Orientadora: Durvalina Maria Mathias dos Santos / Banca: Raffaella Rossetto / Banca: Marcelo de Almeida Silva / Banca: Marcos Omir Marques / Banca: David Ariovaldo Banzatto / Resumo: No presente trabalho foi verificado o ajuste osmótico no crescimento inicial de cana-de-açúcar, cv. IAC91-5155, sob efeito da interação dos estresses hídrico e ácido no solo. Para tanto, foram quantificados os teores de três solutos compatíveis, prolina, glicina betaína e trealose. Também foi estudada a atividade da nitrato redutase e os teores de clorofilas. O estudo de todas estas variáveis teve por objetivo propor a utilização destes compostos como indicadores fisiológicos de aclimatação da cana-deaçúcar sob efeito da interação de ambos os estresses. O experimento foi realizado em casa de vegetação com 29,7±4,3oC e 75±10 UR%. Foram utilizados três tratamentos de disponibilidade hídrica (capacidade de campo, CC): controle (70%), estresse moderado (55%) e estresse severo (40%) e três tratamentos de acidez no solo (saturação por bases, V%): controle (55%), média acidez (33%) e alta acidez (23%). O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados em esquema fatorial 3x3, com quatro repetições. Após 60 dias sob estresses foram determinados os teores dos solutos compatíveis, a atividade da nitrato redutase e os teores das clorofilas. Os resultados mostram que houve acúmulo dos três solutos compatíveis evidenciando que ocorreu ajuste osmótico. Prolina e glicina betaína são indicadores fisiológicos do efeito da interação de ambos os estresses enquanto trealose é indicadora apenas para o estresse hídrico. Também, a atividade da nitrato redutase pode ser utilizada como indicador do estresse hídrico e os teores das clorofilas a, b e total para os estresses hídrico ou ácido. A massa de matéria seca da parte aérea, o número de folhas e a área foliar das plantas jovens de cana-de-açúcar, ajustadas osmoticamente, são reduzidos pelos estresses. Os efeitos interativos de ambos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this present work was verified the osmotic adjustment in the initial plant growth sugarcane cv. IAC91-5155 under interaction effect of water and acid stress in the soil. For this, were quantified three compatible solutes content, as follows: proline, glycine betaine and trehalose. It was verified also the nitrate reductase activity as well the chlorophyll content. The study of all parameters aimed to propose the use components as physiological indicators to acclimation of sugarcane plants under interaction the both stress. The experiment was carried out in a greenhouse under 29.7±4.3oC and 75±10%. Three water availability treatments (Field Capacity - FC%): control (70%), moderate stress (55%), and extreme stress (40%) and three soil acidification treatment (Base Saturation - BS%): control (55%), average acidity (33%), and high acidity (23%) were used. The experimental design used was the randomized blocks in a 3x3 factorial scheme and four replicates. After sixty days under stress were determined compatible solutes, nitrate reductase and chlorophyll content. Our results showed that there was the accumulation of three compatible solutes exhibiting osmotic adjustment. Glycine betaine and proline are both physiologic indicators of stresses interaction effect whereas trehalose indicates only water stress. The nitrate reductase activity can be used as water stress indicator and chlorophylls a, b and total are indicators to water or acid stress. The dry mass of shoot part, leaves number and leaf area are significantly reduced by stress in young sugarcane plants adjusted osmotically. The interaction of stresses cause decrease of dry mass while water stress reduces leaves number and leaf area. / Doutor

O presente trabalho avaliou crescimento, atividade da nitrato redutase (NR), composição química e captação de nitrato e fosfato em Gracilariopsis tenuifrons cultivada em laboratório em meio com adição de 0, 50, 150, 250, 500 ou 750 μM de nitrato. Em algas cultivadas na proporção de 1 g de massa fresca por 1 L de meio de cultivo, a taxa de crescimento aumentou de acordo com a disponibilidade de nitrato, atingindo um patamar na concentração de 150 μM. Isto indicaria limitação de outro nutriente ou luz ao crescimento da espécie. O conteúdo tecidual de nitrogênio aumentou conforme o incremento de nitrato, devido ao acúmulo de pigmentos fotossintetizantes (ficobiliproteínas e clorofila a) e proteínas solúveis. O conteúdo tecidual de carbono e a razão C:N diminuíram com a maior disponibilidade de nitrato no meio de cultivo, provavelmente em resposta à assimilação deste nutriente, que estimularia o fluxo de carbono através das rotas glicolíticas e respiratórias, evitando seu acúmulo como amido das florídeas ou floridosídeo. A atividade da NR foi maior nas algas mantidas em meio com 50 μM de nitrato. Nos tratamentos sem nitrato ou com acréscimo de 250, 500 ou 750 μM de nitrato, os valores de atividade da NR foram baixos e semelhantes entre si. Estes resultados não foram condizentes com os dados de crescimento e nitrogênio tecidual, os quais refletiriam o metabolismo de nitrogênio. Foi sugerida a hipótese de que o acúmulo de compostos nitrogenados pelas algas submetidas aos tratamentos com maior disponibilidade de nitrato poderia desencadear um mecanismo de feedback negativo sobre a atividade da NR, inativando-a temporariamente e fazendo com que as algas apresentassem uma baixa atividade enzimática. Submetendo-se as algas cultivadas em meio com adição de 250 μM de nitrato a uma elevada irradiância, foi observado aumento da atividade da NR após 10 min, corroborando a hipótese sugerida. A taxa de captação de nitrato aumentou de acordo com a disponibilidade deste nutriente no meio, sendo que a taxa de captação de fosfato não estava correlacionada à de nitrato. Quando as algas foram cultivadas na proporção de 10 g de massa fresca por 1 L de meio de cultivo, o conteúdo de nitrogênio foi maior naquelas mantidas em meio com adição de 50 μM de nitrato. Foi observada correlação negativa entre conteúdo tecidual de nitrogênio e razão amido:(3,6-anidro- α-L-galactopiranose + α-L-galactopiranose-6-sulfato). Uma vez que não houve diferença significativa entre os tratamentos com relação ao rendimento de polissacarídeos, aqueles com adição de 50 ou 150 μM de nitrato seriam mais interessantes para a produção de ágar em Gp. tenuifrons, nas condições de experimentação empregadas neste trabalho / This study evaluated growth, nitrate reductase (NR) activity, chemical composition and nitrate and phosphate uptake in Gracilariopsis tenuifrons grown in vitro in medium with addition of 0, 50, 150, 250, 500 or 750 μM of nitrate. In algae maintained at 1 g of fresh weight per litre of culture medium, growth rate increased according to the availability of nitrate, reaching a plateau at the concentration of 150 μM. This indicates limitation of other nutrient or light to the growth of the species. Tissue nitrogen content increased with the increment of nitrate, due to accumulation of photosynthetic pigments (phycobiliproteins and chlorophyll a) and soluble proteins. Tissue carbon content and C:N ratio reduced with higher availability of nitrate in the culture medium, probably in response to the assimilation of this nutrient, which stimulates the carbon flux through the glycolytic and respiratory pathways, avoiding its accumulation as floridean starch or floridoside. NR activity was higher in algae kept in medium with 50 μM of nitrate. In treatments without nitrate or with 250, 500 or 750 μM of nitrate, NR activities were low and similar to each other. These results were not consistent with the observed growth rate and nitrogen content, which reflect the nitrogen metabolism. It was suggested that the accumulation of nitrogenous compounds by the algae grown under a higher availability of nitrate could trigger a negative feedback on NR activity, inactivating it temporally, resulting in a low enzymatic activity. When algae grown in medium with 250 μM of nitrate were submitted to a higher irradiance, NR activity increased after 10 min, supporting the suggested hypothesis. Nitrate uptake rate increased according to the availability of this nutrient in the medium, and phosphate uptake rate was not correlated with it. When algae were grown at of 10 g of fresh weight per litre of culture medium, nitrogen content was higher in the algae kept in the medium with 50 μM of nitrate. A negative correlation between nitrogen content and starch:(3,6-anhydro- α-L-galactopyranose + α-L-galactopyranose-6-sulfate) ratio was observed. As there was no significant difference between the treatments in relation to polysaccharides yield, the ones with 50 or 150 μM of nitrate would be more interesting to the production of agar in Gp. tenuifrons, in the experimental conditions employed in this study.

Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Latansio_SabrinaCostaRibeiro_D.pdf: 3607049 bytes, checksum: c52d621e9ef89b42d0f5fc2c9df1f6d8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: ...Note: The complete Abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutora em Biologia Vegetal

No description available.

No ambiente marinho a maior fonte de nitrogênio encontra-se na forma de nitrato, que é reduzido para incorporação à biomoléculas como aminoácidos e bases nitrogenadas. A enzima nitrato redutase (NR), responsável pela conversão de nitrato a nitrito, é a primeira enzima a participar do processo de assimilação de nitrogênio. Gracilaria tenuistipitata é uma macroalga marinha de grande importância econômica explorada comercialmente para a produção de ágar, um ficocolóide de ampla aplicação industrial e biotecnológica. Esta alga tem seu crescimento limitado principalmente pela assimilação de nitrogênio do meio. Em trabalhos anteriores envolvendo a NR de G. tenuistipitata, foram demonstradas as oscilações diárias de sua atividade e expressão protéica. Esses ritmos permaneceram mesmo em situações de luz constante, sendo assim regulados endogenamente pelo relógio biológico. Neste trabalho procuramos seqüênciar o gene de NR nesta alga e responder se a regulação de NR também ocorria na transcrição, estudando o ritmo diário dos níveis de expressão do RNA mensageiro. Na biblioteca de cDNA de G. tenuistipitata identificamos e seqüenciamos os clones de NR por primer walking. Utilizando os mesmos primers desenhados, seqüenciamos também o gene da NR, que não apresenta introns. Esta é a primeira descrição na literatura de uma NR sem introns e também do gene NR de algas vermelhas. Observamos a oscilação diária da expressão do RNA mensageiro de NR. Esses dados nos permitem concluir que a regulação de NR em G. tenuistipitata também ocorre durante a expressão deste gene. Em condições normais de claro-escuro há uma expressão basal de NR que pode ser atribuída a existência de dois genes de NR, um constitutivo e outro regulado; ou ainda a um único gene que tem sua expressão basal induzida. / In the marine environment, the major source of nitrogen is nitrate, which must be reduced before incorporation into organic compounds, such as amino acids and nitrogen bases (purines and pyrimidines). The first enzyme that participates in the nitrogen assimilation process is nitrate reductase (NR), which is responsible for the conversion of nitrate to nitrite. Gracilaria tenuistipitata is a marine macroalga with a great economic importance, harvested for the production of agar, which has many uses in products from industry and biotechnology. Nitrogen is the limiting macronutrient of this alga\'s growth. The previous biochemical characterization for NR in this alga demonstrated a dial oscillation of activity and protein expression. These rhythms have been conserved in the situation of continuous light being regulated by the biological clock. For a better understanding of the regulation of NR, we sequenced the NR gene and studied the genetic regulation of NR mRNA expression. In a cDNA library of G. tenuistipitata, we identified and sequenced the NR clones, using the primer walking methodology. Using the same primers we also sequenced the gene that did not show introns. This is the first description in the literature of a NR gene for red algae and also of intron absence in NR genes. A rhythm for NR mRNA expression was observed in a period of 24h. In conclusion NR expression is also regulated at the transcription level. There is a basal expression of the NR gene that could be related to two hypotheses: two NR genes, one constitutive and another regulated, or only one NR gene, which is continuously translated having, however, its expression regulated and enhanced.

O nitrogênio é um dos nutrientes que mais altera a produtividade das plantas forrageiras e as formas de fornecimento desse nutriente podem alterar as respostas das plantas. Objetivou-se avaliar as alterações morfogênicas, nutricionais, metabólicas e produtivas do capim tanzânia (Panicum maximum cv. Tanzânia), em função do fornecimento de doses de nitrogênio e proporções de NO3-/NH4+ na solução nutritiva. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, com emprego de substrato inerte e avaliando três doses de nitrogênio para fornecer nutrição baixa, intermediária e alta em nitrogênio (3, 15 e 27 mmol L-1) e três proporções de NO3-/NH4+ não fornecendo e até suprindo amônio em relativo excesso (100/0, 70/30 e 40/60). As plantas foram submetidas a dois cortes da parte aérea e as raízes foram coletadas após o segundo corte. Foram avaliados o número de folhas e perfilhos, taxas de aparecimento de folhas e perfilhos, área foliar, produção de massa seca de parte aérea e de raízes, concentrações de nitrogênio total, NO3- e NH4+ nos tecidos vegetais, valor SPAD, concentrações de malondealdeído (MDA) e peróxido de hidrogênio e atividades das enzimas redutase do nitrato, glutamina sintetase, catalase, superóxido dismutase e glutationa redutase. A baixa dose de nitrogênio comprometeu a área foliar e produção de massa seca em ambos os crescimentos do capim tanzânia. O excesso de amônio na solução nutritiva também foi responsável pela área foliar e menor massa de parte aérea e de raízes. Elevadas concentração de MDA e peróxido foram encontrados nos componentes da parte aérea de plantas crescidas sob doses de nitrogênio com proporção de NO3-/NH4+ de 40/60, indicando estresse oxidativo nessas plantas. O estresse ocasionado pelo fornecimento exclusivo da forma nítrica ou pelo excesso de amônio resultou na indução de uma nova banda de SOD no sistema radicular do capim tanzânia, o que sugere que essa enzima tenha sido mais responsiva na eliminação de EROs no sistema radicular. / Nitrogen is one of the nutrients that most improve forage grass productivity and the forms of this nutrient supply may affect plant responses. The objectives were to evaluate morphogenic, nutritional, metabolic and productive changes in tanzânia guineagrass (Panicum maximum cv. Tanzânia), as realated to the supply of nitrogen rates and NO3-/NH4+ proportions in the nutrient solution. The experiment was carried out in a greenhouse, by an inert substrate and testing three nitrogen rates to supply low, intermediate and hight nitrogen nutrition and three NO3-/NH4+ proportions (100/0, 70/30, 40/60) to have no ammonium up to relative excess ammonium. Plants had shoots harvested two times and roots were collected after the second harvest. Plant evaluations included number of leaves and tillers, leaf and tiller appearance rates, leaf area, shoots and roots dry matter production, plant tissue concentrations of total nitrogen, nitrate and ammonium, SPAD value, concentrations of malondialdehyde and hydrogen peroxide, and activities of the enzymes nitrate reductase, glutamine synthase, catalase, superoxide dismutase and glutatione reductase. Low nitrogen dose damaged the leaf area and dry matter production in both growths of tanzânia grass. The excess of ammonium in the nutrient solution was also responsible for leaf area and lower mass of shoots and roots. High concentration of MDA and peroxide were found in the shoot components of grown plants under nitrogen levels ratio of NO3-/NH4+ 40/60, indicating oxidative stress in these plants. The stress caused by the exclusive supply of the ammonium nitrate form, or excess of ammonium resulted in the induction of a new band of SOD on the root system of the tanzânia guineagrass, suggesting that this enzyme has been more responsive in the elimination of ROS in the root system.

O nitrogênio é um dos nutrientes que mais altera a produtividade das plantas forrageiras e as formas de fornecimento desse nutriente podem alterar as respostas das plantas. Objetivou-se avaliar as alterações morfogênicas, nutricionais, metabólicas e produtivas do capim tanzânia (Panicum maximum cv. Tanzânia), em função do fornecimento de doses de nitrogênio e proporções de NO3-/NH4+ na solução nutritiva. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, com emprego de substrato inerte e avaliando três doses de nitrogênio para fornecer nutrição baixa, intermediária e alta em nitrogênio (3, 15 e 27 mmol L-1) e três proporções de NO3-/NH4+ não fornecendo e até suprindo amônio em relativo excesso (100/0, 70/30 e 40/60). As plantas foram submetidas a dois cortes da parte aérea e as raízes foram coletadas após o segundo corte. Foram avaliados o número de folhas e perfilhos, taxas de aparecimento de folhas e perfilhos, área foliar, produção de massa seca de parte aérea e de raízes, concentrações de nitrogênio total, NO3- e NH4+ nos tecidos vegetais, valor SPAD, concentrações de malondealdeído (MDA) e peróxido de hidrogênio e atividades das enzimas redutase do nitrato, glutamina sintetase, catalase, superóxido dismutase e glutationa redutase. A baixa dose de nitrogênio comprometeu a área foliar e produção de massa seca em ambos os crescimentos do capim tanzânia. O excesso de amônio na solução nutritiva também foi responsável pela área foliar e menor massa de parte aérea e de raízes. Elevadas concentração de MDA e peróxido foram encontrados nos componentes da parte aérea de plantas crescidas sob doses de nitrogênio com proporção de NO3-/NH4+ de 40/60, indicando estresse oxidativo nessas plantas. O estresse ocasionado pelo fornecimento exclusivo da forma nítrica ou pelo excesso de amônio resultou na indução de uma nova banda de SOD no sistema radicular do capim tanzânia, o que sugere que essa enzima tenha sido mais responsiva na eliminação de EROs no sistema radicular. / Nitrogen is one of the nutrients that most improve forage grass productivity and the forms of this nutrient supply may affect plant responses. The objectives were to evaluate morphogenic, nutritional, metabolic and productive changes in tanzânia guineagrass (Panicum maximum cv. Tanzânia), as realated to the supply of nitrogen rates and NO3-/NH4+ proportions in the nutrient solution. The experiment was carried out in a greenhouse, by an inert substrate and testing three nitrogen rates to supply low, intermediate and hight nitrogen nutrition and three NO3-/NH4+ proportions (100/0, 70/30, 40/60) to have no ammonium up to relative excess ammonium. Plants had shoots harvested two times and roots were collected after the second harvest. Plant evaluations included number of leaves and tillers, leaf and tiller appearance rates, leaf area, shoots and roots dry matter production, plant tissue concentrations of total nitrogen, nitrate and ammonium, SPAD value, concentrations of malondialdehyde and hydrogen peroxide, and activities of the enzymes nitrate reductase, glutamine synthase, catalase, superoxide dismutase and glutatione reductase. Low nitrogen dose damaged the leaf area and dry matter production in both growths of tanzânia grass. The excess of ammonium in the nutrient solution was also responsible for leaf area and lower mass of shoots and roots. High concentration of MDA and peroxide were found in the shoot components of grown plants under nitrogen levels ratio of NO3-/NH4+ 40/60, indicating oxidative stress in these plants. The stress caused by the exclusive supply of the ammonium nitrate form, or excess of ammonium resulted in the induction of a new band of SOD on the root system of the tanzânia guineagrass, suggesting that this enzyme has been more responsive in the elimination of ROS in the root system.

Plantas de café Arábicas com 4,5 anos de idade foram comparadas de agosto a dezembro crescendo a pleno sol e sob condições de sombreamento natural. As plantas apresentaram diferenças significativas em termos de crescimento e aspectos fisiológicos e bioquímicos O fornecimento de nitrogênio no mês de outubro proporcionou um aumento significativo nos teores de aminoácidos totais e na atividade da redutase do nitrato. As folhas de plantas crescendo em condições de sombreamento natural apresentaram maior peso fresco a que pleno sol. O teor de proteínas totais decresceu abruptamente a partir do mês 10 em todas as plantas analisadas, época em coincidiu com o inicio do enchimento dos grãos. O aumento nos teores de aminoácidos totais também foi acompanhado por um aumento nos dias de chuva, na precipitação e também na radiação global. Não houve efeito significativo com relação á localização da folhas (parte superior x parte inferior) nos aspectos analisados. O fornecimento de nitrogênio no mês 10 não alterou a concentração de clorofila medida pelo clorofilômetro SPAD, e a clorofila total extraída não se alterou significativamente até o mês 11 exceto nas plantas de sol as folhas do parte superior tiveram uma maior síntese no mês 9. No mês 12 houve um aumento nas taxas de clorofila em todos os tratamentos. Os teores de N foliar tiveram correlação positiva com as leituras de clorofila analisadas pelo SPAD, ate o mês 11. Tivemos também no período de analise, um aumento significativo na concentração de carotenóides a partir do mês 8, evidenciando seu efeito foto protetor uma vez que houve também um aumento na radiação global no período ao redor de 50%. As folhas em condições de sombreamento natural apresentaram maior peso seco que as de pleno sol. O teor de proteínas totais decresceu abruptamente a partir do mês 11 em todas as plantas, época que coincidiu com o início da produção/enchimento dos grãos. Houve um aumento nos teores de amido após o mês 10 (exceto nas folhas da parte inferior das plantas de sol), vindo a diminuir em função do enchimento dos grãos. Também se observou uma síntese acentuada de açúcares redutores no início, decrescendo em função do início da formação dos grãos. Com relação aos nutrientes nas folhas analisadas, o manganês teve um comportamento significativamente diferente em relação aos demais, onde nas folhas a pleno sol a concentração do elemento foi de 6 a 8 vezes á das folhas sombreadas. / Plants of Arabian coffee with 4,5 years of age, had been compared from August to December growing under full sun and under natural shade conditions. The plants presented significant differences in growth terms and physiological and biochemical's aspects. The nitrogen supply in the October month provided a significant increase on levels of amino acid totals and the activity of nitrate redutase. The leaves of plants growing under natural shade presented greater fresh weight than full sun. The total protein levels abruptly decreased from the month 10 in all analyzed plants, time in coincidence with the beginning of filling up the grains. The increase on levels of total amino acids also was followed by an increase in the days of rain, the precipitation and also the global radiation. Didn't have significant effect with relation of localization of leaves (upper part X inferior part) within analyzed aspects. The nitrogen supply in month 10 did not modify the concentration of chlorophyll measured by chlorophyll meter SPAD, and chlorophyll total extracted did not change significantly until month 11 except in the sunny plants leaves of upper part that had a bigger synthesis in month 9. In month 12 had an increase on the levels of chlorophyll in all the treatments. The levels of foliar N had had positive correlation with the readings of chlorophyll analyzed by the SPAD, until month 11. We had also in the period of analyzes, a significant increase on the concentration of carotenoids from month 8, evidencing its photo protective effect. During this time also we had an increase in the global radiation in the period around 50%. The leaves in conditions of natural shade had presented greater dry weight that of full sun. The total protein levels abruptly decreased from the month 11 in all plants, time coincident with the beginning of the production/filling up of the grains. The Month 10 also had an increase in starch levels (except in leaves of third inferior of the sunny plants), decreasing in function of the filling up of the grains. Also an increased synthesis of reducing sugars was observed at the beginning and a decrease during the beginning of the formation of the grains. With regard to the nutrients in analyzed leaves, the manganese had a behavior significantly different in relation to others, where in leaves at the full sun the concentration of the element was 6 to 8 times higher than shaded leaves.

Mon objectif a consisté à élucider à l'échelle moléculaire le fonctionnement des systèmes enzymatiques complexes impliqués dans des processus de conversion d'énergie chez les êtres vivants. Je m'intéresse en particulier à la compréhension de deux étapes clés du fonctionnement commun à un grand nombre de ces systèmes, à savoir (i) les étapes d'interaction de ces complexes avec les quinones membranaires et (ii) les mécanismes catalytiques au niveau des sites actifs à molybdène. Le système modèle que j'étudie est la nitrate réductase A issue de la bactérie E. coli, en collaboration avec l'équipe du Dr. Axel Magalon (LCB, Marseille). Il permet la respiration anaérobie en catalysant la réduction du nitrate en nitrite et joue un rôle important dans le cycle biogéochimique de l'azote. Ma recherche vise en particulier à identifier les facteurs moléculaires qui permettent d'ajuster la réactivité de ces systèmes. Cela nécessite l'obtention d'informations structurales à l'échelle atomique sur ces complexes macromoléculaires. La stratégie utilisée a consisté dans un premier temps à générer des intermédiaires paramagnétiques clefs du fonctionnement de ces systèmes (radicaux semiquinones ou ion MoV). Puis j'ai caractérisé leurs propriétés rédox par potentiométrie suivie par spectroscopie RPE. Enfin, j'ai utilisé les techniques de spectroscopie RPE impulsionnelle à haute résolution, notamment la spectroscopie de corrélation des sous niveaux hyperfins (HYSCORE) pour sonder l'environnement magnétique local de ces intermédiaires à travers la détection des interactions nucléaires hyperfines et quadripolaires qui sont trop faibles pour être visibles par spectroscopie RPE classique. / The aim of my work is to elucidate at the molecular level the structure and the function of enzymes involved in energy conversion processes in living organisms. In particular, it is focused on the understanding of two important steps found in many of these systems, namely (i) their interaction with membrane quinones acting as electron/proton shuttles and (ii) the catalytic mechanism at the molybdenum active site. The nitrate reductase A (NarGHI) from the bacterium Escherichia coli is used as a model for these studies. This membrane-bound complex reduces nitrate into nitrite during anaerobic respiration and plays therefore an important role in the global nitrogen cycle. The goal of my research is mainly devoted to the identification of the molecular factors tuning the reactivity of this system at the two active sites. For this purpose, I mainly relied on the structural characterization of key paramagnetic intermediates e.g. semiquinone radicals or Mo(V) ion using electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy in combination with rédox potentiometry. High resolution pulse EPR methods, especially Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectroscopy, were used to probe their local environment through the detection of hyperfine (and eventually quadrupole interactions) to nearby magnetic nuclei that are otherwise too weak to be measurable in conventional continuous wave EPR spectroscopy.

No ambiente marinho a maior fonte de nitrogênio encontra-se na forma de nitrato, que é reduzido para incorporação à biomoléculas como aminoácidos e bases nitrogenadas. A enzima nitrato redutase (NR), responsável pela conversão de nitrato a nitrito, é a primeira enzima a participar do processo de assimilação de nitrogênio. Gracilaria tenuistipitata é uma macroalga marinha de grande importância econômica explorada comercialmente para a produção de ágar, um ficocolóide de ampla aplicação industrial e biotecnológica. Esta alga tem seu crescimento limitado principalmente pela assimilação de nitrogênio do meio. Em trabalhos anteriores envolvendo a NR de G. tenuistipitata, foram demonstradas as oscilações diárias de sua atividade e expressão protéica. Esses ritmos permaneceram mesmo em situações de luz constante, sendo assim regulados endogenamente pelo relógio biológico. Neste trabalho procuramos seqüênciar o gene de NR nesta alga e responder se a regulação de NR também ocorria na transcrição, estudando o ritmo diário dos níveis de expressão do RNA mensageiro. Na biblioteca de cDNA de G. tenuistipitata identificamos e seqüenciamos os clones de NR por primer walking. Utilizando os mesmos primers desenhados, seqüenciamos também o gene da NR, que não apresenta introns. Esta é a primeira descrição na literatura de uma NR sem introns e também do gene NR de algas vermelhas. Observamos a oscilação diária da expressão do RNA mensageiro de NR. Esses dados nos permitem concluir que a regulação de NR em G. tenuistipitata também ocorre durante a expressão deste gene. Em condições normais de claro-escuro há uma expressão basal de NR que pode ser atribuída a existência de dois genes de NR, um constitutivo e outro regulado; ou ainda a um único gene que tem sua expressão basal induzida. / In the marine environment, the major source of nitrogen is nitrate, which must be reduced before incorporation into organic compounds, such as amino acids and nitrogen bases (purines and pyrimidines). The first enzyme that participates in the nitrogen assimilation process is nitrate reductase (NR), which is responsible for the conversion of nitrate to nitrite. Gracilaria tenuistipitata is a marine macroalga with a great economic importance, harvested for the production of agar, which has many uses in products from industry and biotechnology. Nitrogen is the limiting macronutrient of this alga\'s growth. The previous biochemical characterization for NR in this alga demonstrated a dial oscillation of activity and protein expression. These rhythms have been conserved in the situation of continuous light being regulated by the biological clock. For a better understanding of the regulation of NR, we sequenced the NR gene and studied the genetic regulation of NR mRNA expression. In a cDNA library of G. tenuistipitata, we identified and sequenced the NR clones, using the primer walking methodology. Using the same primers we also sequenced the gene that did not show introns. This is the first description in the literature of a NR gene for red algae and also of intron absence in NR genes. A rhythm for NR mRNA expression was observed in a period of 24h. In conclusion NR expression is also regulated at the transcription level. There is a basal expression of the NR gene that could be related to two hypotheses: two NR genes, one constitutive and another regulated, or only one NR gene, which is continuously translated having, however, its expression regulated and enhanced.