. chabaudi infection, hepatic inflammation and development of necrotic lesions were accompanied by an increase in IL-1 levels in the liver, which occurred independently of the Nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome. Neutrophils were identified as the source of IL-1 α in the liver of infected C57BL/6 mice. Systemically, IL-1 deficiency resulted in reduction of weight loss and hypothermia caused by P. chabaudi malaria, but had minor effect on parasitemia control. In the liver, the absence of IL-1 reduced the number of TUNEL+ cells and attenuated the necrotic process induced by infection. The amelioration of liver damage in infected IL1A-/- mice was associated with lower inflammatory response compared to infected C57BL/6 mice, in particular with a decrease in tumor necrosis factor alpha (TNF- α) production, which has been directly implicated in the apoptosis of hepatocytes and, in consequence, the necrosis of the liver tissue during P. chabaudi malaria. Despite the important role in liver damage and inflammation immunopathogenesis during the blood-stage P. chabaudi infection, the absence of IL-1 α did not impair the protection conferred by blood stages against sporozoite reinfection. This study shows that neutrophils produce IL-1 α in the liver during acute P. chabaudi malaria. This cytokine amplifies the inflammatory response to infection and promotes liver necrosis, as well as exacerbates the weight loss and hypothermia.

TREM-1 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1) est un récepteur exprimé par les cellules de l’immunité innée qui amplifie l’inflammation initiée par les TLRs (Toll-like Receptors) et est impliquée dans plusieurs pathologies inflammatoires aigües et chroniques. À ce jour, peu de choses sont connues quant aux mécanismes moléculaires d’activation de TREM-1. Ainsi, nous avons développé des outils pour pouvoir stimuler TREM-1 de façon monovalente et multivalente. Ces travaux montrent que TREM-1 est activé par multimérisation et qu’il est régulé différemment sur les neutrophiles et monocytes. En effet, sur les monocytes activés au LPS, l’activation de TREM-1 s’effectue en deux étapes tandis qu’une seule est nécessaire dans les neutrophiles. Grâce à des approches de protéomiques, nous avons confirmé la dimérisation de l’ectodomaine de TREM-1 en solution. De plus, la multimérisation semble aussi être médiée par le ligand naturel de TREM-1, qui est, entre autres, libéré par les neutrophiles activés au LPS. Le travail présenté ici est une première étape vers la compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à l'interaction de TREM-1 et son ligand, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques / Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1 (TREM-1) is a receptor expressed on innate immune cells which amplifies inflammatory signals initially triggered by TLRs (Toll-like receptors) and TREM-1 has been characterized as a major player in the pathophysiology of acute and chronic inflammatory diseases. Currently, the molecular mechanisms leading to the activation of TREM-1 remain unknown. We have developed specific tools to stimulate TREM-1 in a monovalent and divalent way. Here we show that TREM-1 is activated by multimerization and is differentially regulated on neutrophils and monocytes. Indeed, TREM-1 activation on primary human monocytes by LPS required a two-step process while one is required on neutrophils. Using proteomic approaches, we have confirmed that TREM-1 ectodomain dimerizes in solution. Furthermore, the multimerization seems to be mediated by the natural ligand of TREM-1, which is released by LPS activated neutrophils. Collectively, our findings uncover molecular mechanisms leading to TREM-1 and its ligand interaction, painting the way of new therapeutics

Neutrophils, contributing to approximately 40%-70% of white blood cells in mammals, are the most abundant type of leukocytes in human circulation. As critical effector cells in innate immunity, neutrophils form the first line of host defense against microbes and are the first immune cells recruited to an inflamed tissue. The pathogen phagocytosis, release of reactive chemicals and proteases, and formation of extracellular traps are the key weapons of neutrophils in host defense. However, neutrophils also contribute to collateral tissue damage when performing their antimicrobial functions. The destructive potential of neutrophils requires the tight regulation of their activation and recruitment. In this study, we found that miR-223 in epithelial cells controls neutrophil response to inflammation through regulating the activation of NF-kB. As fast moving cells, neutrophils rely on glycolysis for energy production. The function of mitochondria in neutrophil motility is unknown. We demonstrated that mitochondria play an indispensable role in neutrophil migration: the biogenesis of mitochondria, mitochondrial ROS and the interaction between mitochondria and ER are all involved in maintaining the movement of neutrophils.<br>