Nitric oxide (NO) regulates a wide range of plant processes from development toenvironmental adaptation. In this study, NO production and its effects were investigated in aplant-pathogen context. The production of NO following Arabidopsis treatment witholigogalacturonides (OGs), an endogenous elicitor of plant defense, was assessed using the NOsensitive probe 4, 5-diamino fluorescein diacetate. Pharmacological and genetic approaches wereused to analyze NO enzymatic sources and its role in the Arabidopsis thaliana /Botrytis cinereainteraction. We showed that NO production involves both a L-arginine- and a nitrate reductase(NR)-pathways. OGs-induced NO production was Ca2+-dependent and modulated RBOHDmediatedROS production. NO production was also regulated by CDPKs activities, but workedindependently of the MAPKs pathway. Using a transcriptomic approach, we further demonstratedthat NO participates to the regulation of genes induced by OGs such as genes encoding diseaserelatedproteins and transcription factors. The over-representation of certain regulatory elements(e.g. W-BOX) in promoter sequences of target genes also suggests the involvement of specifictranscription factors in the NO response. Mutant plants impaired in several selected NOresponsivegenes, as well as Col-0 plants treated with the NO scavenger cPTIO, were moresusceptible to B. cinerea. Taken together, our investigation deciphers part of the mechanismslinking NO production, NO-induced effects and basal resistance to Botrytis cinerea. Moregenerally, our data reinforce the concept that NO is a key mediator of plant defense responses

Zymoseptoria tritici est l'un des dix plus importants champignons pathogènes des plantes. Son impact économique sur la production de blé et ses caractéristiques biologiques (dimorphisme levure-hyphae, hémi-biotrophie, populations sexuées et diversifiées) fait de Z. tritici un organisme unique parmi les champignons pathogènes des plantes. Au cours des dix dernières années, il a suscité un intérêt croissant de la communauté scientifique conduisant au développement d'outils génomiques et génétiques. Ces efforts ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa pathogénie et son évolution. Nous avons focalisé notre étude sur les trois «Mitogen-Activated Kinases» (MAPK) ZtFus3, ZtHog1 et ZtSlt2 de Z. tritici nécessaires au succès de l’infection. Nous avons réalisé une caractérisation phénotypique détaillée du mutant de délétion ZtSLT2 lors de l'infection du blé et du développement fongique in vitro. Nous avons montré que le mutant ΔZtslt2 est non pathogène pour les feuilles de blé, même lorsque la pénétration stomatique est court-circuitée par injection de spores dans la feuille, ce qui suggère que ce mutant présente un défaut dans la colonisation des tissus de la plante. Pendant la croissance in vitro, ZtSLT2 est nécessaire à la pigmentation, des colonies, l’émergence des hyphes aériens, la formation de biofilm et l’hydrophobicité de la colonie. Ces phénotypes sont des marqueurs d'un processus développemental qui se produit pendant le vieillissement de la colonie de Z. tritici (développement de colonies pigmentées et hydrophobes portant des hyphes aériens blancs). Ce processus développemental survient à des moments différents selon le milieu de culture et la température, le plus rapide étant sur milieu pauvre «Pomme de terre Glucose» (PD) à 25 °C (4 jours) et le plus lent sur milieu riche complet «Extrait de Levure, Peptone, Glucose» (YPD) à 18 °C (18 jours). Nous avons montré que les gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la mélanine, des α-1,3-glucanes et des hydrophobines sont surexprimées au cours de ce processus développemental dans la souche sauvage, en particulier après trois jours de culture sur PD à 25 °C par rapport aux autres conditions. Cette surexpression nécessite que la voie ZtSLT2 soit fonctionnelle. L’analyse transcriptomique (RNAseq) de ces conditions différentielles est en cours pour identifier le réseau de gènes nécessitant la protéine Slt2 pour leur expression. Ces gènes cibles de ZtSLT2 sont des facteurs de pathogénicité putatifs.Nous avons également développé un nouvel outil moléculaire pour Z. tritici. Nous avons montré que les promoteurs pMoNIA1 et pZtNIA1 des gènes codant les nitrates réductases de Magnaporthe oryzae et Z. tritici, respectivement, sont régulés par la source d’azote du milieu de la même façon chez Z. tritici. L’expression de gènes sous le contrôle de ces deux promoteurs est maximale en présence de nitrate comme seule source d'azote, mais réduite en présence de glutamate. Ces promoteurs peuvent donc être utilisés pour l'expression conditionnelle de gènes et le remplacement de promoteur chez Z. tritici. Ils seront utiles pour contrôler l'expression des allèles constitutivement actifs des MAP kinase kinases dans le but d’activer les voies des MAPK de manière conditionnelle. / Zymoseptoria tritici is one of the ten more important fungal plant pathogens. Its economic impact on wheat production and its biological characteristics (yeast-fungal dimorphism, hemi-biotrophy, sexual and highly diverse populations) make Z. tritici unique among fungal plant pathogens. It has therefore drawn attention of the scientific community during the last ten years, leading to the development of genomic and genetic tools. These efforts have improved our understanding of its pathogenicity and evolution. We have focused our study on the three Z. tritici Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) signalling pathways (ZtFUS3, ZtHOG1, and ZtSLT2) which are required for pathogenicity. We provided novel insights in the role of ZtSlt2 MAPK signalling pathway using a detailed phenotypic characterization of SLT2 deletion mutant during wheat infection and in vitro development. We showed that SLT2 is non-pathogenic on wheat leaves, even when stomatal penetration is bypassed by spore injection, suggesting a defect in leaf colonisation. During in vitro growth, SLT2 is required for melanisation, aerial hyphae emergence, biofilm formation and colony hydrophobicity which are markers of a developmental switch occurring during Z. tritici colony aging (development of melanised and hydrophobic colonies supporting abundant white aerial hyphae). This developmental switch occurs at different times depending on media and temperatures, quickest being on poor plant-derived Potato Dextrose (PD) medium at 25°C (4 days) and slowest on rich complex Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) medium 18°C (18 days). We provided evidence that genes encoding enzymes involved in both melanin and α-1,3-glucan biosynthesis, and hydrophobins are up-regulated during this developmental switch in wild type, in particular at 3 days on PD at 25°C compared to other conditions. This up-regulation clearly requires a functional ZtSLT2 pathway. Transcriptomic analysis (RNAseq) of these differential conditions is ongoing to identify the network of genes requiring SLT2 for their expression. These SLT2 target genes are putative pathogenicity factors. We also provide a new molecular tool for Z. tritici. We showed that pMoNIA1 and pZtNIA1 promoters from nitrate reductases encoding genes of Magnaporthe oryzae, and Z. tritici, respectively, are nitrogen-responsive in Z. tritici to a similar extent. They are fully expressed in presence of nitrate as sole nitrogen source and down-regulated in presence of glutamate, showing they are suitable for conditional gene expression and promoter replacement in Z. tritici. These promoters will be useful to control the expression of constitutively active alleles of MAP Kinase kinases in order to activate MAPK pathways in a conditional manner.

La salinidad y el estrés hídrico son los factores más importantes que limitan la producción de trigo duro, sobre todo en regiones áridas y semiáridas, como la región Mediterránea. El trigo duro es uno de los principales cultivos en el sur y este de la Cuenca Mediterránea, donde se cultiva frecuentemente en condiciones de secano y si es posible con riego deficitario, a menudo con agua de poca calidad, que junto a una elevada evapotranspiración, puede provocar una progresiva salinización del terreno. En este sentido, la mejora genética de trigo duro para una mejor adaptación a estas condiciones de estrés es una de las pocas alternativas viables. El objetivo general de esta Tesis es estudiar las bases fisiológicas y moleculares de las diferencias genotípicas en crecimiento potencial y tolerancia a la salinidad y el estrés hídrico. En un primer estudio (Experimento 1) publicado en “Functional Plant Biology” se investigó qué criterio fenotípico de selección era el más adecuado para seleccionar genotipos de trigo duro que crecieran mejor en condiciones de salinidad continuada. De esta forma se determinó la importancia de los isótopos estables como criterios eficientes para seleccionar genotipos tolerantes y susceptibles a la salinidad. Posteriormente, se realizó un segundo estudio (Experimento 2) donde se evaluó el efecto de la salinidad en la composición isotópica del carbono (δ13C) y el nitrógeno (δ15N) de genotipos de trigo duro y de dos amfiploides (un tritordeo y un triticale). Este trabajo está publicado en la revista “Journal of Experimental Botany”. En este segundo ensayo, la salinidad se aplicó durante la floración y el llenado del grano durante unas pocas semanas. Los resultados de este trabajo representaron la puesta a punto del estudio del comportamiento fisiológico del trigo duro durante la fase reproductiva y bajo diferentes combinaciones de salinidad y riego. Como continuación de los dos Experimentos (1 y 2) y en vista de los resultados obtenidos en el uso de las firmas isotópicas como criterio de evaluación bajo condiciones salinas, se planteó evaluar el uso combinado de la composición isotópica del carbono (δ13C), oxígeno (δ18O) y el nitrógeno (δ15N) en materia seca para observar las respuestas genotípicas de plantas de trigo duro sometidas a diferentes combinaciones de salinidad. Como contribución original, se elaboró un modelo conceptual de las tres firmas isotópicas juntas (δ13C, δ18O, δ15N) junto con características del metabolismo nitrogenado para explicar las diferencias genotípicas en tolerancia a distintas condiciones de salinidad y estrés hídrico. También se evaluaron las características fotosintéticas en relación con las firmas isotópicas y las actividades de enzimas clave del metabolismo nitrogenado. (Trabajo Publicado en la revista “New Phytologist”). Además de los resultados anteriores obtenidos, en esta Tesis se comparó la eficiencia de las firmas isotópicas del carbono, oxígeno y nitrógeno mediante dos vías: muestras de materia seca y muestras de fracción soluble en genotipos de trigo duro para la evaluación de diferencias genotípicas en tolerancia a diferentes condiciones de salinidad y regimenes hídricos. Posteriormente se analizó la respuesta genética de plantas de trigo duro a la salinidad evaluando el nivel de transcripción de genes específicos asociados a tolerancia a salinidad y estrés hídrico, junto a otros que codifican para enzimas claves del metabolismo nitrogenado. También se han estudiado las relaciones entre estas tasas de transcripción, las diferencias genotípicas en crecimiento, firmas isotópicas y actividades de enzimas del metabolismo nitrogenado. El trabajo ha mostrado la eficacia de los isótopos estables de carbono y del nitrógeno como herramientas de evaluación de la respuesta del trigo duro frente a la salinidad. / Inadequate irrigation for long term and under conditions of high evapotranspiration demand, combined with the use of poor water quality and the lack of adequate drainage frequently induces the salinization of arable land causing a significant increase in the area affected by salinity. Salinity is an environmental factor that limits in a remarkable manner the production of crops in many parts of the world, but especially in arid and semiarid regions like the Mediterranean. Under these conditions, which is often grown durum wheat improvement for tolerance to salinity under irrigation deficit may be one of the strategies to alleviate this problem. This Thesis shows that isotope compositions of carbon (δ13C), oxygen (δ18O), and nitrogen (δ15N) and the concentration of nitrogen in dry matter are potentially and effective criteria for discriminating between different growing conditions and between genotypes tolerant or susceptible to salt. Furthermore, the results of this study reflect the importance of nitrogen metabolism in tolerance to salinity. Additionally, this thesis develops a model relating genotypic tolerance to different conditions of salinity and drought with the signatures of the three isotopes (C, O, N), together with photosynthetic and transpiration exchanges and parameters key of nitrogen metabolism such as nitrogen concentration and activities of the glutamine synthetase and nitrate reductase. Finally, we study the relationship between the expression of genes potentially key in the tolerance to salinity and drought and genotypic variability in response to different combinations of these stresses.