Le diabète de type 2 (T2D) est un trouble métabolique de l’homéostasie du glucose. Il est caractérisé par une hyperglycémie chronique qui résulte en partie d’une production excessive de glucose par le foie conséquence au développement d’une résistance à l’insuline. Le T2D est une pathologie multifactorielle à la fois génétique et environnementale. Récemment des études d’associations de gènes (GWAS) dans différentes cohortes ont mis en évidence une forte corrélation entre le locus CDKN2A et le risque de développement du T2D en se basant sur certains paramètres métaboliques tel que la glycémie à jeun. Le locus CDKN2A code pour des protéines régulatrices du cycle cellulaire dont la protéine p16INK4a. p16INK4a est largement décrite dans la littérature pour son rôle suppresseur de tumeurs et comme marqueur de sénescence, cependant son rôle dans le contrôle de l’homéostasie hépatique du glucose n’a jamais été rapporté. Afin de déterminer le rôle de p16INK4a dans le métabolisme hépatique du glucose, nous avons utilisé in vivo des souris sauvages (p16+/+) et déficientes pour p16INK4a (p16-/-) et in vitro des hépatocytes primaires ainsi que la lignée AML12. Nous avons montrés qu’après un jeune, les souris p16-/- présentent une hypoglycémie moins prononcée qui se traduit par une expression hépatique plus élevée de gènes de la néoglucogenèse tels que PEPCK, G6Pase et PGC1a. De plus, les hépatocytes primaires de souris p16-/- présentent une meilleur réponse au glucagon que ceux des p16+/+. Enfin, nous avons montrés que la diminution d’expression de p16INK4a par siRNA dans les AML12 suffit à induire l’expression des gènes de la néoglucogenèse et potentialise la réponse de ces cellules à différents stimuli gluconéogenique. L’effet observé dépend de l’activation de la voie PKA-CREB-PGC1A. L’ensemble de ces données montrent pour la première fois que p16INK4a pourrait jouer un rôle un cours du développement du T2D. / P16INK4a is a tumor suppressor protein well described as a cell cycle regulator. p16INK4a blocks cyclin D/ cyclin dependent kinase (CDK) 4 activity by binding to the catalytic subunit of CDK4, preventing retinoblastoma protein phosphorylation and subsequently the release of the E2F1 transcription factor. As a consequence; the transcription of genes required for progression to the S phase is restrained. Recently, genome-wide association studies (GWAS) associated the CDKN2A locus, encoding, amongst other genes, p16INK4A, with an increased risk of type 2 diabetes (T2D) development. However, the pathophysiological link between p16INK4a and hepatic glucose homeostasis remains unknown. In this context, we investigated the role of p16INK4a in hepatic glucose metabolism in vivo using p16+/+ and p16-/- mice and in vitro using primary hepatocytes and the AML12 hepatocyte cell line.p16-/- mice exhibited a higher response to fasting as shown by an increased hepatic gluconeogenic gene expression including phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), fructose-1,6-biphosphatase (F1,6P) and glucose-6-phosphatase (G6Pase). p16-/- mice displayed an enhanced hepatic gluconeogenic activity in vivo upon administration of pyruvate, a gluconeogenic substrate. Consistent with this, in vitro data show that p16-/- primary hepatocytes display an enhanced gluconeogenic response to glucagon. In addition, knock down of p16INK4a by siRNA in AML12 cells increased gluconeogenic gene expression. These effects were associated with an increased activity of the PKA-CREB signaling pathway which leads to increased PPARg coactivator 1 (PGC1)α expression, a key transcriptional co-activator that regulates genes involved in energy metabolism. These findings describe a new function for p16INK4a as an actor in the hepatic adaptation to metabolic stress and suggest that p16INK4a could play a role during T2D development .

Alcoholic Fatty Liver Disease (AFLD) is caused by excessive alcohol consumption and is a leading cause of liver related mortalities, with currently no treatments available. The goal of this project was to establish the effect of alcohol consumption on adipose tissue-derived secreted factors, adiponectin and C1q TNF Related Proteins 1-3 (CTRP1-3). We propose that excessive alcohol consumption will reduce circulating levels of adiponectin and CTRPs 1-3. Mice were fed a Lieber-Decarli control or alcohol diet for 10-days with a gavage (NIAAA model) or 6-weeks with no gavage (chronic model). Serum and adipose tissue were collected and CTRPs 1-3 and adiponectin levels were examined by immunoblot analysis. Our results indicate that long-term alcohol consumption effects adipokine secretion in a sex specific manner. Further research will be needed to explore the physiological relevance of these findings, to determine if these changes are beneficial to combat the negative effects of excessive alcohol consumption.

A research report submitted to the Faculty of Commerce, Law and Management, University of the Witwatersrand, in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master of Management in Strategic Marketing Johannesburg, April 2016 / The study hypothesized a relationship between the dependent variable, consumers’ intention not to purchase, with four independent constructs, namely, health concerns, perceived price, restricted availability and subjective norms, as de-marketing indicators. The study targeted just over two hundred consumers, aged eighteen and above, who had consumed alcohol in the last seven days, in the greater Gaborone area. The respondents were chosen using random simple sampling and quota sampling. Because of this and the fact that the greater Gaborone area makes up about fifty percent of alcohol sales, the results of the quantitative study are reasonably representative. The data was collected using structured questionnaire. The hypotheses and models were tested, and structural equation modelling performed, using SPSS and AMOS software. The study aims to address the gap of body of knowledge on alcohol policy in Botswana and other developing countries. The undertaken literature review revealed that it is only the developed countries that have implemented and evaluated their policies. The developing countries recently followed suit because their economic growth has increased consumers’ buying power and appetite for aspirational brands. The liquor industry’s advertising, promotion and sponsorships grew consumption significantly, along with socio-economic costs, such as absenteeism, alcohol abuse, car accidents, alcohol-related diseases, and the spread of HIV. Botswana’s alcohol policy has been in effect since 2011, under the Ministry of Health. Among others, legislature was revised, government imposed a tax, liquor trading days and hours amended, health-related alcohol public campaigns rolled out, and the legal blood alcohol level lowered. The study has found that the four independent constructs all influence consumer’s intention not to purchase. The biggest opportunity revealed is the effect of subjective norms, which should be exploited going forward. It is hoped by the researcher that this study, not only adds to the body of knowledge, but stimulates more research on the same. / MT2017

Moët & Chandon est le leader mondial incontesté dans le secteur des vins mousseux de haute qualité. La sélection des différentes gammes de vins de qualité se fait sur la base de la dégustation de vin, après la fermentation malolactique par la dégustation des jurys d'experts. Une partie importante du volume vinifié ne peut être classé parmi les vins les plus qualitatifs à cause d'un caractère organoleptique appelé «trait lactique». Cette caractéristique est due à la formation de métabolites volatils au cours de la fermentation du vin en particulier diacétyle, acétoïne et de 2,3-pentanedione. Le diacétyle, également connu sous le nom de 2,3-butanedione, est le principal marqueur associé à l'apparition de notes beurrées. Moët & Chandon souhaite commencer une thèse pour contrôler l'apparition de trait lactique dans ses vins de bases. Bien que la production de diacétyle se produit à la fois pendant la fermentation alcoolique (FA) et la fermentation malolactique, la thèse se concentrera sur la gestion de la FA. Une approche multi-factorielle basée à la fois sur l'ingénierie microbiologique et chimique sera mis en œuvre. Dans un premier temps, le travail visera à mieux comprendre le fonctionnement et la régulation des voies métaboliques impliquées dans la formation de diacétyle. De cette information, nous allons développer des stratégies de contrôle de la fermentation afin de minimiser le caractère lactique de vins. Dans ce travail, le rôle et l'impact des paramètres de fermentation sera particulièrement évalué. Le projet commencera par la mise en œuvre des outils d'analyse nécessaires au suivi des marqueurs de trait lactique (diacétyle, acétoïne, 2,3-pentanedione, ...). Deuxièmement, sur un support synthétique, le projet permettra de caractériser le processus de fermentation. Surtout, les équilibres azotés seront contrôlés et les cinétiques de synthèse des composés responsables de trait d'arôme lactique seront déterminées. Une étude de l'impact des acides aminés précurseurs permettra de mieux comprendre le rôle du métabolisme de l'azote. Enfin, l'étude de l'effet de divers facteurs tels que la nature des substances nutritives, température de fermentation et l'apport en oxygène devrait conduire à l'élaboration de stratégies de contrôle rendant possible la diminution du caractère lactique dans les vins destinés à la fermentation secondaire. Dans la dernière partie de projet, les différentes stratégies développées sur moûts synthétiques seront évaluées dans des conditions de vinification réelles. / Champagne company Moët & Chandon is the undisputed worldwide leader in the high quality sparkling wines sector. The selection of different ranges of quality wine is done on the basis of the wine tasting, after malolactic fermentation by tasting expert juries. A significant part of the vinified volume cannot be valued among the most qualitative wines because of a particular feature called « lactic trait ». This trait is attributable to the formation of volatile metabolites during wine fermentation particularly diacetyl, acetoin and 2,3-pentanedione. Diacetyl, also known as 2,3-butanedione, is the main marker associated with the appearance of milky-buttery notes. Champagne company Moët & Chandon wishes to initiate a thesis to control the onset of lactic trait in its wines. Although the production of diacetyl occurs both during alcoholic fermentation (AF) and malolactic fermentation, the thesis will focus on the management of AF. A multi-factorial approach based on both microbiological and chemical engineering will be implemented. At first, the work will aim to better understand the functioning and regulation of metabolic pathways involved in the formation of diacetyl. From this information, we will develop some strategies of fermentation control to minimize the lactic trait of wines. In this work, the role of fermentation parameters will be particularly evaluated. The project will start by the implementation of the analytical tools needed to monitor markers of lactic trait (diacetyl, acetoin, 2,3-pentanedione, ...). Secondly, on synthetic media, the project will allow to characterize the fermentation process. Especially, nitrogen balances will be performed and the kinetics of synthesis of the aroma compounds responsible of lactic trait will be determined. A study of the impact of the precursor amino acids will enable to better understand the role of the nitrogen metabolism. Finally, the study of the effect of various factors such as the nature of nitrogen nutrients, fermentation temperature and oxygen intake should lead to the development of control strategies making possible the decrease of the lactic trait in wines intended for the secondary fermentation. In the final part of the work, the different strategies developed on synthetic must will be assessed in real winemaking conditions.

Embora os fatores de risco ao consumo de drogas sejam bastante conhecidos, ainda pouco se sabe sobre a dinâmica e a organização das famílias de adolescentes que consomem álcool, assim como suas interrelações com a comunidade. Buscando compreendê-las, esta pesquisa objetivou analisar e interpretar a influência da família no consumo de álcool por adolescentes, a partir dos referenciais teóricos do interacionismo simbólico e da perspectiva sistêmica de família. Para tanto, adotou-se como campo de estudo a Unidade de Saúde da Família Emocy Krause, localizada no Distrito Sanitário IV, da cidade do Recife, Pernambuco, Brasil. Os participantes do estudo foram 22 membros de dez famílias, dentre os quais estavam onze adolescentes, de ambos os sexos, na faixa etária de quatorze a dezenove anos, e que consumiam álcool. As técnicas utilizadas para coleta de dados foram: observação e entrevista em profundidade, baseada modelo Calgary de Avaliação da Família, para obtenção de informações que permitissem a avaliação dos componentes estrutural, de desenvolvimento e funcional das famílias, além da construção do genograma e do ecomapa familiar. A análise dos dados foi realizada empregando-se a análise temática do tipo indutiva. Foram elaborados três temas: na internalidade da família: fragilidade e conflitos; entre nós: limites, responsabilidades e esperança; e decisão pela bebida: diversão permeada por riscos. O primeiro tema aborda as fragilidades das famílias, como as relações interpessoais conflituosas, o padrão de comunicação intrafamiliar, a experiência de separação e as perdas, e os conflitos vividos entre seus componentes. O segundo tema trata da interação entre os componentes da família, caracterizada pela desestruturação, envolvendo o consumo abusivo de bebidas alcoólicas pelos familiares e desrespeito, marcando os limites de atuação da família que contribuíram para que os adolescentes se aproximassem das bebidas alcoólicas. Mesmo assim, a família não se eximiu de sua responsabilidade para com seus membros, bem como manteve a esperança, nutrida pelas aspirações e religião dos seus membros. Por fim, a decisão pela bebida retrata o contexto do consumo de álcool e as motivações para esse consumo. Os adolescentes apontaram como motivos o prazer e a diversão, sem ignorar os prejuízos do uso abusivo da bebida alcoólica. A diversão associou-se a músicas que se aproximavam do contexto de vida dos adolescentes, incentivando o consumo de bebidas e funcionando como escape dos problemas familiares. Concluiu-se que, tanto a família quanto o contexto sociocultural de inserção dos adolescentes podem influenciar, ao mesmo tempo, de forma positiva e negativa o uso e o abuso de álcool. A estrutura e composição da família, o padrão de interação familiar, a comunicação entre seus membros, a religião e a esperança são componentes que ser articulam diretamente com a prática do consumo de álcool pelos adolescentes e podem ser alvo de intervenção na enfermagem. / Although the risk factors for drugs consumption are well known, little is known so far about the dynamics and organization of families of adolescents who consume alcohol, as well as about their interrelations with the community. In the attempt to understand them, this research aimed to analyze and interpret the influence of the family on alcohol consumption by adolescents, based on the theoretical frameworks of symbolic interactionism and the systemic family perspective. Therefore, the place of study was the Family Health Unit Emocy Krause, located in Health District IV in Recife, Pernambuco, Brazil. The study subjects were 22 members of ten families, including eleven male and female adolescents between 14 and 19 years old who consumed alcohol and were considered index cases. The following data collection techniques were used: observation and in-depth interview, based on the Calgary Model of Family Assessment, to obtain information to assess the structural, development and functional components of the families, besides the construction of the genogram and the family ecomap. Inductive thematic analysis was used to analyze the data. Three themes were elaborated: in the familys internality: weakness and conflicts; among us: limits, responsibilities and hope and desire for the drink: diversion permeated by risks. The first theme addresses the families weaknesses, including conflicting interpersonal relations, the intra-family communication standard, the separation experience and losses, and conflicts experienced among family members. The second theme refers to the interaction among family members, characterizes by loss of structure, involving alcohol abuse by family members and disrespect, outlining family activities that contributed for adolescents to approach alcoholic beverages. Nevertheless, the family did not refuse the responsibility towards its members and kept up hope, nourished by aspirations and members religion. Finally, the decision to drink pictures the consumption context and the motivations to consume alcohol. The adolescents appointed pleasure and fun as motives, without ignoring the harm of alcohol abuse. Fun was associated with songs that approached the adolescents life context, encouraging drinking and functioning as an escape from family problems. It was concluded that both the family and the adolescents sociocultural context can influence alcohol use and abuse positively and negatively at the same time. The family structure and composition, the family interaction standard, communication among family members, religion and hope are components that directly articulate with adolescents alcohol consumption and can be targets of nursing intervention.

As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial. São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho, pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar, identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em níveis de contaminação variando de 101 a 103 células/mL, em meio de caldo de cana, em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas) para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (101 a 103 células/mL), impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação. Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação. / Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination levels varying from 101 to 103 cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production. Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis (CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of the initial inoculum size ((101 to 103 cells/mL), impairing the bioethanol fermentation, causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters, which would not be produced, depending on the contamination level.

As características do processo industrial brasileiro para a produção do bioetanol tornam as destilarias susceptíveis a presença de microrganismos contaminantes que ocasionam na queda de rendimento de produção. Dentre as etapas do processo, tem-se a fermentação alcoólica, que consiste na metabolização de açúcares pela cepa de levedura selecionada da espécie Saccharomyces cerevisiae produzindo o etanol. Nesta etapa ocorre a contaminação por leveduras do gênero Saccharomyces, leveduras não Saccharomyces e bactérias. As bactérias mais encontradas são as pertencentes ao grupo das bactérias láticas (LAB), que por utilizarem diferentes vias para metabolizar os açúcares, são classificadas em heterofermentativa obrigatória, homofermentativa obrigatória e heterofermentativa facultativa. Entre os gêneros deste grupo, os Lactobacillus são os mais comuns devido à sua habilidade em tolerar altas concentrações de etanol e açúcares, altas temperaturas e baixo pH. As espécies L. fermentum e L. plantarum foram relatadas em diversos trabalhos como entre as espécies mais encontradas contaminando esse ambiente. Os Lactobacillus contaminantes estão em constante interação com a cepa de levedura que por consequência, tem sua eficiência fermentativa reduzida. Este trabalho teve por objetivo analisar os metabólitos produzidos durante a fermentação alcoólica industrial e que podem ser utilizados pelas bactérias contaminantes, obtendo assim, condições para serem competitivas e persistentes no processo. Para isso, foram utilizadas duas linhagens, isoladas de destilaria e identificadas como L. fermentum (I3a) com metabolismo heterofermentativo obrigatório e L. plantarum (I4a) com metabolismo heterofermentativo facultativo, apresentando nas condições estudadas um metabolismo homofermentativo. Ambas as linhagens foram submetidas ao crescimento na presença do glicerol, malato e piruvato, que são metabólitos produzidos e excretados pela levedura e o manitol produzido e excretado pela bactéria heterofermentativa obrigatória. Foi observado que o metabólito manitol é uma eficiente fonte de carbono para ambas as linhagens proporcionando crescimento mesmo sem a presença de açúcares. Além disso, a combinação entre glicose, frutose, manitol e malato foi capaz de aumentar o crescimento das linhagens. Já a presença do piruvato, apresentou estímulo de crescimento para a linhagem heterofermentativa. Em relação ao consumo, as linhagens foram capazes de metabolizar o manitol, malato e piruvato, entretanto, não apresentaram consumo do glicerol. Com isso, ambas as linhagens são beneficiadas pelo metabolismo da levedura e ainda a heterofermentativa é capaz de reabsorver o manitol quando os açúcares fermentescíveis são esgotados e de disponibilizar o metabólito para uso da homofermentativa. / The characteristics of the Brazilian industrial process to produce bioethanol make the distilleries susceptible to the presence of contaminating microorganisms that cause in the fall of production yield. Among the stages of the process, we have the alcoholic fermentation, which consists in the metabolization of sugars by the yeast strain selected from the Saccharomyces cerevisiae species producing the ethanol. At this stage contamination occurs by yeasts of the genus Saccharomyces, yeasts not Saccharomyces and bacteria. The most commonly found bacteria are those belonging to the group of lactic bacteria (LAB), which, because they use different routes to metabolize sugars, are classified as obligate heterofermentative, obligate homofermentative and facultative heterofermentative. Among the genera of this group, Lactobacillus are the most common because of their ability to tolerate high concentrations of ethanol and sugars, high temperatures and low pH. The species L. fermentum and L. plantarum have been reported in several studies as among the most frequent species contaminating this environment. Lactobacillus contaminants are in constant interaction with the yeast strain which consequently has its fermentative efficiency reduced. This work aimed to analyze the metabolites produced during industrial alcoholic fermentation and that can be used by the contaminating bacteria, thus obtaining conditions to be competitive and persistent in the process. For this, two strains were used, isolated from distillery and identified as L. fermentum (I3a) with obligate heterofermentative metabolism and L. plantarum (I4a) with facultative heterofermentative metabolism, presenting a homofermentative metabolism under the conditions studied. Both strains were submitted to growth in the presence of glycerol, malate and pyruvate, which are metabolites produced and excreted by yeast and mannitol produced and excreted by the obligate heterofermentative bacterium. It was observed that the metabolite mannitol is an efficient source of carbon for both strains providing growth even without the presence of sugars. In addition, the combination of glucose, fructose, mannitol and malate was able to increase strains growth. However, the presence of pyruvate presented growth stimulus for the heterofermentative strain. In relation to consumption, the strains were able to metabolize mannitol, malate and pyruvate, however, they did not present glycerol consumption. Thus, both strains are benefited by yeast metabolism and the heterofermentative can reabsorb mannitol when the fermentable sugars are depleted and to make the metabolite available for homofermentative use.

Dentre as leveduras selvagens mais comumente encontradas na fermentação alcoólica, destaca-se o gênero Saccharomyces apresentando colônias rugosas com células dispostas em cachos (pseudohifas). Este biótipo de levedura tem sempre sido associado com problemas na indústria, ocasionando queda no rendimento fermentativo. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo realizar a caracterização genética, morfo-fisiológica e da resistência ao estresse de linhagens de Saccharomyces cerevisiae que apresentam colônias rugosas e mucosas, buscando alternativas que possam contribuir para o manejo dessas leveduras selvagens (rugosas) na fermentação alcoólica. Foram realizados testes de caracterização para crescimento invasivo, atividade killer, temperatura, pH, concentração de etanol e açúcar, presença de actidione, floculação e capacidade fermentativa, utilizando-se 22 linhagens de leveduras (11 rugosas e 11 mucosas) selecionadas previamente por seqüenciamento da região ITS do DNA ribossomal. O efeito do tratamento ácido em diferentes valores de pH sobre o crescimento de duas linhagens (52 rugosa e PE-02 mucosa) foi também avaliado, seguido do monitoramento do crescimento em meio de caldo de cana após tratamento ácido. Em seguida, testes fermentativos em meio de caldo de cana foram conduzidos em culturas puras e mista dessas linhagens. Os testes de caracterização morfofisiológica mostraram que a invasividade em meio YEPD Agar ocorreu em baixa freqüência dentre as 22 leveduras testadas; dez dentre onze leveduras rugosas apresentaram taxa de floculação expressiva, e entre as mucosas a floculação foi praticamente inexistente; nenhuma das linhagens apresentou produção de toxina killer; as linhagens com colônias rugosas apresentaram capacidade fermentativa significativamente inferior às linhagens com colônias mucosas, em sistema de batelada com ciclo único de 48 horas em meio de caldo de cana, demonstrando velocidade mais lenta de fermentação. Quanto à resistência ao estresse por temperatura, pH, etanol e concentração de açúcar, as linhagens mucosas tiveram maior resistência à acidez do meio, enquanto as linhagens rugosas foram mais resistentes às concentrações elevadas de etanol e açúcar. Nenhuma levedura foi resistente ao actidione. A análise genética, através dos loci microssatélites, revelou a presença de dois grupos principais relacionados geneticamente, sendo o primeiro ramo constituído principalmente de colônias rugosas (67%), contendo, no entanto, a linhagem PE-02, apresentando linhagens com alta taxa de floculação e tolerância às altas concentrações de açúcar e etanol; o outro grupo (com três subgrupos) compreendeu principalmente colônias mucosas, apresentando pouca resistência às situações estressantes aqui estudadas. A levedura com colônia rugosa (linhagem 52) foi bastante afetada pelo tratamento ácido em valores de pH 1,0 e 1,5, ao contrário da levedura com colônia mucosa (PE-02). A fermentação em sistema de batelada com reciclo celular e tratamento ácido conduzido em pH 1,5 teve efeito sobre o crescimento da levedura rugosa quando em cultura mista com a levedura mucosa, não resultando em prejuízo à eficiência fermentativa, quando comparada com a cultura pura da PE-02. Em cultura pura da levedura rugosa, constatou-se eficiência fermentativa por volta de 60%, confirmando o baixo desempenho destas leveduras. O conhecimento das respostas das leveduras rugosas 12 às situações estressantes pode ajudar a manejar a fermentação alcoólica para minimizar o efeito da levedura contaminante. / Among the wild yeasts more commonly found in the alcoholic fermentation, wrinkled colonies with pseudohyphal morphology belonging to Saccharomyces genus are highlighted. This yeast biotype has been associated with industrial problems, resulting in the decrease of the fermentative yield. In this context, this work aimed to perform the genetic, morphological/physiological characterization and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae strains which exhibited wrinkled and mucous colonies, searching for alternatives that could contribute to the management of these wild yeasts (wrinkled colonies) in the alcoholic fermentation. Characterization tests for invasiveness in Agar medium, killer activity, temperature, pH, ethanol and sugar concentration, actidione, flocculation and fermentative capacity were carried out with 22 strains (11 wrinkled and 11 mucous colonies), which were screened previously by the sequencing of the ITS region of the ribosomal DNA. The effect of the acid treatment using different pH values over the growth of two strains (52 wrinked and PE-02 mucous) was also evaluated, following the growth monitoring in sugar cane juice after acid treatment. Fermentative tests in sugar cane juice were carried out with pure and mixed cultures of these strains. The morphological/physiological tests showed that the invasiveness in YEPD Agar medium occurred in low frequency among the 22 strains tested; ten out of eleven wrinked yeasts exhibited expressive flocculation, and among the mucous, the flocculation was near zero; none of the strains showed killer activity; the wrinkled colonies presented lower fermentative capacity comparing to mucous colonies, in a 48- hour cycle in batch system using sugar cane juice, with slower fermentation rate. Concerning the resistance to temperature, pH, ethanol and sugar concentration, the mucous colonies were more resistant to low pH, while the wrinkled colonies were more resistant to the elevated ethanol and sugar concentrations. None of the yeasts were resistant to actidione. The genetic analysis by microsatellite loci revealed the presence of two main genetic related groups, the first branch comprised mainly of wrinkled colonies (67%), containing however the PE-02 strain, showing strains with high flocculation rate and tolerance to high concentration of sugar and ethanol; the other group (with three subgroups) comprised mainly mucous colonies, showing lower resistance to the stressing conditions here studied. The yeast with wrinkled colony (strain 52) was severely affected by the acid treatment in pH values of 1.0 and 1.5, but the same did not occur with the mucous colony (PE-02). The batch fermentation with cell recycle and acid treatment in pH 1.5 had effect over the wrinkled yeast growth when in mixed culture with the mucous yeast, and did not impair the fermentative efficiency comparing to the pure culture of PE-02. In pure culture with the wrinkled colony, a fermentative efficiency as low as 60% was observed, confirming the low performance of these yeasts. The knowledge of the response to stressful conditions exhibited by the yeasts with wrinkled colonies can help to manage the alcoholic fermentation in order to minimize the effect of the contaminant yeast.

A embalagem desempenha uma função crucial na estabilidade dos alimentos. Neste estudo avaliou-se a estabilidade microbiológica de néctar de jabuticaba e caldo de cana pasteurizados (85 ºC/30 s), acondicionados assepticamente em garrafa de polietileno de alta densidade (PEAD) incorporada com agentes inorgânicos microestruturados com Ag/ZnO. Os lotes processados foram estocados a 5 ºC na ausência de luz. Testes físico-químicos, microbiológicos e sensoriais foram conduzidos para avaliar a estabilidade e estimar o tempo de vida útil das bebidas. Médias de notas superiores a 5 (na escala hedônica de 9 pontos) e percentagens de aceitação superiores a 60% foram estabelecidas para estimar o tempo de vida de prateleira das bebidas. Os resultados dos testes físico-químicos para o néctar de jabuticaba variaram de 3,40 a 3,76 para o pH, de 11,0 a 12,5 ºBrix para sólidos solúveis totais, e de 0,52 a 0,76% (m/m) de ácido cítrico para acidez total titulável. Para o caldo de cana, os valores de pH, sólidos solúveis totais e acidez total titulável variaram de 5,10 a 5,37; 14,3 a 24,0 ºBrix e de 0,05 a 0,13%(m/m) ácido cítrico, respectivamente, durante o período do estudo. Para o néctar de jabuticaba, as contagens de mesófilos, psicrotróficos e bolores e leveduras variaram de 1 a 1,5; < 1est a 1; < 1est a 1,3 logUFC/mL respectivamente, durante o período de estocagem. Para o caldo de cana as contagens variaram de < 1est a 4,5 1est a 4,4; 1est a 4,0 logUFC/mL. O néctar de jabuticaba alcançou maior estabilidade microbiológica que o caldo de cana. As médias de notas para sabor, aparência e impressão global obtidas nos testes de escala hedônica variaram entre 6 a 7,1 para o néctar de jabuticaba e 5 e 7,7 para o caldo de cana. O néctar de jabuticaba e caldo de cana permaneceram microbiologicamente estáveis por um período de 120 e 50 dias, respectivamente. Os agentes inorgânicos microestruturados com Ag/ZnO não exerceram influência na estabilidade microbiológica dos dois produtos. / Packaging plays a crucial role in food stability. In this study, the microbiological stability of pasteurized (85 ºC/30 s) jabuticaba nectar and cane juice, aseptically packaged in high density polyethylene (HDPE) bottle treated with silver and zinc oxide (Ag/ZnO), was evaluated. All processed batches were stored at 5 ºC in the dark. Physicochemical, microbiological and sensory tests were conducted to evaluate the stability and estimate the beverage´s shelf life. Average scores greater than 5 (in the 9-point hedonic scale) and percentage of approval greater than 60% were both used as threshold values for estimating the product´s shelf life. As for the nectar, the pH ranged from 3.40 to 3.76; soluble solids from 11.0 to 12.5 ºBrix and titratable total acidity from 0.52 to 0.76% (w/w) citric acid. The pH values, total soluble solids and titratable acidity of cane juice varied from 5.10 to 5.37; 14.3 to 24.0 ºBrix and 0.05 to 0.13%(w/w) citric acid, respectively, during the storage. For nectar, counts of mesophiles, psychrotrophs and molds and yeasts ranged from 1 to 1.5; < 1est to 1; < 1est to 1.3 logCFU/mL, respectively, during the storage period. For the cane juice the counts ranged from < 1est to 4.5; <1est to 4.4; <1est to 4.0 logCFU/mL. Jabuticaba nectar achieved longer microbiological stability than cane juice. The mean scores for flavor, appearance and overall impression obtained in the nine-point hedonic scale tests ranged from 6 to 7.1 for jabuticaba nectar and 5 and 7.7 for cane juice. Nectar and cane juice remained microbiologically stable for 120 and 50 days, respectively. The Ag/ZnO microstructured inorganic agents had no influence on the microbiological stability of both products.

Durante o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae em meios contendo sacarose, a enzima invertase hidrolisa a sacarose no ambiente extracelular em glicose e frutose, as quais são posteriormente captadas pelas células por difusão facilitada. Num trabalho prévio, a localização da enzima invertase foi modificada nesta levedura, eliminando-se a forma extracelular e superexpressando-se a forma intracelular da enzima (Stambuk et al., 2009). Como resultado, a captação de sacarose por esta linhagem modificada (iSUC2) é realizada pelo co-transporte ativo com íons H+, implicando no gasto de 1 mol de ATP para cada mol de H+ extrudado pelas células para manutenção do pH intracelular. Como forma de compensar este gasto energético, espera-se que a linhagem iSUC2 desvie uma maior parte do fluxo de carbono para a geração de energia e, consequentemente, para a formação de etanol, em relação a uma linhagem selvagem. No presente trabalho, uma avaliação fisiológica quantitativa de uma linhagem com esta modificação genética foi realizada tanto em quimiostatos limitados por sacarose, como em cultivos descontínuos com sacarose como única fonte de carbono. Os dados obtidos em quimiostatos anaeróbios demonstram que na linhagem iSUC2 a enzima invertase ficou retida no ambiente intracelular e apresentou atividade absoluta total cerca de duas vezes maior que na linhagem-referência (SUC2). Além disto, verificou-se um aumento de 4% no fator de conversão de sacarose a etanol (Y ETH/S), em relação à linhagem SUC2. No entanto, como foi observado que cerca de 8 % da sacarose não foi consumida pelas células da linhagem iSUC2 durante o estado-estacionário dos quimiostatos anaeróbios, decidiu-se melhorar a capacidade do transporte ativo deste dissacarídeo nesta linhagem através de uma estratégia de engenharia evolutiva caracterizada pelo cultivo destas células em quimiostatos longos limitados por sacarose, em anaerobiose. Obteve-se assim, após cerca de 60 gerações, uma linhagem mutante (iSUC2 evoluída) com atividade de transporte de sacarose 20 vezes superior à linhagem iSUC2, sendo capaz de consumir toda a sacarose do meio de cultivo. Esta linhagem apresentou um aumento de 11% no YETH/S e uma diminuição de 27% no fator de conversão de sacarose a células (YX/S), quando comparada à linhagem-referência. A análise do transcriptoma revelou o aumento da expressão de vários genes codificadores de transportadores de hexoses, bem como genes relacionados ao metabolismo de maltose, incluindo o gene do transportador de alta-afinidade para alfa-glicosídeos AGT1, quando a linhagem iSUC2 evoluída foi comparada à linhagem iSUC2. Detectou-se que a evolução em quimiostato resultou na duplicação do gene AGT1, sem que houvesse mutação neste gene. Através da superexpressão do gene AGT1 na linhagem iSUC2, conseguiu-se gerar uma linhagem que apresentou YETH/S muito próximo ao da linhagem iSUC2 evoluída. No entanto, outros parâmetros fisiológicos, foram diferentes nestas duas linhagens, indicando que a duplicação do gene AGT1 não foi a única mutação que ocorreu durante o processo de evolução em quimiostato. Este trabalho ilustra o potencial da combinação entre engenharia metabólica e engenharia evolutiva para a obtenção de linhagens de levedura melhoradas, para aplicação na produção industrial de etanol combustível a partir de meios contendo sacarose. / When growing on sucrose-containing substrates, Saccharomyces cerevisiae secretes invertase that hydrolyses sucrose into glucose and fructose, which are subsequently assimilated by facilitated diffusion. In a previous work, the cellular location of invertase in yeast was modified, by eliminating the extracellular form of the enzyme and over-expressing the intracellular one (Stambuk et al., 2009). As a result, sucrose uptake by this modified strain (iSUC2) occurs by an active H+-sucrose symport system, in which 1 ATP needs to be used by the cells to extrude the proton co-transported. In order to compensate for this, it is expected that these cells will deviate a higher proportion of the carbon flow towards energy generation, and consequently to ethanol formation, in comparison with the wild-type phenotype (SUC2). In the present work, a quantitative physiological evaluation of the iSUC2 strain was performed in both batch and chemostat cultures. Cells from the iSUC2 strain harvested from steady-state anaerobic sucrose-limited chemostats retained all invertase intracellularly and showed a 2-fold higher total invertase activity, when compared to the SUC2 strain grown under identical conditions. Besides this, the ethanol yield on sucrose in the former cells was 4% higher than in the latter case. However, due to the high levels of residual sucrose during these cultivations with the iSUC2 strain, we attempted to improve the transport capacity in the iSUC2 strain by evolutionary engineering. After 60 generations of cultivation in an anaerobic sucrose-limited chemostat, an evolved strain was selected, which presented a 20-fold increase in the sucrose transport capacity, when compared with the parental strain (iSUC2), leading to almost no residual sucrose. During growth of this evolved strain in anaerobic sucrose-limited chemostats, the ethanol yield on sucrose was 11% higher and the biomass yield on sucrose was 27% lower, when compared with the SUC2 strain. Transcriptome analysis revealed an increase in the expression level of several hexose transporters, as well as many MAL-related genes, including the gene for the high-affinity permease AGT1. Indeed, it was verified that this gene was duplicated during the evolution experiment, but no point mutation was detected. By over-expressing the AGT1 gene in the iSUC2 strain, it was possible to attain a similar ethanol yield on sucrose, when compared to the evolved iSUC2 strain. However, several other physiological parameters were different in both strains, indicating that the AGT1 gene duplication was not the only mutation that occurred during evolution in the chemostat. To conclude, this work illustrates that the combination of metabolic and evolutionary engineering is a powerful strategy to obtain improved sucrose-fermenting yeast strains.