Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11592_Tese_Poliana Belisário Zorzal.pdf: 3085378 bytes, checksum: 82c8305a871c75a92577604f900dff7c (MD5) Previous issue date: 2017-07-21 / Genes e proteínas são resultados de grande importância de ações de pesquisa e desenvolvimento da indústria da Biotecnologia. Sequências de ácidos nucléicos e aminoácidos têm sido estudadas para atender as necessidades humanas e lançadas no mercado pelo setor, que, ao investir grande quantidade de recursos ao longo do desenvolvimento de sequências biológicas, buscam a proteção do fruto de suas pesquisas de modo mais amplo possível, por meio de patentes. Em contraposição, o sistema de patentes prevê que, em troca do direito de excluir terceiros das atividades relacionadas ao objeto da patente, a sociedade deve receber a invenção suficientemente descrita, de modo a permitir que um técnico no assunto seja capaz de reproduzi-la, e apresentando reivindicações claras e fundamentadas no relatório descritivo. Entretanto, devido às suas peculiaridades, a estrutura química destes compostos engloba uma linguagem biológica, cujas propriedades desconsideram o preceito do sistema de patentes de que o escopo das reivindicações deve estar confinado às estruturas exatas reveladas no relatório descritivo das patentes. Assim, a proteção para além da sequência revelada no pedido de patente, incluindo seus equivalentes funcionais e de estrutura semelhante, entretanto, não descritos no pedido de patente, é crucial. Em contraposição, no Brasil, o Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI) concede apenas uma proteção literal das sequências biológicas listadas no pedido, justificando para isso, as condições requeridas ao pedido de patente brasileiro previstas em lei. Redatores de patentes em Biotecnologia em todo o mundo têm agrupado tais moléculas por meio de características comuns em reivindicações genéricas ou de gênero, objetivando a proteção das sequências funcionalmente equivalentes a uma determinada sequência de referência, estruturalmente descrita. As estratégias de redação de reivindicações utilizadas para ampliação do escopo protegido apresentam-se como altamente heterogêneas, sem clareza e, muitas vezes equivocadas tecnicamente, o que gera como resultado, um elevado grau de incerteza quanto à proteção de sequências para além do âmbito da sequência literalmente apresentada, quando não invalidando as reivindicações. Neste contexto, o presente estudo apresenta as peculiaridades das sequências biológicas que suscitam a necessidade de uma proteção para além do escopo daquelas literalmente apresentadas no pedido de patente, em geral buscada através de reivindicações de gênero. A suficiência descritiva, como um preceito do sistema de patentes é também apresentada destacando-se o contexto atual no Brasil, tratados internacionais em propriedade intelectual, União Europeia, Estados Unidos e Índia com relação ao tema, vinculado à descrição escrita de sequências biológicas. A partir da visão aprofundada do assunto foi possível o desenvolvimento de uma análise quanto ao entendimento técnico do contexto, apresentando-se ao final, a proposição de um modelo de reivindicação de gênero tecnicamente viável para uma proteção balanceada das sequências biológicas baseado no score de similaridade, parâmetro acessível aos pesquisadores da área durante o alinhamento de sequências. A proposição de alternativas, claras, homogêneas e aplicáveis à realidade do setor é um passo primordial na proteção das sequências biológicas de maneira equilibrada entre as necessidades econômicas da indústria e o interesse público, o que, consequentemente, representará papel essencial ao estímulo da pesquisa e inovação em Biotecnologia no Brasil.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Dario Grattapaglia / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lourenco_RodrigoTristan_M.pdf: 1426914 bytes, checksum: a25b14ff0d793c6c37d821a81cdb379c (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Com o intuito de obter uma visão da estrutura e composição do genoma de Eucalyptus, sequenciou-se aleatoriamente cerca de 10.000 fragmentos de DNA genômico de Eucalyptus grandis obtidos por meio de seqüenciamento por fragmentação randômica de DNA (shotgun) de uma biblioteca genômica, totalizando mais de 3,0 Mb válidos (phred >=20), isto é, cerca de 0,5% do genoma (640 Mpb). Depois de selecionadas quanto ao tamanho e qualidade, estas seqüências foram analisadas em termos do seu conteúdo nucleotídico, presença de regiões repetitivas e número de genes. Para análise do conteúdo de bases guanidílicas e citidílicas (GC) e do conteúdo de seqüências repetitivas utilizou-se o programa RepeatMasker, o qual indicou que as 10 mil seqüências continham, em média, 40,15% de GC. Aproximadamente 1,4% das bases pertenciam a seqüências transponíveis, distribuídas em 310 elementos repetitivos interespersados, dentre os quais 299 eram retroelementos, principalmente LTRs (¿Long Terminal Repeats¿) e apenas 11 eram transposons. Também foram identificados 986 microssatélites e 1.636 seqüências de baixa complexidade. No total, cerca de 5,8% do genoma de Eucalyptus é composto por seqüências repetitivas. Para a identificação de genes putativos presentes, utilizou-se uma estratégia alternativa baseada na comparação deste banco genômico com bancos de ESTs (¿Expressed Sequence Tags¿) de Eucalyptus utilizando o programa GenESTate, nomeando os genes identificados de acordo com o resultado do ¿BLAST¿ (¿Basic Local Alignment Search Tool¿) encontrado para as ESTs. Também comparou-se todas as seqüências genômicas com o banco de dados não-redundante de proteínas do NCBI (¿National Center for Biotechnology Information¿) com o intuito de identificar outros genes. Aproximadamente 44 seqüências similares a ESTs foram identificadas, contabilizando 2% do total de pares de bases analisado. É importante ressaltar a identificação de íntrons e éxons, além de regiões promotoras, a partir desta comparação, visto que estas estruturas não podem ser identificadas em ESTs. Cerca de 166 genes foram identificados a partir da comparação de todas as seqüências com o banco de dados de proteínas do NCBI por meio do protocolo ¿blastx-nr¿. Também foram identificados genes putativos para 16 tRNAs utilizando o programa tRNAscan-SE. Este banco de dados genômicos poderá ser utilizado no âmbito do Projeto Genolytpus para guiar o processo de ancoragem do mapa genético com o mapa físico, no desenvolvimento de novos marcadores do tipo microssatélites e na identificação de regiões promotoras / Abstract: In this work we intended to obtain an overview of the structure and composition of the Eucalyptus genome by sample sequencing 10.000 genomic DNA fragments obtained from a shotgun genomic library from E. grandis, that represents 3,0 Mbp of the E. grandis genome. The reads were filtered by their quality and length (phred value >=20; length >=150) and analyzed for their nucleotide content, repetitive patterns, repetitive elements and gene content. The program RepeatMasker was used to analyze the %GC content and repetitive patterns and elements. The results indicate that on average the Eucalyptus genome is composed of 40.15% of GC. From the total of the bases sequenced approximately 1.4% were located in transposons, distributed in 310 interespersed repetitive genetic elements, among which 299 classified as retroelements, mainly LTRs. We also identified 986 microsatellites and 1636 low complexity sequences. 5.8% of the sequenced bases were located on repetitive sequences. We used an alternative approach to identify putative genes by comparing the genomic sequences with a Eucalyptus ESTs database using the GenESTate software. We attributed putative functions using a pipeline were the éxons of each gene were put togheter and compared with protein domains data banks. This procedure avoids the misleading results obtained when comparing DNA sequences with sequences deposited in GenBank. The sequences were clustered using the CAP3 software, resulting in 766 agrupamentos contíguos and 5428 singletos, the former showing an average of 1200 bp. These 766 agrupamentos contíguos were compared with more than 5,000 E. grandis ESTs from mature leaf tissue and 6,000 E. urophylla ESTs from xylem. From the 766 agrupamentos contíguos we found 44 that showed high similarity to some ESTs. The coding portion of the sequences accounted for around 2% of the total sequences. It is important to highlight that by this approach it was possible to identify íntrons and éxons, beside core promoter regions, which can¿t be identified in the ESTs. Other 166 possible genes were identified among the genomic sequences by using blastx-nr in NCBI. We also identified putative genes responsible for 16 tRNAs using the tRNAscan-SE software. These sequences are being used in the Genolyptus Project for the development of novel randomly distributed microsatellites markers, for the identification of promoter regions and will be used to assist in the development of overgo-probes to be applied in the anchoring of the genetic map to the physical ma / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Trichomonas gallinae é um protozoário flagelado que parasita o trato digestivo superior de várias aves, incluindo pombos domésticos, frangos e perus. O estudo dos mecanismos de patogenicidade deste parasito é de fundamental importância, uma vez que a infecção causada pelo mesmo tem envolvido grandes perdas econômicas. Sabe-se que além da função energética, o ATP desempenha inúmeras funções fisiológicas, como sinalização extracelular e mecanismos citolíticos. As concentrações dos nucleotídeos, tais como ATP e ADP, no meio extracelular são controladas por um grupo de enzimas denominadas ectonuncleotidases. Fazem parte deste grupo as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5´- nucleotidase, as quais participam do controle dos níveis extracelulares dos nucleotídeos e nucleosídeos. A presença dessas atividades enzimáticas pode estar associada com a virulência e evasão dos parasitos, servindo como um mecanismo de escape dos efeitos citolíticos do ATP. Portanto, este estudo teve como objetivo caracterizar as atividades da NTPDase e 5´-nucleotidase, envolvidas na degradação dos nucleotídeos extracelulares em T. gallinae. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi ativada na presença de cátions divalentes e a adição de quelantes de cátions no meio de incubação reduziu significativamente a atividade específica da NTPDase e 5´-nucleotidase. As enzimas apresentaram ampla especificidade de substrato, observada através da hidrólise de outros nucleotídeos trifosfatados, difosfatados e monofosfatados, quando adicionados ao meio como substrato. O KM para o ATP foi de 65,62 ± 15,55 μM e para o ADP foi de 122,66 ± 3,51 μM. A Vmax para o ATP e o ADP foi de 0,20 ± 0,03 e 0,70 ± 0,09 nmolPi/min/106 trofozoítos, respectivamente. Para o AMP, o KM foi 466 ± 57 μM, com uma Vmax de 3,70 ± 0,59 nmolPi/min/106 trofozoítos. A influência de outras enzimas que hidrolisam nucleotídeos extracelulares foi descartada através do uso de inibidores específicos. A hidrólise do ATP, ADP e AMP indicou a presença de uma cadeia enzimática na superfície do parasito, composta por uma NTPDase e uma ecto-5’-nucleotidase. A presença de atividades enzimáticas capazes de hidrolisar nucleotídeos extracelulares pode representar um mecanismo de sobrevivência dos parasitos nos seus ambientes naturais. A compreensão dos processos bioquímicos extracelulares destes parasitos pode ampliar o conhecimento a respeito dos mecanismos envolvidos no parasitismo. / Trichomonas gallinae is a flagellated protozoan which parasitizes a variety of birds all over the world, including domestic pigeons, chickens and turkeys. The study of patogenicity mechanisms is relevant, since the infection caused by this parasite involves significant economic loss. Besides the energetic function, extracellular ATP plays several physiological functions, such as extracellular signaling and cytolysis. Extracellular nucleotide levels are controlled by group of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes the NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and an ecto-5´-nucleotidase, which participates in the control of extracellular nucleotide and nucleoside levels. The presence of these enzyme activities could be associated with the virulence and evasion of the parasites, escaping from the cytolytic effects of ATP. Therefore, the aim of this study was to characterize the NTPDase and 5´-nucleotidase activities, involved in extracellular nucleotide degradation in T. gallinae. ATP, ADP and AMP hydrolysis were activated in the presence of divalent cations and the addition of cation chelating agents in the incubation medium significantly decreased the specific activity of NTPDase and 5´-nucleotidase. The enzymes presented broad substrate specificity because others triphosphate, diphosphate and monophosphate nucleotides were also hydrolysed when they were added to the mixture as substrates. The KM value for ATP was 65.62 ± 15.55 μM and for ADP was 122.66 ± 3.51 μM. The Vmax values for ATP and ADP were 0.20 ± 0.03 and 0.70 ± 0.09 nmolPi/min/106 trichomonads, respectively. For AMP, KM was 466 ± 57 μM, with the Vmax value of 3.70 ± 0.59 nmolPi/min/106 trichomonads. The influence of other enzymes able to hydrolyze extracellular nucleotides was tested through the use of specific inhibitors. ATP, ADP and AMP hydrolysis indicated the presence of an enzyme chain in the surface of the parasite, composed by an NTPDase and an ecto-5´-nucleotidase. The presence of enzyme activities able to hydrolyze extracellular nucleotides can represent a survival mechanism of the parasites in their natural environments. The study of extracellular biochemical processes of these parasites can improve the knowledge related to the mechanisms involved in the parasitism.

Trichomonas gallinae é um protozoário flagelado que parasita o trato digestivo superior de várias aves, incluindo pombos domésticos, frangos e perus. O estudo dos mecanismos de patogenicidade deste parasito é de fundamental importância, uma vez que a infecção causada pelo mesmo tem envolvido grandes perdas econômicas. Sabe-se que além da função energética, o ATP desempenha inúmeras funções fisiológicas, como sinalização extracelular e mecanismos citolíticos. As concentrações dos nucleotídeos, tais como ATP e ADP, no meio extracelular são controladas por um grupo de enzimas denominadas ectonuncleotidases. Fazem parte deste grupo as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5´- nucleotidase, as quais participam do controle dos níveis extracelulares dos nucleotídeos e nucleosídeos. A presença dessas atividades enzimáticas pode estar associada com a virulência e evasão dos parasitos, servindo como um mecanismo de escape dos efeitos citolíticos do ATP. Portanto, este estudo teve como objetivo caracterizar as atividades da NTPDase e 5´-nucleotidase, envolvidas na degradação dos nucleotídeos extracelulares em T. gallinae. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi ativada na presença de cátions divalentes e a adição de quelantes de cátions no meio de incubação reduziu significativamente a atividade específica da NTPDase e 5´-nucleotidase. As enzimas apresentaram ampla especificidade de substrato, observada através da hidrólise de outros nucleotídeos trifosfatados, difosfatados e monofosfatados, quando adicionados ao meio como substrato. O KM para o ATP foi de 65,62 ± 15,55 μM e para o ADP foi de 122,66 ± 3,51 μM. A Vmax para o ATP e o ADP foi de 0,20 ± 0,03 e 0,70 ± 0,09 nmolPi/min/106 trofozoítos, respectivamente. Para o AMP, o KM foi 466 ± 57 μM, com uma Vmax de 3,70 ± 0,59 nmolPi/min/106 trofozoítos. A influência de outras enzimas que hidrolisam nucleotídeos extracelulares foi descartada através do uso de inibidores específicos. A hidrólise do ATP, ADP e AMP indicou a presença de uma cadeia enzimática na superfície do parasito, composta por uma NTPDase e uma ecto-5’-nucleotidase. A presença de atividades enzimáticas capazes de hidrolisar nucleotídeos extracelulares pode representar um mecanismo de sobrevivência dos parasitos nos seus ambientes naturais. A compreensão dos processos bioquímicos extracelulares destes parasitos pode ampliar o conhecimento a respeito dos mecanismos envolvidos no parasitismo. / Trichomonas gallinae is a flagellated protozoan which parasitizes a variety of birds all over the world, including domestic pigeons, chickens and turkeys. The study of patogenicity mechanisms is relevant, since the infection caused by this parasite involves significant economic loss. Besides the energetic function, extracellular ATP plays several physiological functions, such as extracellular signaling and cytolysis. Extracellular nucleotide levels are controlled by group of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes the NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and an ecto-5´-nucleotidase, which participates in the control of extracellular nucleotide and nucleoside levels. The presence of these enzyme activities could be associated with the virulence and evasion of the parasites, escaping from the cytolytic effects of ATP. Therefore, the aim of this study was to characterize the NTPDase and 5´-nucleotidase activities, involved in extracellular nucleotide degradation in T. gallinae. ATP, ADP and AMP hydrolysis were activated in the presence of divalent cations and the addition of cation chelating agents in the incubation medium significantly decreased the specific activity of NTPDase and 5´-nucleotidase. The enzymes presented broad substrate specificity because others triphosphate, diphosphate and monophosphate nucleotides were also hydrolysed when they were added to the mixture as substrates. The KM value for ATP was 65.62 ± 15.55 μM and for ADP was 122.66 ± 3.51 μM. The Vmax values for ATP and ADP were 0.20 ± 0.03 and 0.70 ± 0.09 nmolPi/min/106 trichomonads, respectively. For AMP, KM was 466 ± 57 μM, with the Vmax value of 3.70 ± 0.59 nmolPi/min/106 trichomonads. The influence of other enzymes able to hydrolyze extracellular nucleotides was tested through the use of specific inhibitors. ATP, ADP and AMP hydrolysis indicated the presence of an enzyme chain in the surface of the parasite, composed by an NTPDase and an ecto-5´-nucleotidase. The presence of enzyme activities able to hydrolyze extracellular nucleotides can represent a survival mechanism of the parasites in their natural environments. The study of extracellular biochemical processes of these parasites can improve the knowledge related to the mechanisms involved in the parasitism.

BRITO, T. S. Atividade vasorrelaxante do 2-nitro-1-fenil-1-propanol em preparações vasculares isoladas de ratos. 2015. 108 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2015-11-05T13:50:43Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_tsbrito.pdf: 2302175 bytes, checksum: 7172b4cc84d7726d7a04784392130264 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2015-11-05T13:50:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_tsbrito.pdf: 2302175 bytes, checksum: 7172b4cc84d7726d7a04784392130264 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-05T13:50:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_tsbrito.pdf: 2302175 bytes, checksum: 7172b4cc84d7726d7a04784392130264 (MD5) Previous issue date: 2015-09-01 / 2-Nitro-1-phenyl-1-propanol (NPP) is a nitro-alcohol used as a chemical intermediate in the synthesis of ephedrine and norephedrine, sympathomimetic agonists. Its chemical structure resembles the norephedrine, with replacement of the NH2 group by NO2. The presence of the nitro group led us to consider that this compound is able of produce vasodilatory effect, since it was demonstrated in a previous study the vasodilator actions of the nitro compound 1-nitro-2-phenylethane, resulting from stimulation of the guanylate cyclase-cGMP pathway. Our aim was to characterize the effect of on rat isolated vessels. Isometric contractions of isolated rings of thoracic aorta or 2nd-3rd generation branchs mesenteric artery of Wistar rats were recorded by data acquisition system. Cyclic nucleotide levels were measured by ELISA. Signals of strength and calcium fluorescence were simultaneously captured in confocal microscope connected to the data acquisition system. On isolated aorta with intact endothelium, NPP relaxed preparations contracted with phenylephrine (1 µM), K+ (60 mM) or U-46619 (0.3 µM) with EC50 of 30.2 [25.5 - 35.7], 31.8 [27.1 - 37.3] and 28.5 [23.1 - 35.2] µM, respectively. Conversely, in mesenteric vessels, NPP relaxed preparations contracted with phenylephrine (10 µM), K+ (60 mM) or U-46619 (1 µM) with EC50 of 0.41 [0.31 - 0.55], 0.16 [0.10 - 0.24] and 15.1 [10.4 - 24.4] µM, respectively, showing higher potency of NPP in these tissues. The extracellular K+ concentration increase produced gradual decrease in the relaxant effect of the NPP in mesenteric vessels. Pre-treatment with TEA had no effect in the relaxant effect of NPP in aortic rings, however, pretreated mesenteric vessels with TEA, BaCl2, CsCl ou apamin responded less to NPP. Pre-treatment with indomethacin, glybenclamide, 4-aminopyridine or L-NAME did not affect the vasorelaxant effect of the NPP in either aorta or mesenteric vessels. However, its potency was significantly reduced by ODQ (guanylate cyclase inhibitor), MDL-12,330A (adenylate cyclase inhibitor), H-89 (PKA inhibitor) or bisindolylmaleimide IV (PKC inhibitor) pre-treatment. NPP inhibited the vasoconstriction induced by Ca2+ in aorta pre-contracted with phenylephrine or K+, an effect prevented by pretreatment with ODQ or MDL-12,330A. Furthermore, NPP showed a tendency to increase the levels of cAMP and cGMP in aortic rings. The vasorelaxant activity of the NPP was higher in the presence of Y-27632, a Rho- kinase inhibitor. In mesenteric vessels, NPP inhibited both the strength and the calcium fluorescence intensity, indicating that this compound is able to decrease the cytosolic concentration of this ion. So, NPP has vasodilatory action with higher potency in mesenteric vessels. The mechanisms involved in it effect appear to involve the participation of cyclic nucleotides, the control of Ca2+ influx and the regulation of sensitivity of contractile filaments to Ca2+. Moreover, evidences support that the opening of potassium channels is involved in it effect in mesenteric vessels, but not in aortic. / 2-Nitro-1-fenil-1-propanol (NFP) é um nitro-álcool utilizado como intermediário químico na síntese de norefedrina e efedrina, agonistas simpatomiméticos. Sua estrutura química assemelha-se com a da norefedrina, com substituição do grupo NH2 pelo NO2. A presença do grupo nitro nos levou a hipótese deste composto ser capaz de produzir efeito vasodilatador, visto que foi demonstrada em estudo prévio a ação vasodilatadora do nitrocomposto 1-nitro-2-feniletano, resultante da estimulação da via guanilil ciclase-GMPc. Assim, nosso objetivo foi caracterizar o efeito do NFP em preparações vasculares isoladas de ratos. Contrações isométricas de anéis isolados da aorta torácica ou de ramos de 2ª-3ª geração da artéria mesentérica de ratos Wistar com ou sem endotélio funcional foram registradas por sistema de aquisição de dados. Níveis de nucleotídeos cíclicos foram medidos por ELISA. Sinais de fluorescência ao Ca2+ e de força foram capturados simultaneamente em microscópio confocal acoplado a sistema de aquisição de dados. Em anéis de aorta isolada com endotélio intacto, NFP relaxou preparações contraídas com fenilefrina (1 µM), K+ (60 mM) ou U-46619 (0,3 µM) com CE50 de 30,2 [25,5 - 35,7], 31,8 [27,1-37,3] e 28,5 [23,1-35,2] µM, respectivamente. Por outro lado, em vasos mesentéricos, NFP relaxou as preparações contraídas com fenilefrina (10 µM), K+ (60 mM) ou U-46619 (1 µM) com CE50 de 0,41 [0,31-0,55], 0,16 [0,10-0,24] e 15,1 [10,4-24,4] µM, respectivamente, indicando maior potência do NFP nesses tecidos. O aumento da concentração extracelular de K+ produziu diminuição gradual do efeito relaxante do NFP em vasos mesentéricos. O pré-tratamento com TEA não afetou o efeito relaxante do NFP em anéis de aorta, contudo, vasos mesentéricos pré-tratados com TEA, BaCl2, CsCl ou apamina responderam menos ao NFP. Pré-tratamento com indometacina, glibenclamida, 4-aminopiridina ou L-NAME não alterou seu efeito relaxante em ambas as preparações. Em contrapartida, sua potência foi significativamente reduzida pelo tratamento prévio com ODQ (inibitor de guanilil ciclase), MDL 12,330A (inibitor de adenilil ciclase), H-89 (inibitor de PKA) ou bisindolilmaleimida IV (inibitor de PKC). NFP inibiu a vasoconstrição induzida por Ca2+ em aorta pré-contraída com fenilefrina ou K+, efeito prevenido pelo pré-tratamento com ODQ ou MDL-12,330A. Além disso, NFP apresentou uma tendência para o aumento dos níveis de GMPc e AMPc em anéis de aorta. A atividade vasorrelaxante do NFP foi maior na presença do Y-27632, inibidor de Rho-cinase. Em vasos mesentéricos, NFP inibiu simultaneamente a força e a intensidade de fluorescência ao Ca2+, indicando que este composto é capaz de diminuir a concentração citossólica deste íon. Portanto, NFP possui ação vasodilatadora de maior potência em vasos mesentéricos. Os mecanismos envolvidos em seu efeito parecem envolver a participação dos nucleotídeos cíclicos, o controle do influxo de Ca2+ e a regulação da sensibilidade dos filamentos contráteis ao Ca2+ e o controle do influxo de Ca2+. Além disso, evidências apontam que a abertura de canais para potássio parece estar envolvida no seu efeito em vasos mesentéricos, mas não em aórticos.

Trichomonas gallinae é um protozoário flagelado que parasita o trato digestivo superior de várias aves, incluindo pombos domésticos, frangos e perus. O estudo dos mecanismos de patogenicidade deste parasito é de fundamental importância, uma vez que a infecção causada pelo mesmo tem envolvido grandes perdas econômicas. Sabe-se que além da função energética, o ATP desempenha inúmeras funções fisiológicas, como sinalização extracelular e mecanismos citolíticos. As concentrações dos nucleotídeos, tais como ATP e ADP, no meio extracelular são controladas por um grupo de enzimas denominadas ectonuncleotidases. Fazem parte deste grupo as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5´- nucleotidase, as quais participam do controle dos níveis extracelulares dos nucleotídeos e nucleosídeos. A presença dessas atividades enzimáticas pode estar associada com a virulência e evasão dos parasitos, servindo como um mecanismo de escape dos efeitos citolíticos do ATP. Portanto, este estudo teve como objetivo caracterizar as atividades da NTPDase e 5´-nucleotidase, envolvidas na degradação dos nucleotídeos extracelulares em T. gallinae. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi ativada na presença de cátions divalentes e a adição de quelantes de cátions no meio de incubação reduziu significativamente a atividade específica da NTPDase e 5´-nucleotidase. As enzimas apresentaram ampla especificidade de substrato, observada através da hidrólise de outros nucleotídeos trifosfatados, difosfatados e monofosfatados, quando adicionados ao meio como substrato. O KM para o ATP foi de 65,62 ± 15,55 μM e para o ADP foi de 122,66 ± 3,51 μM. A Vmax para o ATP e o ADP foi de 0,20 ± 0,03 e 0,70 ± 0,09 nmolPi/min/106 trofozoítos, respectivamente. Para o AMP, o KM foi 466 ± 57 μM, com uma Vmax de 3,70 ± 0,59 nmolPi/min/106 trofozoítos. A influência de outras enzimas que hidrolisam nucleotídeos extracelulares foi descartada através do uso de inibidores específicos. A hidrólise do ATP, ADP e AMP indicou a presença de uma cadeia enzimática na superfície do parasito, composta por uma NTPDase e uma ecto-5’-nucleotidase. A presença de atividades enzimáticas capazes de hidrolisar nucleotídeos extracelulares pode representar um mecanismo de sobrevivência dos parasitos nos seus ambientes naturais. A compreensão dos processos bioquímicos extracelulares destes parasitos pode ampliar o conhecimento a respeito dos mecanismos envolvidos no parasitismo. / Trichomonas gallinae is a flagellated protozoan which parasitizes a variety of birds all over the world, including domestic pigeons, chickens and turkeys. The study of patogenicity mechanisms is relevant, since the infection caused by this parasite involves significant economic loss. Besides the energetic function, extracellular ATP plays several physiological functions, such as extracellular signaling and cytolysis. Extracellular nucleotide levels are controlled by group of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes the NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and an ecto-5´-nucleotidase, which participates in the control of extracellular nucleotide and nucleoside levels. The presence of these enzyme activities could be associated with the virulence and evasion of the parasites, escaping from the cytolytic effects of ATP. Therefore, the aim of this study was to characterize the NTPDase and 5´-nucleotidase activities, involved in extracellular nucleotide degradation in T. gallinae. ATP, ADP and AMP hydrolysis were activated in the presence of divalent cations and the addition of cation chelating agents in the incubation medium significantly decreased the specific activity of NTPDase and 5´-nucleotidase. The enzymes presented broad substrate specificity because others triphosphate, diphosphate and monophosphate nucleotides were also hydrolysed when they were added to the mixture as substrates. The KM value for ATP was 65.62 ± 15.55 μM and for ADP was 122.66 ± 3.51 μM. The Vmax values for ATP and ADP were 0.20 ± 0.03 and 0.70 ± 0.09 nmolPi/min/106 trichomonads, respectively. For AMP, KM was 466 ± 57 μM, with the Vmax value of 3.70 ± 0.59 nmolPi/min/106 trichomonads. The influence of other enzymes able to hydrolyze extracellular nucleotides was tested through the use of specific inhibitors. ATP, ADP and AMP hydrolysis indicated the presence of an enzyme chain in the surface of the parasite, composed by an NTPDase and an ecto-5´-nucleotidase. The presence of enzyme activities able to hydrolyze extracellular nucleotides can represent a survival mechanism of the parasites in their natural environments. The study of extracellular biochemical processes of these parasites can improve the knowledge related to the mechanisms involved in the parasitism.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431159-Texto+Completo-0.pdf: 8354772 bytes, checksum: 8abf5160038abef327a3d35aa522175e (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis is a chronic infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis that requires urgent new efforts towards its treatment and cure face the emergence of drug-resistant strains, its world spreading, the increasing number of infected patients among immune compromised populations, and the large number of latent infected individuals that are reservoir to the disease. Nucleotides metabolism pathways provide promising molecular targets for the development of novel drugs against active tuberculosis and might also target its latent forms. The orotate phosphoribosyltransferase (OPRT) enzyme of the de novo pyrimidine synthesis pathway catalyzes the reversible phosphoribosyl transfer from 5'-phospho-α-D-ribose 1'-diphosphate (PRPP) to orotic acid (OA), forming orotidine 5’-monophosphate (OMP), precursor of remaining pyrimidine nucleotides. This work describes cloning, amplification and characterization of M. tuberculosis H37Rv pyrE gene as encoding a functional OPRT, its apparent and true kinetic constants for forward and reverse reactions, product inhibition profile, and kinetic mechanism assignment as Mono-Iso Ordered Bi Bi, not previously described for an enzyme member of type I phosphoribosyltransferase family. Thermodynamic constants and discrimination profile allowed natural enzyme’s substrates binding patterns identification. Characterization of the reaction catalyzed by mycobacterial OPRT is essential to structure-based drug development, aiming to advance towards tuberculosis control. Resulting data from enzyme’s characterization were the starting point for OPRT specific inhibitors planning, selection and testing.A starting compound was identified as promising lead molecule, with values in nanomolar range, and was further submitted to several chemical replacement experiments, leading to a derived molecule with lower inhibitory constants and improved thermodynamic discrimination profile. Both compounds identified were characterized as competitive and uncompetitive inhibitors towards OPRT substrates OA and PRPP, respectively. Advantage of M. tuberculosis unique kinetic mechanism among homologues OPRTs was taken in order to plan a specific molecule that might trap the enzyme in a noncatalytic ternary complex E ∙ PRPP ∙ I, both inhibiting pyrimidine synthesis and sequestering PRPP from cellular pool, thereby affecting other metabolic pathways. M. tuberculosis OPRT characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for tuberculosis treatment and prophylaxis. Results from this work are believed to enhance the understanding of mycobacterial nucleotide metabolism and provide pertinent data to advance towards specific molecular targets inhibitors development, aiming tuberculosis control. / A tuberculose é uma doença infecciosa crônica, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, e requer novas iniciativas urgentes para o seu tratamento e cura em decorrência do surgimento de cepas resistentes a drogas, sua abrangência global, e o significativo aumento de pessoas infectadas entre pacientes imunodeprimidos; além do grande número de pessoas infectadas com a forma latente da tuberculose, que atuam como reservatório da doença. As enzimas que constituem as vias de metabolismo de nucleotídeos são alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da tuberculose, tanto na sua forma ativa quanto latente. A enzima orotato fosforibosiltransferase (OPRT), pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, catalisa a transferência reversível do grupamento fosforibosil da molécula de 5’-fosfo-α-Dribose 1’-difosfato (PRPP) para o ácido orótico (OA), formando orotidina 5’- monofosfato (OMP), molécula precursora dos demais nucleotídeo de pirimidina. Este trabalho descreve a clonagem, amplificação e caracterização do produto do gene pyrE de M. tuberculosis H37Rv como uma enzima OPRT funcional; a determinação de suas constantes cinéticas aparentes e verdadeiras para as reações direta e inversa; ensaio de inibição pelos produtos; e a determinação do mecanismo cinético da reação como sendo Mono-Iso Ordenado Bi Bi, mecanismo que até então não havia sido descrito para uma enzima pertencente à família das fosforibosiltransferases do tipo I. As constantes termodinâmicas e o perfil de discriminação termodinâmica permitiram a identificação dos modos de interação dos substratos naturais da enzima com seu sítio de ligação.A caracterização da reação catalisada pela enzima OPRT micobacteriana é uma etapa essencial para o desenvolvimento de novas drogas de ação específica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados resultantes da caracterização da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, seleção e teste de inibidores seletivos contra a OPRT de M. tuberculosis. Um composto inicial, com valores de na faixa de concentração de nanomolar, foi identificado como potencial composto líder, sendo submetido a diferentes protocolos de derivatizaçao química, permitindo a obtenção de uma molécula derivada com valores de constantes inibitórias e perfil de discriminação termodinâmica aprimorados. Estes dois compostos foram caracterizados como inibidores competitivos e incompetitivos em relação aos substratos naturais da OPRT, OA e PRPP, respectivamente; onde o conhecimento do singular mecanismo cinético de reação da enzima de M. tuberculosis foi utilizado para o planejamento de moléculas capazes de formar um complexo ternário não catalítico (E ∙ PRPP ∙ I), inibindo a síntese de nucleotídeos de pirimidina e sequestrando moléculas de PRPP do meio celular, afetando ainda, outros processos metabólicos essenciais. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreensão do metabolismo de nucleotídeos de micobactérias e fornecem informações relevantes para o avanço do desenvolvimento de inibidores de ação seletiva sobre alvos moleculares específicos para o tratamento e profilaxia da tuberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000407067-Texto+Completo-0.pdf: 3459051 bytes, checksum: d1b647d03a940c703ad0b5b801bad1d2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains the leading cause of mortality due to a bacterial pathogen. The proliferation rate of multidrugand extensively drug-resistant strains of M. tuberculosis is increasing worldwide. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism to identify promising targets for the development of new anti-TB agents. In bacteria, pyrimidine nucleotide interconversion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. The gene (cmk, Rv1712) encoding cytidine monophosphate kinase (CMK) enzyme has been proposed by sequence homology to be present in the genome of M. tuberculosis. Here we describe PCR amplification and cloning of cmk gene, expression and purification of its product to homogeneity, and N-terminal sequencing and mass spectrometry analyses of the recombinant protein. Results of steady-state kinetics showed that M. tuberculosis cmk gene encodes a monomeric CMK that phosphorylates preferentially CMP and dCMP, and that UMP is a poor substrate. These results reinforce the presence of a nucleoside monosphosphate kinase specific for UMP in M. tuberculosis. Double-reciprocal plots of steady-state kinetic results were consistent with ternary complex formation and sequential mechanism for M. tuberculosis CMK reaction. A plausible role for CMK in M. tuberculosis is discussed. / A tuberculose (TB), doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, é a maior causa de morte por agente infeccioso do mundo. O aumento da incidência de cepas multi-resistentes (MDR-TB) e extensivamente resistentes (XDR-TB) tem contribuído para o aumento do número de mortes. Por este motivo, há a necessidade de estudos para identificarmos, no metabolismo da micobactéria, possíveis alvos para o desenvolvimento de drogas capazes de combater estas novas cepas. Em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biosíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. O gene (cmk, Rv1712) que codifica a enzima citidina monofosfato quinase (CMK) foi descrito, por homologia de seqüência, no genoma de M. tuberculosis. Neste trabalho o gene cmk foi amplificado por PCR e clonado em vetor de expressão. A proteína CMK foi expressa em grande escala e purificada. O produto homogêneo desta purificação sofreu seqüenciamento N-terminal e espectrometria de massa. Os resultados da cinética em estado estacionário mostraram que o gene cmk de M. tuberculosis codifica a proteína monomérica CMK, que fosforila preferencialmente CMP e dCMP, e que UMP é um substrato pobre. Estes resultados reforçam a presença de uma nucleotídeo monofosfato quinase específica para UMP em M. tuberculosis. Os parâmetros cinéticos fornecidos pelo ensaio e análise dos gráficos de duplo-recíproco mostraram que a enzima forma um complexo ternário e que seu mecanismo é seqüencial. Um possível papel para a enzima CMK é discutido.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-22T16:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 228773.pdf: 1698555 bytes, checksum: 8f7c9e4e118e03ff3838cd05fbd820ee (MD5) / Um número crescente de evidências tem apontado para o neuromodulador adenosina como um importante mediador de várias respostas comportamentais, moleculares e celulares promovidas pelo etanol, tanto em humanos quanto em roedores. Contudo, relativamente pouco se sabe sobre o envolvimento deste sistema em comportamentos relacionados à ansiedade após tratamento agudo ou após a abstinência do etanol, bem como nas respostas neuroadaptativas verificadas após a exposição repetida, como o desenvolvimento de tolerância e reforço positivo do etanol, supostamente implicados na iniciação, manutenção e recaída ao consumo de etanol em modelos animais. O objetivo do presente trabalho foi investigar o papel dos receptores de adenosina no efeito tipo-ansiolítico do etanol, bem como avaliar o potencial de agonistas dos receptores de adenosina A1 e A2A em reduzir o comportamento tipo-ansiogênico observado durante a abstinência aguda (ressaca) em camundongos testados no labirinto em cruz elevado. Além disso, o envolvimento dos receptores de adenosina no desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação motora ao etanol, assim como na preferência condicionada de lugar induzida pelo etanol em camundongos, também foram investigados neste estudo. Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez, que os receptores de adenosina, principalmente os receptores A1, modulam as repostas tipo-ansiolíticas induzidas pela administração aguda de etanol (1,2 g/kg, i.p.), assim como o efeito tipo-ansiogênico (ressaca) verificado 18 h após o tratamento sistêmico com uma dose elevada de etanol (4,0 g/kg) em camundongos testados no labirinto em cruz elevado. Os presentes resultados evidenciam ainda que o bloqueio dos receptores A1 para adenosina, mas não dos receptores A2A, modula importantes neuroadaptações funcionais observadas durante a exposição repetida ao etanol, como o desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação motora em camundongos testados no rota-rod. Além disso, demonstram que o bloqueio não-seletivo dos receptores de adenosina, mediado pela cafeína, não altera o reforço positivo induzido pelo etanol em camundongos avaliados no teste da preferência condicionada de lugar. Em conjunto, estas evidências sugerem que a manipulação farmacológica do sistema adenosinérgico possui potencial para atenuar os efeitos do uso do etanol, podendo representar uma importante ferramenta no tratamento do alcoolismo. Além disso, a complexidade e diversidade dos componentes envolvidos no desenvolvimento do alcoolismo (sensibilidade inicial, tolerância, sensibilização, abstinência, desejo e recaída), requerem estudos mais detalhados e amplos para uma melhor compreensão e caracterização das bases neurobiológicas envolvidas nesta doença. Recent evidence indicates a direct role for the neuromodulator adenosine in mediating many of the cellular and behavioral responses to ethanol in both humans and rodents. The anxiolytic property of ethanol and the elevated signs of anxiety observed during withdrawal from chronic as well as acute ethanol exposure represent important motivational factors for its consumption and the development of alcohol dependence. Moreover, the tolerance mechanisms and reinforcement, can determine a person's short-term or acute response to ethanol, as well as the establishment of the long-term or chronic craving for alcohol that characterizes dependence. The aim of the present study was to evaluate the role of adenosine receptors in the anxiolytic-like effect of ethanol, as well as the potential of adenosine A1 and A2A receptor agonists in reducing the anxiety-like behavior during acute ethanol withdrawal (ressaca) in mice tested in the elevated plus-maze. Furthermore, the influence of adenosine receptors in the development of rapid tolerance to ethanol-induced motor incoordination, and the ability of the caffeine to modify ethanol-induced conditioned place preference also had been examined in mice. The results indicated that acute previous administration of "non-anxiogenic" doses of caffeine (non-selective antagonist, 10.0 mg/kg, i.p.) and DPCPX (adenosine A1 receptor antagonist, 3.0 mg/kg, i.p.), but not ZM241385 (adenosine A2A receptor antagonist, 1.0 mg/kg, i.p.), significantly reduced the anxiolytic-like effect of ethanol (1.2 g/kg, i.p.), as well as blocked the rapid tolerance to ethanol-induced motor impairment in mice. Moreover, an anxiolytic-like response was observed by the co-administration of "non-anxiolytic" doses of the selective adenosine A1 receptor agonist CCPA (0.125 mg/kg) and ethanol (0.6 g/kg). On the other hand, the acute administration of "non-anxiolytic" doses of adenosine and CCPA, but not the adenosine A2A receptor agonist DPMA, at the onset of peak withdrawal (18 h), reduced this anxiogenic-like response. In addition, the effect of CCPA on anxiety-like behavior of ethanol ressaca was reversed by pretreatment with the selective adenosine A1 receptor antagonist DPCPX. On the other hand, caffeine did not inhibit the acquisition and expression of ethanol-induced conditioned place preference. These results reinforce the involvement of adenosine in anxiety and suggest that the activation of adenosine A1 receptors, but not adenosine A2A receptors, mediate the anxiolytic-like effect and the rapid tolerance to ethanol-induced motor impairment in mice. Moreover, they indicate the potential of adenosine A1 receptor agonists to reduce the anxiogenic effects during ethanol withdrawal. Taken together, these data suggest that pharmacological manipulation of adenosine signalling represents a potentially useful tool for the prevention and treatment of alcoholism.

Durante os últimos anos, o aumento dos níveis circulantes de homocisteína (Hcy) passou a ser considerado um fator de risco independente para doenças cardiovasculares como aterosclerose, doenças vasculares periféricas, infarto do miocárdio e tromboembolismo. Essas complicações vasculares também podem estar relacionadas com os níveis extracelulares de nucleotídeos/adenosina, que modulam processos de agregação plaquetária, vasodilatação, fluxo sangüíneo coronariano e inflamação. Há estudos que sugerem uma relação entre Hcy e concentração de adenosina circulante. A hidrólise seqüencial de ATP até adenosina por ação de nucleotidases solúveis constitui um dos sistemas de degradação de nucleotídeos de adenina na circulação. Além disso, a ciclosporina (CsA), um potente imunossupressor que tem sido usado por pacientes transplantados, está associado a vários efeitos adversos. As doenças vasculares são a principal causa de morte entre pacientes transplantados, mas a relação da CsA com estas injúrias não está bem compreendida. Desta forma, objetivamos avaliar a participação da Hcy na modulação da hidrólise de nucleotídeos extracelulares de adenina em soro de ratos e ao mesmo tempo verificar os efeitos da administração de CsA sobre os níveis de Hcy total (tHcy), hidrólise de nucleotídeos de adenina e sua possível associação com doenças cardiovasculares em ratos. Nossos resultados demonstram que a Hcy inibibe a hidrólise de ATP, ADP e AMP em soro de ratos, in vitro, e as análises cinéticas indicam que esta inibição ocorre de forma acompetitiva. Também foi possível observar que ratos tratados com CsA apresentam um aumento estatístico significativo dos níveis de fibrinogênio, número de plaquetas e concentração de tHcy porém, a CsA induziu a diminuição da hidrólise de ATP, ADP e AMP e níveis de ácido úrico. A inibição da hidrólise dos nucleotídeos correlacionou negativamente com os níveis de tHcy e positivamente com os níveis de ácido úrico. Com este estudo demonstramos que o tratamento imunossupressor com CsA promove disfunções vasculares, já que favorece a formação de um estado pró-trombótico aumentando os níveis de plaquetas e fibrinogênio. Além disso, a CsA aumenta os níveis de tHcy e inibe a hidrólise de ATP, ADP e AMP, provavelmente diminuindo os níveis de adenosina circulante e seus efeitos protetores ao sistema cardiovascular. A forte correlação inversa entre níveis de tHcy e hidrólise de nucleotídeos apóiam nossos resultados in vitro e sugerem que a inibição da atividade das nucleotidases em ratos tratados com Csa seja dependente da Hcy. Os níveis diminuídos de ácido úrico circulante apontam uma relevância in vivo da inibição da hidrólise de nucleotídeos em soro. Contudo, a CsA favorece o surgimento de complicações vasculares através do aumento do número de plaquetas, dos níveis de fibrinogênio e tHcy, que por sua vez altera a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em soro, compostos envolvidos na homeostasia cardiovascular. / During the past few years, elevated blood levels of homocysteine (Hcy) have been considered an independent risk factor for cardiovascular disease such as atherosclerosis, peripheral vascular disease, myocardial infarction and venous thromboembolism. These vascular complications can be also related to the ratio adenine nucleotide/adenosine, since extracellular these nucleotides are associated with modulation of processes such as platelet aggregation, vasodilatation, coronary blood flow and inflammation. Furthermore, there are some studies that suggest a relationship between Hcy and plasma adenosine concentrations. The sequential hydrolysis of ATP to adenosine by soluble nucleotidases constitutes one of the systems for rapid inactivation of circulating adenine nucleotides. Moreover, Cyclosporine (CsA), a potent immunosuppressant agent that has been extensively used in transplanted patients, is related to a variety of side effects. Vascular disease is a major cause of morbidity and mortality among transplant recipients, but the underlying mechanisms of vascular injury caused by cyclosporine are poorly understood. Thus, the main objective of this study was to evaluate if Hcy can participate in the modulation of the extracellular adenine nucleotide hydrolysis by rat blood serum and we also examined the effects of long-term CsA administration on total homocysteine (tHcy) levels, adenine-nucleotides hydrolysis, and its putative association with vascular disease in rats. Our results showed that Hcy inhibits in vitro ATP, ADP and AMP hydrolysis in rat blood serum and kinetic analysis showed that these inhibitions are of the uncompetitive type. At the same time, we observed that CsA induced a statistically significant increase in fibrinogen levels, platelets number and tHcy concentration, whereas induced a decrease in ATP, ADP and AMP hydrolysis and uric acid levels. The inhibition of nucleotides hydrolysis correlated negatively with total homocysteine levels and positively with uric acid levels. Here, we demonstrate that CsA long-term treatment induces vascular disturbances, since it might create a favorable scenario for a pro-thrombotic state, increasing platelets and fibrinogen levels. Additionally, it increases tHcy serum concentrations and inhibits serum ATP, ADP and AMP hydrolysis, probably decreasing serum adenosine levels and therefore its beneficial effects on the cardiovascular system. In support to our in vitro studies, the strong inverse correlation between tHcy levels and adenine nucleotides hydrolysis suggests that the inhibition of nucleotidase activities could be Hcy dependent. Low levels of uric acid during CsA treatment point that the inhibition of nucleotide hydrolysis might have in vivo relevance. In summary, CsA might create a favorable scenario for vascular complications by increasing platelets, fibrinogen and serum levels of tHcy, which in turn affects the hydrolysis of serum adenine nucleotides, compounds known to be involved in cardiovascular haemostasis.