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Análise proteômica dos ovos de codorna não fertilizados em diferentes tempos e temperaturas de estocagem / Proteomic analysis of quail eggs unfertilized at different times and storage temperatures

Adriano Aquino 12 June 2015 (has links)
O uso de codornas japonesas (Coturnix coturnix japonica) como modelo animal para estudos relacionados a indústria avícola está crescente em decorrência do aumento no consumo de carne e ovos. O ovo possui várias aplicações e a sua funcionalidade está correlacionada com a composição química e, mais especificamente, com seu alto valor proteico. Contudo, o ovo é um alimento altamente perecível, pois pode perder sua qualidade rapidamente entre o período de estocagem e consumo. A qualidade do ovo pode ser afetada por condições ambientais como tempo e temperatura de estocagem. Parâmetros convencionais como pH, massa e a unidade Haugh são usados para a avaliação da qualidade do ovo. Além disso, técnicas analíticas podem ser utilizadas para a avaliação de qualidade em diversas matrizes alimentares. Assim, o presente trabalho tem como objetivos a avaliação e identificação de proteínas presentes em ovos de codorna japonesa submetidos a diferentes tempos e temperaturas de estocagem empregando técnicas eletroforéticas e espectrometria de massas, além de, ferramentas estatísticas. Durante estocagem à 0-21 dias, observou um aumento no pH, diminuição na massa do ovo e uma mudança significativa no proteoma das amostras nos períodos de 14 a 21 dias. Além disso, os resultados de análise de componentes principais (PCA) demostraram a influência da temperatura pela formação de 4 grupos independentes para amostras de albúmen e 3 grupos para as amostras de plasma e fração granular, respectivamente. Para o plasma, as amostras estocadas à 25 °C e controle se agruparam. Já para a fração granular, o agrupamento ocorreu entre as amostras estocadas a 25 °C com a 37 °C, demonstrando similaridade entre si. As proteínas com os níveis significativamente (p <0.05) alterados durante a estocagem pertencem as famílias serpina (ovalbumina), transferrina (ovotransferrina), inibidores Kazal tipo de protease (ovoinibidor). Para a ovotransferrina, proteína encontrada em todas as amostras foi observado a formação de isoformas no albúmen, plasma e fração granular nas amostras estocadas a 37 °C, sendo um bom indicador de controle de qualidade. Por fim, para as amostras de albúmen fracionadas por OFFGEL e analisadas por 1D-PAGE foi observado a formação de isoformas tanto para a ovalbumina quanto para a ovotransferrina bem como a degradação de ovoinibidor nas amostras estocadas por 21 dias a 37 °C, fatos que podem estar associados ao desbaste. Esses eventos afirmam a influência do tempo e temperatura de estocagem na qualidade do ovo de codorna. / The use of Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) as animal model for studies related to the poultry industry is becoming more common due to the increased consumption of meat and eggs. The egg has a variety of applications and its functionality is correlated to the chemical composition and, more specifically, its high protein value. However, the egg is a highly perishable food, and it can lose its quality between the period of storage and consumption. The egg quality can be affected by environmental conditions such as storage time and temperature. Conventional parameters such as pH and Haugh unit mass are used for egg quality assessment. Furthermore, analytical techniques can be used for quality assessment in various food matrices. This study aims to review and to identify proteins present in Japanese quail eggs submitted at different times and storage temperatures using electrophoretic techniques and mass spectrometry techniques, as well as statistical tools. During storage at 0-21 days, observed an increase in pH, decrease in egg mass and a significant change in the proteome of samples during the 14 to 21 day period. Moreover, the principal component analysis results (PCA) have shown the influence of temperature because of the formation of the four groups to albumin samples and three groups for the plasma and granules fraction samples, respectively. In plasma, the samples stored at 25 ° C and clustered control. As for the granule fraction pooling occurred between samples stored at 25 ° C to 37 ° C, showing similarities among them. The proteins with significant levels (p <0.05) of change during the storage belong to serpin family (albumin), transferrin (ovotransferrin), Kazal type protease inhibitors (ovoinhibitor). Ovotransferrin, a protein isoform found in albumin, plasma and granules fraction samples and was observed the formation of more isoforms in samples stored at 37 ° C, a good to quality control lost indicator. Finally, for the albumen samples that were fractionated by OFFGEL and analyzed by 1D-PAGE, the formation of both isoforms to ovalbumin was observed as well as ovotransferrin and ovoinhibitor degradation in samples stored for 21 days at 37 ° C that can be associated to thinning. These events affirm the influence of time and storage temperature on quail egg quality.
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Análise proteômica dos ovos de codorna não fertilizados em diferentes tempos e temperaturas de estocagem / Proteomic analysis of quail eggs unfertilized at different times and storage temperatures

Aquino, Adriano 12 June 2015 (has links)
O uso de codornas japonesas (Coturnix coturnix japonica) como modelo animal para estudos relacionados a indústria avícola está crescente em decorrência do aumento no consumo de carne e ovos. O ovo possui várias aplicações e a sua funcionalidade está correlacionada com a composição química e, mais especificamente, com seu alto valor proteico. Contudo, o ovo é um alimento altamente perecível, pois pode perder sua qualidade rapidamente entre o período de estocagem e consumo. A qualidade do ovo pode ser afetada por condições ambientais como tempo e temperatura de estocagem. Parâmetros convencionais como pH, massa e a unidade Haugh são usados para a avaliação da qualidade do ovo. Além disso, técnicas analíticas podem ser utilizadas para a avaliação de qualidade em diversas matrizes alimentares. Assim, o presente trabalho tem como objetivos a avaliação e identificação de proteínas presentes em ovos de codorna japonesa submetidos a diferentes tempos e temperaturas de estocagem empregando técnicas eletroforéticas e espectrometria de massas, além de, ferramentas estatísticas. Durante estocagem à 0-21 dias, observou um aumento no pH, diminuição na massa do ovo e uma mudança significativa no proteoma das amostras nos períodos de 14 a 21 dias. Além disso, os resultados de análise de componentes principais (PCA) demostraram a influência da temperatura pela formação de 4 grupos independentes para amostras de albúmen e 3 grupos para as amostras de plasma e fração granular, respectivamente. Para o plasma, as amostras estocadas à 25 °C e controle se agruparam. Já para a fração granular, o agrupamento ocorreu entre as amostras estocadas a 25 °C com a 37 °C, demonstrando similaridade entre si. As proteínas com os níveis significativamente (p <0.05) alterados durante a estocagem pertencem as famílias serpina (ovalbumina), transferrina (ovotransferrina), inibidores Kazal tipo de protease (ovoinibidor). Para a ovotransferrina, proteína encontrada em todas as amostras foi observado a formação de isoformas no albúmen, plasma e fração granular nas amostras estocadas a 37 °C, sendo um bom indicador de controle de qualidade. Por fim, para as amostras de albúmen fracionadas por OFFGEL e analisadas por 1D-PAGE foi observado a formação de isoformas tanto para a ovalbumina quanto para a ovotransferrina bem como a degradação de ovoinibidor nas amostras estocadas por 21 dias a 37 °C, fatos que podem estar associados ao desbaste. Esses eventos afirmam a influência do tempo e temperatura de estocagem na qualidade do ovo de codorna. / The use of Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) as animal model for studies related to the poultry industry is becoming more common due to the increased consumption of meat and eggs. The egg has a variety of applications and its functionality is correlated to the chemical composition and, more specifically, its high protein value. However, the egg is a highly perishable food, and it can lose its quality between the period of storage and consumption. The egg quality can be affected by environmental conditions such as storage time and temperature. Conventional parameters such as pH and Haugh unit mass are used for egg quality assessment. Furthermore, analytical techniques can be used for quality assessment in various food matrices. This study aims to review and to identify proteins present in Japanese quail eggs submitted at different times and storage temperatures using electrophoretic techniques and mass spectrometry techniques, as well as statistical tools. During storage at 0-21 days, observed an increase in pH, decrease in egg mass and a significant change in the proteome of samples during the 14 to 21 day period. Moreover, the principal component analysis results (PCA) have shown the influence of temperature because of the formation of the four groups to albumin samples and three groups for the plasma and granules fraction samples, respectively. In plasma, the samples stored at 25 ° C and clustered control. As for the granule fraction pooling occurred between samples stored at 25 ° C to 37 ° C, showing similarities among them. The proteins with significant levels (p <0.05) of change during the storage belong to serpin family (albumin), transferrin (ovotransferrin), Kazal type protease inhibitors (ovoinhibitor). Ovotransferrin, a protein isoform found in albumin, plasma and granules fraction samples and was observed the formation of more isoforms in samples stored at 37 ° C, a good to quality control lost indicator. Finally, for the albumen samples that were fractionated by OFFGEL and analyzed by 1D-PAGE, the formation of both isoforms to ovalbumin was observed as well as ovotransferrin and ovoinhibitor degradation in samples stored for 21 days at 37 ° C that can be associated to thinning. These events affirm the influence of time and storage temperature on quail egg quality.
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Mapeamento de proteínas alvo para novos antifúngicos na fração microssomal e citosólica do patógeno humano Aspergillus fumigatus / Mapping target proteins for new antifungals in the microsomal and cytosolic fraction of the human pathogen Aspergillus fumigatus

Ivy Ortega Medeiros Zanon da Silva 21 March 2013 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos. / The invasive fungal infections incidence has increased in recent years. These infections usually presents high mortality rates. Antifungal prophylaxis remains the most common clinical strategy to decrease mortality and prevent invasive fungal infections, however, it has low efficiency and drug resistance reports. Furthermore, antifungal therapy is limited to a small group of drugs such as polyenes, azoles, and echinocandins. Thus, the search for new drug targets is imperative for the new antifungal agents development. In silico studies have indicated four genes as potential drug target in pathogenic fungi. In this context, our aim was to investigate the expression of two proteins encoded by two putative target genes, erg6 in the microsomal fraction, and trr1 in the cytosolic fraction of A. fumigatus hyphae. To achieve this goal, we first standardized all steps of cell fractionation to isolate these two fractions of A. fumigatus hyphae. Subsequently, was optimized the protein extraction and rehidratation protocols of these two subfractions, such as cytosolic proteins rehidratation. These extracts were submitted to different protocols for protein fractionation in an OFFGEL electrophoresis system (OGE). The Western immunoblot results showed that these two proteins, erg6 and trr1, are expressed in filamentous phase of A. fumigatus. The microsomal protein extract submitted to the OGE in twelve fractions, showed three erg6 protein subunits recognized by monoclonal antibody, with distincts molecular weight and pI: a subunit with approximately 79 kDa, with pI in the range of 5,91 and 6,49, and others two subunits with 35 kDa and 32 kDa, both with pI between 6,49 and 7,08. The enzyme erg6 was described as a homotetramer in other fungi, however, our results suggest that in A. fumigatus the erg6 has a heterotetrameric structure. Regarding trr1 protein, in both, total and fractionated (OGE) extracts, a single band of approximately 40 kDa, with pI in the range of 4.79 and 5.33, was recognized by the polyclonal antibody, suggesting that this protein appears to have a homodimeric structure, as described in other microorganisms.
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Mapeamento de proteínas alvo para novos antifúngicos na fração microssomal e citosólica do patógeno humano Aspergillus fumigatus / Mapping target proteins for new antifungals in the microsomal and cytosolic fraction of the human pathogen Aspergillus fumigatus

Ivy Ortega Medeiros Zanon da Silva 21 March 2013 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos. / The invasive fungal infections incidence has increased in recent years. These infections usually presents high mortality rates. Antifungal prophylaxis remains the most common clinical strategy to decrease mortality and prevent invasive fungal infections, however, it has low efficiency and drug resistance reports. Furthermore, antifungal therapy is limited to a small group of drugs such as polyenes, azoles, and echinocandins. Thus, the search for new drug targets is imperative for the new antifungal agents development. In silico studies have indicated four genes as potential drug target in pathogenic fungi. In this context, our aim was to investigate the expression of two proteins encoded by two putative target genes, erg6 in the microsomal fraction, and trr1 in the cytosolic fraction of A. fumigatus hyphae. To achieve this goal, we first standardized all steps of cell fractionation to isolate these two fractions of A. fumigatus hyphae. Subsequently, was optimized the protein extraction and rehidratation protocols of these two subfractions, such as cytosolic proteins rehidratation. These extracts were submitted to different protocols for protein fractionation in an OFFGEL electrophoresis system (OGE). The Western immunoblot results showed that these two proteins, erg6 and trr1, are expressed in filamentous phase of A. fumigatus. The microsomal protein extract submitted to the OGE in twelve fractions, showed three erg6 protein subunits recognized by monoclonal antibody, with distincts molecular weight and pI: a subunit with approximately 79 kDa, with pI in the range of 5,91 and 6,49, and others two subunits with 35 kDa and 32 kDa, both with pI between 6,49 and 7,08. The enzyme erg6 was described as a homotetramer in other fungi, however, our results suggest that in A. fumigatus the erg6 has a heterotetrameric structure. Regarding trr1 protein, in both, total and fractionated (OGE) extracts, a single band of approximately 40 kDa, with pI in the range of 4.79 and 5.33, was recognized by the polyclonal antibody, suggesting that this protein appears to have a homodimeric structure, as described in other microorganisms.
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Recherche de biomarqueurs de la neurotoxicité des traitements anticancéreux à base d'oxaliplatine: approche protéomique quantitative

Ernoult, Emilie 22 April 2011 (has links) (PDF)
L'oxaliplatine est un médicament de référence dans les traitements des cancers colorectaux métastatiques. Toutefois, l'oxaliplatine occasionne une toxicité d'ordre neurologique qui retentit sur la qualité de vie de certains patients prédisposés. Nous avons analysé pour la première fois la neurotoxicité de l'oxaliplatine par une approche protéomique. Un protocole expérimental, associant marquage iTRAQ et fractionnement par IEFOFFGEL a tout d'abord été mis en place afin d'améliorer la couverture protéomique d'échantillons complexes. Puis, l'expression protéique différentielle après traitement par I'oxaliplatine a été analysée globalement, à la fois dans le protéome intracellulaire et dans le sécrétome d'un modèle cellulaire humain de nerotoxicité. L'analyse du protéome intracellulaire a permis l'identification de plus de 2700 protéines et offre de nouvelles perspectives quant aux mécanismes moléculaires de la neurotoxicité de I ' o x aliplatine. Le médicament aItère l'expression de protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l'ADN, le contrôle du cycle cellulaire, le stress oxydatif , le métabolisme énergétique, le stress protéotoxique, la résistance multidrogue, la plasticité neuronale et l'homéostasie calcique. L'analyse du sécrétome a mis en évidence la sur-expression, suite au traitement par l'oxaliplatine, de 23 protéines sécrétées. Nous proposons pour la première fois les protéines Calmoduline, Thymosine beta-10 et le facteur neurotrophique Neudésine comme candidats biomarqueurs de la neurotoxicité des traitements anticancéreux à base d'oxaliplatine.
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Nouvelle méthode en protéomique pour améliorer l'identification et la quantification des protéines acétylées / Developement of a new proteomic method to improve identification and quantification of acetylated proteins

Diallo, Issa 09 November 2017 (has links)
L'acétylation des protéines constitue l’une des plus importantes modifications post-traductionnelles (PTMs). Elle intervient dans de multiples processus bologiques et physiopathologiques tels que, l’activité transcriptionnelle, l'apoptose, la régulation des voies métaboliques, les cancers, les maladies inflammatoires et cardiovasculaires. Face à l’importance de l’acétylation des protéines, il apparaît donc indispensable de bien comprendre les mécanismes qui y sont associés, et donc, de pouvoir identifier et quantifier les protéines acétylées à partir du protéome complet d’échantillons complexes tels que des extraits cellulaires ou tissulaires. La spectrométrie de masse est une technique de choix pour de telles études, car elle permet d’identifier les protéines et les sites d’acétylation, mais aussi de les quantifier en l’associant à des techniques de quantification (label free, SILAC, iTRAQ/TMT, AQUA). Malheureusement, ces méthodes ne ciblent pas particulièrement les acétylations et requièrent l’utilisation de techniques d’enrichissement ou de fractionnement qui ne sont dédiées qu’à certains types d’acetylation : les N-ter et K-acetylation. Aucun enrichissement n’est disponible pour les O- acétylations et ces méthodes d’enrichissement ne sont pas toujours compatibles avec les techniques de quantification citées ci-dessus. Pour améliorer la détection et la quantification des acétylations, nous proposons la méthode RAQIAT (Relatif Absolute Quantification Isobaric Affinity Tag) qui se résume en trois grandes étapes: i) Le blocage des fonctions amines libres à l'aide de la di-méthylation réductrice, ceci empêchera ces dernières de réagir avec le réactif RAQIAT, ii) La désacétylation des lysines acétylées pour permettre une quantification sélective des acétylations, iii) Le marquage des amines primaires précédemment désacétylées dans l’étape 2 par le réactif RAQIAT pour permettre leurs identifications et quantifications. Ce manuscrit a porté en partie sur les deux premières étapes de la méthode RAQIAT.Dans la première étape, les échantillons de protéines de levure ont été digérés puis di-méthylés et fractionnés par OFFGEL en 24 fractions. Ensuite, chacune de ces 24 fractions OFFGEL a été soumise à un fractionnement nano-RPLC et analysée par MALDI TOF/TOF (4800 MALDI-TOF/TOF, Sciex). En parallèle, la même expérience a été réalisée, cette fois-ci sans di-méthylation. L'analyse des données a été réalisée en utilisant le logiciel Mascot comme moteur de recherche.L’efficacité de la réaction de di-méthylation démontrée, nous avons montré que sans réaliser la di-méthylation réductrice 164 sites acétylés ont pu été identifiés alors que 385 sites acétylés distincts ont été identifiés avec la di-méthylation réductrice. De plus, l'amélioration de la détection de l'acétylation en utilisant la méthode de di-méthylation a été observée pour chacune des différents types acétylations: N-ter, K- et O-acétylation.Dans la deuxième étape, nous avons présenté des résultats préliminaires de déacétylation par la sirtuine 1 en présence du peptide de la p53 (Ac-Arg-His-Lys-Lys-(Ac)-AMC) connu comme étant un substrat de cette enzyme. Nous avons observé la formation d’un peptide non acétylé, suggérant une déacétylation de ce peptide acétylé de p53. Cependant, la formation de cet ion étant très faible et l’ion acétylé étant fortement préservé, nous en avons conclu que l’efficacité de la déacétylation du peptide de p53 n’était pas suffisante pour l’intégrer à la méthode RAQIAT. / Protein acetylation is one of the most widespread post-translational modifications which is involved in many cellular physiologies and pathologies such as cancers. Regarding the important biological effect of protein acetylation and a non-negligible number of proteins bearing this PTM, several methods emerged last decade to investigate such PTM. But the detection of acetylations and their quantification are still limited and enrichment method allowing a better detection of acetylation target mostly one kind of acetylation (K-acetylation). To improve the detection of the three kind of acetylation (N-ter, K, and O-) and their quantification, we propose the RAQIAT method (Relative Absolute Quantification Isobaric Affinity Tag), based on protein digestion followed by 3 steps : i) a protection of free primary amines at N-ter, lysine (i.e. primary amine not bearing PTM) based on a reductive di-methylation strategy ii) a deacetylation of acetylated residues to obtain free primary amine corresponding to peptides previously acetylated iii) a RAQIAT labeling on the free primary amine obtained in the previous step to allow the enrichment of peptides previously acetylated and their quantifications. Herein, we present the investigation of the two first steps of RAQIAT method.In the first step, we evidenced that the reductive di-methylation strategy improved the detection of the three kind of acetylation: N-ter, K- and O- acetylations. Yeast protein samples were digested with trypsin prior di-methylation of resulting peptide mixture. Then, di-methylated peptide mixtures were fractionated by OFFGEL and reverse phase liquid chromatography followed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry analysis. Data analysis was performed by using Mascot as search engines.Our results showed that OFFGEL fractionation is a useful step to increase detection of acetylations. Moreover, we showed that our di-methylation treatment improved significantly detection of acetylation. Indeed, after di-methylation treatment, 385 unique acetylated sites were identified while 164 unique acetylated peptides were detected without di-methylation treatment. The improvement of acetylation detection using our di-methylation strategy is observed for each of acetylations: N-ter, K- and O-acetylations. Thus, this new proteomic method is promising to enhance N-ter, K- and O-acetylation detection.In the second step, we presented preliminary results of deacetylation by sirtuin 1 in the presence of p53 peptide (Ac-Arg-His-Lys-Lys- (Ac) –AMC. However, the low deacetylation efficiency of the p53 peptide observed, conclude that is not suitable to applicate into RAQIAT Method
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Étude du protéome de tumeurs colorectales

Besson, Damien 22 October 2013 (has links) (PDF)
Les avancées récentes dans l'étude des phénomènes aboutissant au cancer montrent que chaque tumeur possède des caractéristiques physiopathologiques qui lui sont propres. L'apport de biomarqueurs, permettant de réaliser des diagnostics moléculaires précis est donc un enjeu primordial. Une analyse protéomique quantitative globale basée sur l'utilisation du marquage iTRAQ TM a été réalisée sur des tumeurs colorectales congelées. Ces tumeurs ont été analysées en fonction de leur stade TNM d'une part, et de leur statut concernant l'oncogène KRAS d'autre part. Afin de compléter notre analyse nous avons également analysé le protéome de lignées cellulaires colorectales. Nous avons également examiné le stroma de ces tumeurs, et nous avons développé une technique d'analyse d'un sous-protéome : le glycoprotéome. L'ensemble de ces résultats nous a conduit à proposer une base de données des protéines identifiables dans ce modèle constituée de 3 168 protéines. 513 des protéines que nous avons identifiées sont susceptibles d'être sécrétées par les tumeurs et constituent une base de données de candidats biomarqueurs pour le cancer colorectal. Nous avons également validé l'un d'entre eux : l'OLFM4. Il s'agit d'un candidat biomarqueur potentiel pour la détection précoce des cancers colorectaux, et nous avons également mis en évidence que son niveau d'expression était modifié lorsque la tumeur était mutée sur l'oncogène KRAS. Nous nous sommes également intéressés à ses fonctions cellulaires, et nous avons montré qu'elle participait à la résistance des tumeurs aux traitements, et il est probable qu'elle joue un rôle dans la dissémination tumorale.

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