La mélanomagenèse est un processus complexe sous-tendu par des mécanismes cellulaires et moléculaires variés. L’ensemble de ces mécanismes moléculaires est impliqué dans les réseaux moléculaires permettant une signalisation coordonnée au sein de la cellule. De nombreuses publications montrent que les voies de signalisation MAPK et PI3K/AKT ont un rôle important dans la mélanomagenèse. NRAS et BRAF sont des oncogènes de la voie MAPK mutés respectivement dans 20% et 50% des mélanomes. PTEN est un gène suppresseur de tumeur inhibant la voie PI3K/AKT, dont la perte est souvent associée aux mutations de BRAF. Le traitement récent des mélanomes métastatiques avec les inhibiteurs spécifiques de BRAFV600E donne des résultats exceptionnels, mais ces résultats sont limités aux patients dont le mélanome est porteur de la mutation BRAFV600E, et il existe naturellement des échappements thérapeutiques, parfois lié à l’apparition de mutations NRAS. Nous avons choisi d’étudier le rôle de NRAS et de PTEN, qui sont des protéines majeures des voies MAPK et PI3K. Le but de ce travail est d’évaluer la coopération de NRAS et PTEN au cours de la mélanomagenèse. L’expression de PTEN est fréquemment altérée au cours du mélanome, mais le rôle de PTEN est mal connu. Au cours de ce travail, nous décrivons pour la première fois une mutation de NRAS concomitante à une perte de PTEN dans des prélèvements humains de mélanome et dans des lignées cellulaires humaines. Afin de comprendre l’effet de cette double mutation sur la mélanomagenèse, nous avons étudié des souris transgéniques avec expression d’une forme oncogénique de NRAS et/ou inactivation de PTEN dans le lignage mélanocytaire. L’inactivation isolée de PTEN n’a aucun effet sur la mélanomagénèse. En revanche, en association avec la mutation oncogénique de NRAS, la perte de PTEN accélère le développement des mélanomes, en réduisant le temps de latence et en provoquant l’apparition de métastases plus nombreuses en comparaison aux mélanomes présentant uniquement la mutation oncogénique de NRAS. Nous avons également démontré que la perte de PTEN induit un échappement au phénomène de sénescence. En conclusion, l’inactivation de PTEN coopère avec les mutations de NRAS pour l’initiation et la progression des mélanomes. / Melanomagenesis is a multistep process involving various cellular and molecular changes. The phospho-inositide-3-kinase (PI3K) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways have important roles in melanoma development. Treatment with BRAF inhibitors can be highly effective against metastatic melanomas, but the effects are limited to BRAFV600E patients, and resistance often develops. PTEN and NRAS, both major components of the PI3K and MAPK pathways, are potential alternative targets for melanoma therapy. The aim of this study was to evaluate the cooperation between NRAS and PTEN during melanomagenesis. PTEN expression is frequently altered in melanoma, but the role of PTEN is not yet fully understood. We found concomitant NRAS mutation and loss of PTEN in human melanoma samples and cell lines. Then, we studied transgenic mice with inactivation of PTEN and/or expression of an oncogenic form of NRAS in the melanocyte lineage. PTEN inactivation alone had no discernible effect on melanomagenesis. However, in melanomas initiated by oncogenic NRAS, inactivation of PTEN caused more rapid melanoma development and higher metastatic rate. We demonstrate that PTEN loss induces a senescence bypass. Thus, PTEN inactivation cooperated with oncogenic NRAS to promote melanoma initiation and progression

Un naevus congénital mélanocytique (CMN) est une prolifération bénigne de mélanocytes cutanés, cliniquement apparente à la naissance. On en retrouve chez approximativement 1% des nouveau-nés. Les CMN de taille large (LCMN), définis par un diamètre le plus large de plus de 20 cm, affectent environ 1 nouveau-né sur 20.000. Puisque les LCMN ont une propension à dégénérer en tumeur mélanomateuse (dans 2 à 5% des cas) et que leur grande taille apporte un contingent cellulaire abondant, ils représentent un bon modèle d’étude des étapes initiales de la mélanotumorigénèse. Nous disposions précisément de cultures primaires de mélanocytes établies à partir de vingt-sept cas de naevi congénitaux (24 de taille large et 3 de taille moyenne (MCMN)) curetés pour la plupart chez des enfants en période néonatale. La première phase de ce projet a permis d’identifier un mécanisme alternatif d’activation de l’oncogène BRAF dans deux cas de LCMN. Nous avons en effet mis en évidence dans ces deux cas de LCMN une translocation chromosomique entrainant une activation constitutive de BRAF par le biais d’une perte de son domaine auto-inhibiteur. Si des mutations activatrices de BRAF sont fréquemment rencontrées dans les tumeurs mélanocytiques, elles restent rares dans les naevi congénitaux et les mélanomes survenant dans des zones non exposées au soleil. Les translocations chromosomiques décrites ici pourraient représenter un mécanisme moléculaire récurrent d’activation de l’oncogène BRAF dans ces groupes de tumeurs mélanocytiques. La seconde phase du projet consistait à réaliser sur notre série de 27 L/MCMN des analyses caryotypiques, des analyses « mutationnelles » (pour rechercher la présence de mutations activatrices des oncogènes BRAF et NRAS) et des études d’expression différentielle. A l’inverse de ce que l’on observe dans le mélanome malin, les anomalies chromosomiques sont rares et isolées, reflétant très probablement le caractère bénin de ces lésions. La mutation BRAFV600E a été mise en évidence pour 4/27 CMN (15%), des mutations du gène NRAS pour 19/27 (70%), soit une situation en miroir de ce que l’on observe dans les CMN de petite taille (SCMN) et dans les naevi acquis bénins, confirmant les résultats obtenus par d’autres. L’étude du profil d’expression transcriptionnelle révèle des dysrégulations communes à l’ensemble des échantillons naeviques, comme une franche augmentation d’expression du transcrit de l’Ostéopontine. Le profil d’expression des échantillons de CMN BRAFV600E semble refléter une réduction de la synthèse et de la distribution de pigment et une activation de gènes impliqués dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN. Comme des altérations des mécanismes de la pigmentation peuvent générer des dommages oxydatifs au niveau de l’ADN, l’activation de la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN pourrait refléter la capacité des cellules naeviques à se protéger contre le stress cellulaire. Enfin, on observait aussi une expression élevée de gènes médiant la chimiorésistance dans différents cancers, ce qui pourrait éventuellement jouer un rôle dans l’inefficacité caractéristique et bien connue de la chimiothérapie dans le mélanome malin.

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Les mélanocytes sont des cellules productrices de mélanines, à l’origine de la teinte de la peau, des yeux et des cheveux. Elles dérivent d'une population multipotente appelée cellules de la crête neurale, qui génère entre autres également tout le système nerveux périphérique. Une prolifération accrue des précurseurs des mélanocytes durant le développement entraine chez l’homme l’apparition d’un nævus mélanocytaire congénital (NMC). Cette prolifération est due à une mutation somatique au sein d'un de ces précurseurs, dans des gènes de la voie de signalisation des MAP-Kinases, NRAS ou BRAF. Les plus grandes formes, couvrant des parties entières du corps, sont syndromiques. Ils peuvent associer des mélanocytoses, des malformations ou tumeurs cérébrales ou méningées, parfois épileptogènes, ainsi qu'un risque autour de 5% de dégénérer en mélanome, dans un des sites atteints. Durant ma thèse j’ai exploré des modèles murins où les protéines NRAS ou BRAF constitutivement actives sont exprimées très tôt au cours de l’embryogenèse, dans les cellules de la crête neurale. Les embryons mutants BrafV600E connaissent une létalité embryonnaire, probablement due à une superposition de défauts vasculaires et cérébraux. En revanche, les souris NrasG12D sont viables,présentent des mélanocytoses extracutanées dans des sites divers, ainsi qu’une hyperpigmentation cutanée, visible en postnatal. Cette hyperpigmentation est associée à une augmentation de la densité folliculaire, ainsi qu’à un dérèglement du cycle du follicule pileux. Des cultures de cellules de crête neurale murines, BrafV600E ou NrasG12D et contrôles, ont permis d’élucider sur le plan moléculaire les effets de telles mutations. / Melanocytes are the vertebrate cells that produce melanin, conferring color on skin, hair and eyes. They arise from a multipotent embryonic cell population called the neural crest, which also gives rise to the peripheral nervous system of the body and many other cell types. Abnormal proliferation of melanocyte precursors before birth can lead to human congenital melanocytic nevus (CMN). CMN are caused by prenatal somatic mutations in the NRAS or BRAF genes of the MAP-Kinase pathway, in one of these precursors. The largest CMN, covering entire segments of the body or head, are syndromic. They are sometimes associated with epileptogenic brain or meningeal malformations, tumors or melanocytosis, and they present a risk of about 5% in all these sites of becoming pediatric malignant melanoma. During my thesis, I explored mouse models expressing constitutively activated NRAS or BRAF proteins in neural crest cell lineages, from very early in embryogenesis. BrafV600E mutant embryos are embryonic lethal at mid-gestation, probably due to coinciding vascular and brain defects. In contrast, NrasG12D mice are viable, present extracutaneous melanocytosis in various sites as well as postnatal hyperpigmentation of the skin. This is associated with increased hair follicle density, and a deregulated hair cycle. Cell culture of mutant or wildtype mouse neural crest cells of both genotypes has permitted the comparison and discovery of molecular differences introduced by these mutations.

La prise en charge du mélanome métastatique a été bouleversée par les thérapies ciblées comme les inhibiteurs de RAF (RAFi) et les inhibiteurs de MEK (MEKi). Les RAFi permettent dans le mélanome BRAF V600 muté d’améliorer la survie mais leur effet est limité en monothérapie par l’hyperactivation paradoxale de la voie des MAPK dans les cellules non BRAF V600 mutée qui est responsable de l’apparition de mélanomes primitifs induits. Dans ce travail nous montrons la différence entre les modifications transcriptomiques induites par les RAFi dans des lignées cellulaires de mélanome BRAF mutées par rapport à celles induites dans des lignées non BRAF mutées ce qui a permis d’identifier des gènes potentiellement impliqués dans le développement de mélanomes induits. L’efficacité des RAFi est également limitée dans le temps par la survenue de résistances acquises. Nous montrons qu’une charge allélique mutée (CAM) de BRAF V600 élevée est potentiellement associée à une bonne réponse au traitement par RAFi et que la plasticité cellulaire induite par ZEB1 est associée à la résistance aux RAFi. Il n’existe pour le moment pas de thérapie ciblée approuvée dans le mélanome métastatique NRAS muté. Les MEKi sont limités par des résistances qui ne leur ont pas permis d’améliorer significativement la survie des patients. Nous montrons qu’une amplification de NRAS et la mutation MEK P124L sont responsables de résistance aux MEKi dans le mélanome NRAS muté. Nous avons testé le tramétinib (MEKi) en association avec d’autres thérapies ciblées dans des PDX de mélanome NRAS muté afin de mettre en évidence des combinaisons qui améliorent l’efficacité anti tumorale des MEKi dans cette indication / Targeted therapies like RAF inhibitors (RAFi) and MEK inhibitors (MEKi) have completely changed the therapeutic landscape in metastatic melanome. RAFi offer increased survival in patients with BRAF V600 mutated metastatic melanoma but they are limited in their use as single agents by an hyperactivation of the MAPK signaling pathway in non BRAF mutated cells that is responsible for the developpement of treatment induced primary melanomas. In this work we show the differences in the transcriptomic modifications induced by RAF inhibitos in BRAF mutated melanoma cell lines and NRAS mutated cell lines and we identified potential genes implicated in the development of treatment induced melanomas. The anti-tumor efficacity of RAFi is also limited by the acquired resistances that appear after several months of treatment. We show that a high BRAF V600E mutant allelic burden is potentially associated with a good response to RAFi and that ZEB1 induced cell plasticity is responsible for resistance to RAFi. No targeted therapy is approuved for NRAS mutated melanoma. Innate and acquired resistances limit the developpment of MEKi in this setting. We show that NRAS amplification and a MEK P124L mutation are responsible for resistance in NRAS melanoma. Finally, we tested five targeted therapies in combination with trametinib in NRAS mutated PDXs to identify combinations that improve the anti-tumoral effect of MEKi in this setting

This thesis is comprised of two parts. In the first part we study the influence of four frequently disputed genes on the susceptibility for developing prostate cancer, and in the second part we attempt to establish a basic understanding of the molecular genetic events in penile cancer. In a prostate cancer cohort we have investigated the relation of prostate cancer risk and single nucleotide polymorphisms (SNPs) in four different genes coding for the androgen receptor (AR), the vitamin D receptor (VDR), insulin (INS) and insulin receptor substrate 1 (IRS1). Despite strong biological indications of an involvement of these genes in prostate carcinogenesis, the results from different studies are contradictory and inconclusive. The action of the AR varies between individuals in part owing to a repetitive CAG sequence (polyglutamine) in the first exon of the AR gene. The results presented in this thesis show that in our cohort of prostate cancer patients the average number of repeats is 20.1, which is significantly (p<0.001) fewer repeats compared to healthy control individuals, where the average is 22.5 repeats. We find a 4.94 fold (p=0.00003) increased risk of developing prostate cancer associated with having short repeat lengths (≤19 repeats), compared with long repeats (≥23 repeats). In paper I we also study the TaqI polymorphism in the VDR gene, and find that it does not modify the risk of prostate cancer. In the INS gene we study the +1127 PstI polymorphism and find no overall effect on the risk of prostate cancer. However, we do find that the CC genotype is associated with low grade disease defined as having a Gleason score ≤6 (OR=1.46; p=0.018). In the IRS1 gene we study the G972R polymorphism and observe that the R allele is significantly associated with a 2.44 fold increased prostate cancer risk (p=0.010). The knowledge of molecular genetic events in penile cancer is very scarce and to date very few genes have been identified to be involved in penile carcinogenesis. We chose therefore to analyse the penile cancer samples using genome-wide high-density SNP arrays. We find major regions of frequent copy number gain in chromosome arms 3q, 5p and 8q, and slightly less frequent in 1p, 16q and 20q. The chromosomal regions of most frequent copy number losses are 3p, 4q, 11p and 13q. We suggest four candidate genes residing in these areas, the PIK3CA gene (3q26.32), the hTERT gene (5p15.33), the MYC gene (8q24.21) and the FHIT gene (3p14.2). The mutational status of the PIK3CA and PTEN genes in the PI3K/AKT pathway and the HRAS, KRAS, NRAS and BRAF genes in the RAS/MAPK pathway was assessed in the penile cancer samples. We find the PIK3CA, HRAS and KRAS genes to be mutated in 29%, 7% and 3% of the cases, respectively. All mutations are mutually exclusive. In total the PI3K/AKT and RAS/MAPK pathways were found to be activated through mutation or amplification in 64% of the cases, indicating the significance of these pathways in the aetiology of penile cancer.

Cancer is an important public health concern in the western world, responsible for around 25% of all deaths. Although improvements have been made in the diagnosis of cancer, treatment of disseminated disease is inefficient, highlighting the need for new and improved methods of diagnosis and therapy. Tumours arise when the balance between proliferation and differentiation is perturbed and result from genetic and epigenetic alterations. Due to the heterogeneity of cancer, analysis of the disease is difficult and a wide range of methods is required. In this thesis, a number of techniques are demonstrated for the analysis of genetic, epigenetic and transcriptional alterations involved in cancer, with the purpose of identifying a number of molecular signatures. Pyrosequencing proved to be a valuable tool for the analysis of both point mutations and CpG methylation. Using this method, we showed that oncogenes BRAF and NRAS, members of the Ras-Raf-MAPK pathway, were mutated in 82% of melanoma tumours and were mutually exclusive. Furthermore, tumours with BRAF mutations were more often associated with infiltrating lymphocytes, suggesting a possible target for immunotherapy. In addition, methylation of the promoter region of the DNA repair gene MGMT was studied to find a possible correlation to clinical response to chemotherapy. Results showed a higher frequency of promoter methylation in non-responders as compared to responders, providing a possible predictive role and a potential basis for individually tailored chemotherapy. Microarray technology was used for transcriptional analysis of epithelial cells, with the purpose of characterization of molecular pathways of anti-tumourigenic agents and to identify possible target genes. Normal keratinocytes and colon cancer cells were treated with the antioxidant N-acetyl L-cysteine (NAC) in a time series and gene expression profiling revealed that inhibition of proliferation and stimulation of differentiation was induced upon treatment. ID-1, a secreted protein, was proposed as a possible early mediator of NAC action. In a similar study, colon cancer cells were treated with the naturally occurring bile acid ursodeoxycholic acid (UDCA) in a time series and analysed by microarray and FACS analysis. Results suggest a chemopreventive role of UDCA by G1 arrest and inhibition of cell proliferation, possibly through the secreted protein GDF15. These investigations give further evidence as to the diversity of cancer and its underlying mechanisms. Through the application of several molecular methods, we have found a number of potential targets for cancer therapy. Follow up studies are already in progress and may hopefully lead to novel methods of treatment. / QC 20110121

<p>Cancer is an important public health concern in the western world, responsible for around 25% of all deaths. Although improvements have been made in the diagnosis of cancer, treatment of disseminated disease is inefficient, highlighting the need for new and improved methods of diagnosis and therapy. Tumours arise when the balance between proliferation and differentiation is perturbed and result from genetic and epigenetic alterations.</p><p>Due to the heterogeneity of cancer, analysis of the disease is difficult and a wide range of methods is required. In this thesis, a number of techniques are demonstrated for the analysis of genetic, epigenetic and transcriptional alterations involved in cancer, with the purpose of identifying a number of molecular signatures. Pyrosequencing proved to be a valuable tool for the analysis of both point mutations and CpG methylation. Using this method, we showed that oncogenes <i>BRAF</i> and <i>NRAS</i>, members of the Ras-Raf-MAPK pathway, were mutated in 82% of melanoma tumours and were mutually exclusive. Furthermore, tumours with <i>BRAF</i> mutations were more often associated with infiltrating lymphocytes, suggesting a possible target for immunotherapy. In addition, methylation of the promoter region of the DNA repair gene <i>MGMT</i> was studied to find a possible correlation to clinical response to chemotherapy. Results showed a higher frequency of promoter methylation in non-responders as compared to responders, providing a possible predictive role and a potential basis for individually tailored chemotherapy. Microarray technology was used for transcriptional analysis of epithelial cells, with the purpose of characterization of molecular pathways of anti-tumourigenic agents and to identify possible target genes. Normal keratinocytes and colon cancer cells were treated with the antioxidant N-acetyl L-cysteine (NAC) in a time series and gene expression profiling revealed that inhibition of proliferation and stimulation of differentiation was induced upon treatment. ID-1, a secreted protein, was proposed as a possible early mediator of NAC action. In a similar study, colon cancer cells were treated with the naturally occurring bile acid ursodeoxycholic acid (UDCA) in a time series and analysed by microarray and FACS analysis. Results suggest a chemopreventive role of UDCA by G1 arrest and inhibition of cell proliferation, possibly through the secreted protein GDF15.</p><p>These investigations give further evidence as to the diversity of cancer and its underlying mechanisms. Through the application of several molecular methods, we have found a number of potential targets for cancer therapy. Follow up studies are already in progress and may hopefully lead to novel methods of treatment.</p>

La mélanomagenèse est un processus complexe sous-tendu par des mécanismes cellulaires et moléculaires variés. L'ensemble de ces mécanismes moléculaires est impliqué dans les réseaux moléculaires permettant une signalisation coordonnée au sein de la cellule. De nombreuses publications montrent que les voies de signalisation MAPK et PI3K/AKT ont un rôle important dans la mélanomagenèse. NRAS et BRAF sont des oncogènes de la voie MAPK mutés respectivement dans 20% et 50% des mélanomes. PTEN est un gène suppresseur de tumeur inhibant la voie PI3K/AKT, dont la perte est souvent associée aux mutations de BRAF. Le traitement récent des mélanomes métastatiques avec les inhibiteurs spécifiques de BRAFV600E donne des résultats exceptionnels, mais ces résultats sont limités aux patients dont le mélanome est porteur de la mutation BRAFV600E, et il existe naturellement des échappements thérapeutiques, parfois lié à l'apparition de mutations NRAS. Nous avons choisi d'étudier le rôle de NRAS et de PTEN, qui sont des protéines majeures des voies MAPK et PI3K. Le but de ce travail est d'évaluer la coopération de NRAS et PTEN au cours de la mélanomagenèse. L'expression de PTEN est fréquemment altérée au cours du mélanome, mais le rôle de PTEN est mal connu. Au cours de ce travail, nous décrivons pour la première fois une mutation de NRAS concomitante à une perte de PTEN dans des prélèvements humains de mélanome et dans des lignées cellulaires humaines. Afin de comprendre l'effet de cette double mutation sur la mélanomagenèse, nous avons étudié des souris transgéniques avec expression d'une forme oncogénique de NRAS et/ou inactivation de PTEN dans le lignage mélanocytaire. L'inactivation isolée de PTEN n'a aucun effet sur la mélanomagénèse. En revanche, en association avec la mutation oncogénique de NRAS, la perte de PTEN accélère le développement des mélanomes, en réduisant le temps de latence et en provoquant l'apparition de métastases plus nombreuses en comparaison aux mélanomes présentant uniquement la mutation oncogénique de NRAS. Nous avons également démontré que la perte de PTEN induit un échappement au phénomène de sénescence. En conclusion, l'inactivation de PTEN coopère avec les mutations de NRAS pour l'initiation et la progression des mélanomes.

Melanoma is the deadliest form of skin cancer and one of the most difficult cancers to treat. Gene alterations identified in melanoma pointed to distinct molecular subsets of tumors with direct implications in therapeutic strategies. Activating mutations in NRAS, found in 20-30% of melanomas have been associated with aggressive clinical behavior and a poor prognosis. Nevertheless, there is lack of effective targeted therapies for NRAS mutant melanoma.Out of the few MEK inhibitors, pimasertib, a potent inhibitor of both MEK1 and MEK2 has showed promising results in NRAS mutant advanced melanoma. However, as a single agent and similar to other MEK inhibitors, it showed a limited clinical benefit due to its rather cytostatic effect and high toxicity. Our and other preliminary studies clearly indicated a stimulation of MITF (Microphthalmia associated transcription factor), the master transcription factor regulating cell growth and differentiation in the melanocyte, under MEK inhibition challenge. Thus, in a context where the tumor suppressor p53 is largely inactivated in melanoma, the stimulation of MITF may be the cause of the restraint cytotoxic effects of MEK inhibitors. Therefore, we aimed to further investigate the downstream MITF targets that can explain the resistance to the drugs.First, we showed that, MEK inhibition (by Pimasertib) led to a significant inhibition of cell proliferation but with a very limited effect on apoptosis that may be explained by the systematic MITF upregulation in all lines tested. Indeed, Mimicking MITF activation of expression by stimulating cAMP conferred resistance to MEK inhibition and interestingly up-regulated Bcl-2 expression. Further evidence was provided by the fact that, acquired resistance to MEK inhibition is associated with substantial upregulation of the anti-apoptotic signaling MITF/Bcl-2. More importantly, selective Bcl-2 inhibition by ABT-199 or Bcl-2 knock out using CRISPER/Cas9 system restores the sensitivity of NRAS mutant melanoma cells to MEK inhibition and breaks the acquired resistance.Given the known p53 regulating effect on Bcl-2, we evaluated p53 reactivation by PRIMA-1Met (APR-246) under MEK inhibition on the promotion of apoptosis in a panel of Q61NRAS mutant melanoma cells. Strikingly and similarly, this combination not only resulted in a synergistic effect to induce massive apoptosis but also broke resistance to MEK inhibitors both in cells with wild type or mutant p53 alike.In conclusion, we showed that the activation of cAMP/MITF/Bcl-2 pathway is a main anti-apoptotic mechanism associated with resistance to MEK inhibition in NRAS mutant melanoma. We propose drug combinations cotargeting MEK and other proteins regulating apoptosis -p53/Bcl-2- as a promising and clinically relevant therapeutic strategy to not only act in synergy to cause massive apoptosis but also to overcome resistance to MEK inhibitors in NRAS mutant melanoma / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished