Les cellules eucaryotes ont évolué de façon à s'assurer qu'aucun ARNm contenant des introns ne soit exporté du noyau. Néanmoins, les rétrovirus ont besoin d'exporter leur ARN non-épissé vers le cytoplasme afin de servir de matrice pour la traduction des protéines virales, ou d'être encapsidé comme ARN génomique dans les néo-virions. Différentes stratégies ont alors été mises en place par ces virus dans le but de détourner les voies d'export nucléaire cellulaires pour mener à bien l'export de leur ARN non-épissé. Le virus de la leucémie murine (MLV), l'un des premier rétrovirus de mammifère découvert, possède un génome qui, à l'inverse d'autres rétrovirus ne permet pas de coder pour des protéines accessoires pouvant aider à l'export de son ARN non-épissé. Bien que différentes séquences cis-régulatrices présentes sur l'ARN non-épissé ont été montrées comme favorisant l'export nucléaire de cet ARN, la/(les) voie(s) d'export détournée(s) par le MLV reste(nt) jusqu'alors inconnue(s).Dans les travaux présentés ici nous démontrons que le virus du MLV est capable de détourner la voie d'export cellulaire Tap pour exporter ses ARN épissé et non-épissé du noyau. Cet export permet notamment au virus d'exprimer ses protéines structurales et enzymatiques. De plus, nos résultats suggèrent également que l'export de l'ARN non-épissé du MLV est aussi possible par la voie d'export cellulaire CRM1, afin de favoriser leur encapsidation. En résumé, nos données révèlent un mode de régulation complexe, mis en place par le MLV, afin d'exporter l'ARN non-épissé et ainsi de distinguer sa destinée. / Eukaryotic cells have evolved to ensure that intron-containing mRNA do not leave the nucleus. However, retroviruses must export their intron-containing RNA in the cytoplasm to be either translated in viral proteins or packaged as genomic RNA in progeny viruses. Then, retroviruses are using different mechanisms in order to hijack cellular nuclear export pathway to export their unspliced RNA. Murine leukemia virus (MLV) is a simple retrovirus, one of the first discovered, which do not have the possibility to encode accessory proteins to help its unspliced RNA export. Although several cis-elements of the MLV unspliced RNA have been identified to regulate the cytoplasmic accumulation of this RNA, the pathway(s) hijacked by the MLV is(are) unrevealed until today. The researches present in this manuscript show that the MLV is able to hijack the cellular export pathway Tap dependant to export its spiced and unspliced RNA from the nucleus. This export leads to the expression of structural and enzymatic viral proteins. Moreover, our results suggest that the MLV can also hijack the cellular export factor CRM1 to export its unspliced RNA in order to package them. Finally, our data reveal the existence of a complex regulation mechanism use by the MLV to export and distinguish unspliced RNA regarding their destiny.

Doctor of Philosophy / Department of Plant Pathology / Richard B. Todd / Fungi can be found living in a range of environments, including soil and the ocean, and as pathogens of plants and animals. The ability of fungi to adapt to diverse and changing environments is dependent on their ability to sense and respond to an array of signals, including the presence or absence of nitrogen nutrients. Fungi can utilize a diverse array of nitrogen nutrients and do so in a regulated and preferential manner. When preferred nitrogen nutrients such as ammonium and glutamine are present (nitrogen sufficiency), genes required for the utilization of alternative nitrogen sources are not expressed. In the absence of a preferred nitrogen source (nitrogen limitation) the genes for utilization of alternative nitrogen sources are transcriptionally derepressed and can be induced by the presence of a particular nitrogen nutrient, such as nitrate or proline. In the absence of any nitrogen nutrient (nitrogen starvation) the expression of some genes is further elevated. In filamentous fungi the expression of genes required for the utilization of nitrogen nutrients is coordinated by the orthologs of the conserved Aspergillus nidulans GATA transcription factor AreA, which activates transcription of nitrogen utilization genes. AreA activity is controlled by autogenous transcriptional activation, mRNA transcript stability, regulated nucleo-cytoplasmic distribution, and interactions with NmrA, AreB and TamA. The combined effect of these regulatory mechanisms generally results in AreA being inactive during nitrogen sufficiency and active during nitrogen limitation and nitrogen starvation. However, during nitrogen sufficiency AreA remains active at the promoters of some genes, including gdhA, which encodes the key nitrogen assimilation enzyme NADP-dependent glutamate dehydrogenase. In this work we have used both classical genetics and next generation sequencing approaches to examine regulated gene expression and how AreA activity is modulated, primarily during nitrogen sufficiency. We have studied regulation of gdhA to characterize how AreA evades nitrogen metabolite repression. We identify leucine biosynthesis as being a key regulatory signal involved in gdhA expression and characterize the genes required for leucine biosynthesis. We also show that TamA regulates the gdhA promoter by direct DNA binding, which requires interaction with AreA. We have also characterized repression of AreA to identify a potential mode of NmrA corepressor action. Finally, we have characterized the AreA nuclear export signal and explored mechanisms that control regulated nuclear export of AreA.

Potato yellow dwarf virus (PYDV) is the type species of the genus nucleorhabdovirus which is typified by its nucleotropic characters of the members. The virus accomplishes its replication and morphogenesis in the nuclei of infected cells. Two strains, Constricta strain (CYDV) and Sanguinolenta strain (SYDV) have been described at the level of vector-specificity. CYDV is vectored by Agallia constricta and SYDV is transmitted by Aceratagllia sanguinolenta. The full-length genome of CYDV was sequenced. The 12,792 nt antisense genome encodes seven open reading frames in the order of, nucleocapsid protein (N), unknown protein (X), phosphoprotein (P), movement protein (Y), matrix protein (M), glycoprotein (G), and large polymerase protein (L). The features of each protein including a nuclear localization signal, isoelectric point, and transmembrane domain, were determined by predictive algorithms. The gene coding region was flanked by leader and trailer, and each ORF was separated by a conserved intergenic junction. In the intergenic junctions, the highly conserved cis-regulatory elements, polyadenylation signal, gene spacer, and transcription start site, were identified. The similarities of amino acid sequences between each cognate protein of SYDV and CYDV were higher than 80% except for X and P proteins. The protein localization and interaction assays of each CYDV protein identified strain-specific associations in comparison with those of SYDV and generated unique protein interaction and localization map compared to SYDV. Phylogenetic analysis using L protein identified that CYDV forms a clade with other leafhopper-transmitted rhabdoviruses. Protein sequence comparisons revealed that CYDV X has greater similarity to the cognate protein of Eggplant mottle disease virus than to SYDV X. The localization patterns of CYDV-N and -Y were different compared the cognate proteins of SYDV. The functional nuclear export domain of SYDV M was identified using c-terminal fragments of the Mwt(aa 211-243), MLL223AA(aa 211-243), and MKR225AA(aa 211-243). Based on the data, the functional domains M mediating membrane association, nuclear import and export were mapped for both strains and suggested a model whereby M mediates intra- and intercellular movement of PYDV nucleocapsid.

Human multiple myeloma is an incurable hematological malignancy characterized by the proliferation of plasma cells in the bone marrow. Myeloma represents approximately 20% of all blood cancers. In this research we have explored examples of both intrinsic and acquired drug resistance in myeloma. Topoisomerases are enzymes that are critical for cell division, especially in rapidly dividing cells such as are found in cancer. Topoisomerase poisons are a common group of drugs that are used to treat cancer. Topoisomerase I and II poisons used in the treatment of multiple myeloma include topotecan, mitoxantrone, doxorubicin, and etoposide In order for topoisomerase drugs to be effective, the enzyme must be in direct contact with the DNA. In chapters one and two we examined the export of topoisomerase II alpha from the nucleus as a mechanism of drug resistance. High density cells, similar to those found in the bone marrow, export topoisomerase II alpha from the nucleus to the cytoplasm, rendering the cell drug resistant. We found that blocking nuclear export using the CRM1 inhibitor ratjadone C, or CRM1 specific siRNA, could sensitize high density cells to topoisomerase drugs. Sensitization to topoisomerase inhibitors was correlated with increased topoisomerase/DNA complexes and increased DNA strand breaks. This method of sensitizing human myeloma cells suggests a new therapeutic approach to this disease. In chapter three we examined the role of the molecular transporter ABCG2 in drug resistance in multiple myeloma. We found that ABCG2 expression in myeloma cell lines increased after exposure to topotecan or doxorubicin. Myeloma patients treated with topotecan had an increase in ABCG2 mRNA and protein expression after drug treatment and at relapse. We found that expression of ABCG2 is regulated, at least in part, by promoter methylation both in cell lines and in patient plasma cells. Demethylation of the promoter increased ABCG2 mRNA and protein expression. These findings suggest that ABCG2 is expressed and functional in human myeloma cells, regulated by promoter methylation, affected by cell density, upregulated in response to chemotherapy, and may contribute to drug resistance.

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Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau. / Human papillomaviruses (HPV) are small double-stranded DNA viruses that infect the differentiating epithelium of the skin and the mucosa. HPV rely on two viral proteins, E1 and E2, to replicate and maintain their genome in the nucleus of infected cells. During replication, the E1 helicase is recruited to the origin of replication by E2 and is assembled into a double-hexamer that unwinds DNA ahead of the replication fork. E1 is comprised of a C-terminal enzymatic domain with ATPase/helicase activity, a central origin-binding domain and a N-terminal regulatory region that is required for viral DNA replication in vivo. The latter region of E1 contains a nuclear localization signal and a nuclear export signal that regulate its shuttling between the nucleus and cytoplasm. For bovine papillomavirus (BPV) E1, this shuttling was suggested to be controlled by the sumoylation of E1. In addition to the NES and NLS, the N-terminal region of E1 contains a conserved cyclin-binding motif that is required for the interaction of E1 with cyclin E/A-Cdk2. Cdk2 phosphorylation of E1 has been reported to control the nuclear export of E1 from BPV and HPV, albeit differently. In the first part of this study, we showed that although HPV E1 interacts with Ubc9, the conjugating enzyme of the sumoylation pathway, this pathway is not required for its accumulation in the nucleus. In the second part, we found that the nuclear accumulation of E1 is, instead, regulated by phosphorylation. Specifically, we found that Cdk2-dependent phosphorylation of conserved serines in the E1 N-terminal region inhibits the nuclear export of HPV E1. Furthermore, we reported that nuclear export is not essential to amplify the viral genome in differentiating keratinocytes but that it is required for its long-term maintenance in undifferentiated keratinocytes. Importantly, we found that the nuclear accumulation of E1 induces a S-phase arrest that is detrimental to cellular proliferation and that this anti-proliferative effect can be counteracted by the export of E1 from the nucleus to the cytoplasm. In the last part of this study, we showed that this arrest is dependent on the DNA- and ATP-binding activities of E1. Furthermore, we found that the cell cycle arrest induced by E1 is accompanied by the activation of a DNA damage response (DDR) dependent on the ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) pathway. However, these two events seem to be distinct since complex formation with E2 reduces the ability of E1 to induce a DDR but does not prevent cell cycle arrest. Importantly, we demonstrated that transient viral DNA replication still occurs in S-phase arrested cells, independently of the induction of a DDR and of the ATM kinase. Collectively, these data indicate that nuclear export of E1 is regulated by phosphorylation and not by sumoylation. They also revealed that nuclear export of E1 is essential for maintenance of the viral episome in keratinocytes, at least in part to limit its nuclear accumulation and prevent its detrimental effect on cellular proliferation and induction of a DDR.

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau. / Human papillomaviruses (HPV) are small double-stranded DNA viruses that infect the differentiating epithelium of the skin and the mucosa. HPV rely on two viral proteins, E1 and E2, to replicate and maintain their genome in the nucleus of infected cells. During replication, the E1 helicase is recruited to the origin of replication by E2 and is assembled into a double-hexamer that unwinds DNA ahead of the replication fork. E1 is comprised of a C-terminal enzymatic domain with ATPase/helicase activity, a central origin-binding domain and a N-terminal regulatory region that is required for viral DNA replication in vivo. The latter region of E1 contains a nuclear localization signal and a nuclear export signal that regulate its shuttling between the nucleus and cytoplasm. For bovine papillomavirus (BPV) E1, this shuttling was suggested to be controlled by the sumoylation of E1. In addition to the NES and NLS, the N-terminal region of E1 contains a conserved cyclin-binding motif that is required for the interaction of E1 with cyclin E/A-Cdk2. Cdk2 phosphorylation of E1 has been reported to control the nuclear export of E1 from BPV and HPV, albeit differently. In the first part of this study, we showed that although HPV E1 interacts with Ubc9, the conjugating enzyme of the sumoylation pathway, this pathway is not required for its accumulation in the nucleus. In the second part, we found that the nuclear accumulation of E1 is, instead, regulated by phosphorylation. Specifically, we found that Cdk2-dependent phosphorylation of conserved serines in the E1 N-terminal region inhibits the nuclear export of HPV E1. Furthermore, we reported that nuclear export is not essential to amplify the viral genome in differentiating keratinocytes but that it is required for its long-term maintenance in undifferentiated keratinocytes. Importantly, we found that the nuclear accumulation of E1 induces a S-phase arrest that is detrimental to cellular proliferation and that this anti-proliferative effect can be counteracted by the export of E1 from the nucleus to the cytoplasm. In the last part of this study, we showed that this arrest is dependent on the DNA- and ATP-binding activities of E1. Furthermore, we found that the cell cycle arrest induced by E1 is accompanied by the activation of a DNA damage response (DDR) dependent on the ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) pathway. However, these two events seem to be distinct since complex formation with E2 reduces the ability of E1 to induce a DDR but does not prevent cell cycle arrest. Importantly, we demonstrated that transient viral DNA replication still occurs in S-phase arrested cells, independently of the induction of a DDR and of the ATM kinase. Collectively, these data indicate that nuclear export of E1 is regulated by phosphorylation and not by sumoylation. They also revealed that nuclear export of E1 is essential for maintenance of the viral episome in keratinocytes, at least in part to limit its nuclear accumulation and prevent its detrimental effect on cellular proliferation and induction of a DDR.

In Tabak interagieren das Ankyrin-repeat Protein NtANK1 und der basische Leucin Zipper (bZIP)-Transkriptionsfaktor NtBZI-1. Diese Proteine sind in Auxin-vermittelter Genaktivierung und in Pathogenabwehr involviert. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der homologen Ankyrin-repeat Proteine AKR2A und AKR2B aus Arabidopsis thaliana zu untersuchen. Dazu wurde die Interaktion zwischen AKR2A/B, und den homologen bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe C getestet. Mit verschiedenen Methoden, wie Hefe- und Protoplasten-two-hybrid und BiFC ( bimolecular fluorescence complementation ) konnte eine Interaktion der Arabidopsis Proteine nicht bestätigt werden. Lokalisationsstudien von YFP-AKR2A/B-Fusionsproteinen bestätigten, dass die Proteine im Cytoplasma lokalisiert sind. Sie besitzen ein funktionsfähiges Kernexportsignal und akkumulieren nach Inhibierung des Kernexports im Kern. Zur Funktionsaufklärung wurden AKR2-RNAi Pflanzen erzeugt, die sich phänotypisch vom Wildtyp unterscheiden: sie zeigen ein verringertes Wachstum und einen reduzierten Chlorophyllgehalt, abhängig von der Ausprägung des RNAi-Effektes. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen ist zu erkennen, dass sich die Blattchloroplasten der AKR2-RNAi Pflanzen von denen des Wildtyps morphologisch unterscheiden und in ihrer Entwicklung unspezifisch beeinträchtigt sind. Eine Transkriptomanalyse der AKR2-RNAi Pflanzen zeigte, dass Gene des Endomembransystems herunterreguliert sind und viele Stress-induzierte Gene hochreguliert sind. Deshalb wurden die Pflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterzogen und übereinstimmend stellte sich heraus, dass sie anfälliger gegenüber oxidativem Stress, Infektion mit dem biotrophen Bakterium Pseudomonas syringae und Infektion mit dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea waren. Diese erhöhte Anfälligkeit kann als sekundärer Effekt aufgrund der beeinträchtigten Chloroplasten-Biogenese oder als spezifische Reaktion auf die reduzierte AKR2A/B-Proteinmenge interpretiert werden. Da AKR2A/B bereits als Importver mittler für chloroplastidäre Membranproteine beschrieben wurden (Bae et al., 2008), werden zusammenfassend mit den hier erhaltenen Daten multiple Funktionen für AKR2A und AKR2B diskutiert: Transport von Proteinen zu verschiedenen Endomembransystemen, eine Funktion im Signalaustausch zwischen Chloroplast und Kern, und eine Regulation der Transkriptionskontrolle im Kern.