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Efeito de nanopartículas carregadas com sinvastatina na proliferação e ativação de osteoblastos murinos / Effect of simvastatin-loaded nanoparticles on proliferation and activation of murine osteoblasts

Braga, Cintia de Melo 13 February 2017 (has links)
BRAGA, C. M. Efeito de nanopartículas carregadas com sinvastatina na proliferação e ativação de osteoblastos murinos. 2017. 62 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Morfofuncionais) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Programa de Pós Graduação em Ciências Morfofuncionais (pcmf.ufc@gmail.com) on 2017-11-28T12:56:41Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_cmbraga.pdf: 1852341 bytes, checksum: f5896dca7da70a18915e220eaf369065 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-11-28T13:50:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_cmbraga.pdf: 1852341 bytes, checksum: f5896dca7da70a18915e220eaf369065 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-28T13:50:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_cmbraga.pdf: 1852341 bytes, checksum: f5896dca7da70a18915e220eaf369065 (MD5) Previous issue date: 2017-02-13 / Introduction: The use of polymers as drug nanocarriers offers flexibility in dosage and release kinetics, improving the effectiveness of pharmacological treatments. Simvastatin, a cholesterol-lowering drug, has been shown in some studies to estimate formation. It is believed that this pleiotropic effect and an obtainment of a system for the controlled release can lead to an increase in bone formation. Objective: The purpose of this study was to evaluate the effect of PDLLA polymerase-encapsulated simvastatin (NP-SIN) on the proliferation and activation of murine osteoblasts (OFCOL II) in culture. Methods: The effect of NP-SIN on the viability and proliferation of osteoblasts was investigated through the MTT assay and the ki67 immunostaining, its effect on cell activation for assessed by mineralization assay, measurement of bone alkaline phosphatase levels No culture medium by ELISA, and its protein expression by western blot. The possible mechanisms of action of NP-SIN non-bone metabolism were studied by immunofluorescence and western blot for RANK-L, OPG and BMP-2. Statistical analysis was performed using analysis of variance ANOVA, followed by the Bonferroni test (p <0.05). Results: As nanoparticles were used with uniforms, with approximate diameter of 123 nm, evaluated by transmission electron microscopy. Simvastatin was submitted to a release test, when encapsulated, it was observed progressive and sustained release for up to 6 days, when the degradation process began. Cytotoxic effects on osteoblasts were observed only when incubated with NP-SIN concentrations equal to or greater than 10-1 μM. No increase in osteoblast concentration was observed at any of the concentrations studied. The mineralization assay suggests that NP-SIN (10-2 μM) increases the activity of osteoblasts when compared to controls, not incubated with simvastatin. At the same concentration (NP-SIN 10-2 μM), increased protein expression and alkaline phosphatase release (FA) were associated with a significant increase in the expression of the bone morphogenetic protein (BMP-2). An increase (p <0.05) in the immunoblot of BMP-2 and OPG was also observed. There was no significant difference in RANK-L protein expression between the group of osteoblasts incubated with NP-SIN and the controls. Conclusions: These results indicate a potential beneficial effect of the nanoparticles of PDLLA encapsulated with simvastatin no repair of bone defects through the activation of osteoblasts. / Introdução: O uso de polímeros como nanocarreadores de fármacos oferece flexibilidade na dosagem e na cinética de liberação, melhorando a eficácia dos tratamentos farmacológicos. A sinvastatina, medicamento utilizado para a redução do colesterol, em alguns estudos, tem demonstrado ação na estimulação da formação óssea. Acredita-se que este efeito pleiotrópico e a possibilidade obtenção de um sistema para liberação controlado pode levar a um aumento na formação óssea. Objetivo: O objetivo deste estudo, portanto, foi avaliar o efeito da sinvastatina encapsulada em nanopartículas poliméricas (NP-SIN) de PDLLA na proliferação e ativação de osteoblastos murinos (OFCOL II) em cultura. Métodos: O efeito da NP-SIN na viabilidade e proliferação de osteoblastos foi investigado através do ensaio de MTT e da imunomarcação para ki67, enquanto seu efeito na ativação dessas células foi avaliado através de ensaio de mineralização, da mensuração dos níveis de fosfatase alcalina óssea no meio de cultura por ELISA, e da sua expressão protéica por western blot. Os possíveis mecanismos da ação da NP-SIN no metabolismo ósseo foram estudados através de imunofluorescencia e western blot para RANK-L, OPG e BMP-2. A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância ANOVA, seguida pelo teste Bonferroni (p<0,05). Resultados: As nanopartículas utilizadas apresentaram-se uniformes, com diâmetro aproximado de 123 nm, avaliada através de microscopia eletrônica de transmissão. A sinvastatina foi submetida a teste de liberação e, quando encapsulada, observou-se liberação progressiva e sustentada por até 6 dias, quando iniciou processo de degradação. Foram observados efeitos citotóxicos nos osteoblastos apenas quando incubados com concentrações de NP-SIN igual ou superiores a 10-1 μM. Não foi observado aumento na proliferação de osteoblastos em nenhuma das concentrações estudadas. O ensaio de mineralização sugere que a NP-SIN (10-2 μM) aumenta a atividade dos osteoblastos, quando comparada aos grupos controle, não incubados com sinvastatina. Nessa mesma concentração (NP-SIN 10-2 μM), foi observado aumento da expressão protéica e liberação de fosfatase alcalina (FAO), associado ao aumento significativo da expressão da proteína morfogenética óssea (BMP-2). Foi observado ainda aumento (p<0,05) da imunomarcação de BMP-2 e OPG. Não houve diferença significativa na expressão da proteína RANK-L entre o grupo de osteoblastos incubados com NP-SIN e os controles. Conclusões: Estes resultados indicam um potencial efeito benéfico das nanopartículas de PDLLA encapsuladas com sinvastatina no reparo de defeitos ósseos, através da ativação de osteoblastos.
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Ensaio de citotoxicidade osteoblástica em amostras porosas das ligas Ti-6Al-4V, Ti-13Nb-13Zr, Ti-35Nb, Ti-35Nb-7Zr-5Ta e TiCP

Campos, Gabriela Esteves de [UNESP] 07 February 2014 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-08-13T14:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-07Bitstream added on 2014-08-13T17:59:40Z : No. of bitstreams: 1 000776037.pdf: 4532523 bytes, checksum: 4032f27f9f19728cb9f9a2e49aa2f3ca (MD5) / Os eventos celulares e teciduais que ocorrem durante o processo de osseointegração são diretamente influenciados pela composição, morfologia e topografia do biomaterial. O titânio (Ti) e suas ligas são os materiais mais usados para este fim, já que sua elasticidade pode ser controlada pela confecção de poros e pela composição química da liga. O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade das ligas TiCP (Titânio comercialmente puro grau 2), Ti-6Al-4V (titânioalumínio- vanádio), Ti-13Nb-13Zr (titânio-nióbio-zircônio), Ti-35Nb (titânio-nióbio), Ti-35Nb-7Zr-5Ta (titânio-nióbio-zircônia-tântalo). Foram confeccionadas, por metalurgia do pó, 720 amostras em forma de discos de cada liga, as quais foram caracterizadas por espectroscopia por energia dispersiva (EDS) e análise metalográfica. Células osteogênicas obtidas da calvária de ratos neonatos foram cultivadas sobre as amostras de cada liga e avaliadas de acordo a proliferação celular (PC) (24 horas, 3 e 10 dias), viabilidade celular (VC) (3, 10 e e 14 dias), conteúdo de proteína total (PT) e atividade da fosfatase alcalina (FA) (3 e 10 dias), produção de TGF- 1, TNF- e IL-6 e formação dos nódulos de mineralização (NM) (14 e 21 dias). Os resultados obtidos foram submetidos aos testes estatísticos ANOVA e Tukey, com nível de significância de 5%. O EDS confirmou a presença dos elementos constituintes de cada liga. A análise metalográfica demonstrou que as amostras apresentaram estrutura com 42% de poros interligados de tamanhos variados. A PC foi maior aos 10 dias para Ti-13Nb-13Zr, com diferença estatística. A VC das novas ligas foi semelhante ao TiCP, com médias maiores que Ti-6Al-4V e diferença estatística aos 10 e 14 dias. PT aos 10 dias exibiu maior média e diferença estatística para Ti-35Nb-7Zr-5Ta. FA apresentou diferença estatística entre Ti-6Al-4V(maior média) e TiCP e Ti-35Nb. As médias de NM foram maiores e diferentes .... / Cellular and tissue events that occur during osseointegration process are directly influenced by composition, morphology and topography of the biomaterial. Titanium (Ti) and its alloys are commonly used for this purpose, since its elasticity can be controlled by porous topography and the chemical composition of the alloy. The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity of Commercially Pure Titanium grade 2 (CPTi), Ti-6Al-4V (Titanium-Aluminum-Vanadium), Ti-13Nb- 13Zr (Titanium-Niobium-Zirconium), Ti-35Nb (Titanium-Niobium) and Ti-35Nb-7Zr-5Ta (Titanium-Niobium- Zirconium -Tantalum) alloys. For each studied alloy, 720 samples in the form of discs were made by powder metallurgy and characterized by means of Spectrophotometry of Dispersive Energy (SDE) and metallographic analysis. Ostegenic cells from the calvaria of newborn rats were cultured on the samples of each group and evaluated according to cell growth (CG) (24 hours, 3 and 10 days), cell viability (CV) (3, 10 and 14 days), total protein content (TP) and alkaline phosphatase activity (ALP) (3 and 10 days), production of TGF- 1, TNF- and IL- 6 (7 and 14 days) and mineralized nodules formation (MN) (14 and 21 days). Data obtained was analysed by statistical ANOVA and Tukey's tests, with 5% significance level. SDE detected the presence of constitutive elements of each alloy. Metallographic analysis showed samples structure with 42% of linked and different-size pores. CG was higher at day 10 for Ti-13Nb-13Zr, with statistical difference. New alloys´ CV were similar to CPTi, with higher averages than Ti- 6Al-4V and statistical difference at days 10 and 14. TP at day 10 showed higher average and statistical difference to Ti-35Nb-7Zr-5Ta. 18 ALP exhibited statistical differente between Ti-6Al-4V (highest average) and CPTi and Ti-35Nb. MN were higher and different statistically at day 14 for Ti-35Nb-7Zr-5Ta e Ti-35Nb and at day 21 for the same plus ....
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Análise dos indicadores da osteogênese, citotoxicidade e genotoxicidade de substitutos ósseos em osteoblastos-like

Milhan, Noala Vicensoto Moreira [UNESP] 19 December 2013 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-08-13T14:51:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-19Bitstream added on 2014-08-13T17:59:37Z : No. of bitstreams: 1 000776493.pdf: 2249587 bytes, checksum: 509733cfe2be76d014d1899dbe20d842 (MD5) / O objetivo deste estudo foi investigar in vitro os indicadores osteogênese, a citotoxicidade e genotoxicidade de osteoblastos-like (MG 63) em contato indireto com três substitutos ósseos: Hidroxipatita bovina (HA) (Bio-Oss®- Geistlich), Beta fosfato tricálcico (β-TCP - Bionnovation) e Beta fosfato tricálcico experimental (β-TCP experimental). Os osteoblastos-like foram expostos aos materiais por 24 h, por meio da utilização de meio condicionado pelos substitutos ósseos na concentração de 16 mg/mL. Os indicadores da osteogênese foram analisados pelos testes atividade de fosfatase alcalina, conteúdo de proteína total e formação de nódulos de mineralização. A viabilidade celular foi mensurada pelo teste de MTT e a genotoxicidade foi determinada pela formação de micronúcleos (MNT) nas células após exposição aos substitutos ósseos e também ao etilmetano sulfanato (controle positivo). Os dados obtidos foram submetidos aos testes estatísticos ANOVA, comparação múltipla de Tukey (Post Hoc) e teste Z (p<0,05). Pelo teste de MTT observou-se que nenhum dos materiais avaliados foi citotóxico, sendo que o β -TCP, seguido pelo Bio-Oss®, induziram proliferação celular após 24 h. O ensaio de MNT indicou que nenhum dos substitutos ósseos apresentou genotoxicidade. Em relação aos indicadores da osteogênese, foi observado que as células em contato com os materiais foram capazes de induzir a osteogênese e que esse processo foi influenciado pelo período de cultura dos osteoblastos-like em contato com os substitutos ósseos. O conteúdo de proteína total apresentou-se maior em geral aos 10 dias, enquanto a atividade de fosfatase alcalina foi superior em todos os materiais aos 14 dias, semelhante à formação de nódulos de mineralização, que também apresentou pico de formação no período de 14 dias. Dentre os substitutos ósseos avaliados, foi constatado que ... / The aim of this study was to investigate in vitro the indicators of osteogenesis, the cytotoxicity and genotoxicity of osteoblast-like (MG 63) in indirect contact with three bone substitutes: Hydroxypatite Bovine (HA) (Bio -Oss ® - Geistlich), Beta Tricalcium Phosphate (β -TCP - Bionnovation) and experimental Beta Tricalcium Phosphate (β -TCP experimental). The osteoblasts-like were exposed to the materials for 24 h, through the use of conditioned medium by bone substitutes in the concentration of 16 mg/mL. The indicators of osteogenesis were analyzed by alkaline phosphatase activity, total protein content and formation of mineralized nodules. Cell viability was measured by MTT assay and genotoxicity was determined by the formation of micronuclei (MNT) in the cells after exposure to the bone substitute and also to the etilmetano sulfanato (positive control). The data obtained were submitted to ANOVA, Tukey's multiple comparison (Post Hoc) and Z test (p < 0,05 ). The MTT assay showed that none of the tested materials was cytotoxic. Furthemore, the β -TCP, followed by Bio- Oss® , induced proliferation of cells after 24 h. The MNT test indicated that none of the bone substitutes was genotoxic. Concerning the indicators of osteogenesis, it was observed that cells in contact with the materials were able to induce osteogenesis and that this process was influenced by the period of culture of osteoblast-like in contact with bone substitutes. The total protein content was the highest in general on the 10th day, while the alkaline phosphatase activity was the highest in all the materials on the 14th day, similar to the formation of mineralized nodules, which also showed the highest values on the 14th day. Among the evaluated bone substitutes, it was found that the β-TCP induced higher osteogenesis than others on all the tests. Based on the results of this study, it was concluded that all.....
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Ensaio de citotoxicidade osteoblástica em amostras porosas das ligas Ti-6Al-4V, Ti-13Nb-13Zr, Ti-35Nb, Ti-35Nb-7Zr-5Ta e TiCP /

Campos, Gabriela Esteves de. January 2014 (has links)
Orientador: Yasmin Rodarte Carvalho / Banca: Renata Falchete do Prado / Banca: Luis Gustavo Oliveira de Vasconcellos / Resumo: Os eventos celulares e teciduais que ocorrem durante o processo de osseointegração são diretamente influenciados pela composição, morfologia e topografia do biomaterial. O titânio (Ti) e suas ligas são os materiais mais usados para este fim, já que sua elasticidade pode ser controlada pela confecção de poros e pela composição química da liga. O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade das ligas TiCP (Titânio comercialmente puro grau 2), Ti-6Al-4V (titânioalumínio- vanádio), Ti-13Nb-13Zr (titânio-nióbio-zircônio), Ti-35Nb (titânio-nióbio), Ti-35Nb-7Zr-5Ta (titânio-nióbio-zircônia-tântalo). Foram confeccionadas, por metalurgia do pó, 720 amostras em forma de discos de cada liga, as quais foram caracterizadas por espectroscopia por energia dispersiva (EDS) e análise metalográfica. Células osteogênicas obtidas da calvária de ratos neonatos foram cultivadas sobre as amostras de cada liga e avaliadas de acordo a proliferação celular (PC) (24 horas, 3 e 10 dias), viabilidade celular (VC) (3, 10 e e 14 dias), conteúdo de proteína total (PT) e atividade da fosfatase alcalina (FA) (3 e 10 dias), produção de TGF- 1, TNF- e IL-6 e formação dos nódulos de mineralização (NM) (14 e 21 dias). Os resultados obtidos foram submetidos aos testes estatísticos ANOVA e Tukey, com nível de significância de 5%. O EDS confirmou a presença dos elementos constituintes de cada liga. A análise metalográfica demonstrou que as amostras apresentaram estrutura com 42% de poros interligados de tamanhos variados. A PC foi maior aos 10 dias para Ti-13Nb-13Zr, com diferença estatística. A VC das novas ligas foi semelhante ao TiCP, com médias maiores que Ti-6Al-4V e diferença estatística aos 10 e 14 dias. PT aos 10 dias exibiu maior média e diferença estatística para Ti-35Nb-7Zr-5Ta. FA apresentou diferença estatística entre Ti-6Al-4V(maior média) e TiCP e Ti-35Nb. As médias de NM foram maiores e diferentes.... / Abstract: Cellular and tissue events that occur during osseointegration process are directly influenced by composition, morphology and topography of the biomaterial. Titanium (Ti) and its alloys are commonly used for this purpose, since its elasticity can be controlled by porous topography and the chemical composition of the alloy. The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity of Commercially Pure Titanium grade 2 (CPTi), Ti-6Al-4V (Titanium-Aluminum-Vanadium), Ti-13Nb- 13Zr (Titanium-Niobium-Zirconium), Ti-35Nb (Titanium-Niobium) and Ti-35Nb-7Zr-5Ta (Titanium-Niobium- Zirconium -Tantalum) alloys. For each studied alloy, 720 samples in the form of discs were made by powder metallurgy and characterized by means of Spectrophotometry of Dispersive Energy (SDE) and metallographic analysis. Ostegenic cells from the calvaria of newborn rats were cultured on the samples of each group and evaluated according to cell growth (CG) (24 hours, 3 and 10 days), cell viability (CV) (3, 10 and 14 days), total protein content (TP) and alkaline phosphatase activity (ALP) (3 and 10 days), production of TGF- 1, TNF- and IL- 6 (7 and 14 days) and mineralized nodules formation (MN) (14 and 21 days). Data obtained was analysed by statistical ANOVA and Tukey's tests, with 5% significance level. SDE detected the presence of constitutive elements of each alloy. Metallographic analysis showed samples structure with 42% of linked and different-size pores. CG was higher at day 10 for Ti-13Nb-13Zr, with statistical difference. New alloys' CV were similar to CPTi, with higher averages than Ti- 6Al-4V and statistical difference at days 10 and 14. TP at day 10 showed higher average and statistical difference to Ti-35Nb-7Zr-5Ta. 18 ALP exhibited statistical differente between Ti-6Al-4V (highest average) and CPTi and Ti-35Nb. MN were higher and different statistically at day 14 for Ti-35Nb-7Zr-5Ta e Ti-35Nb and at day 21 for the same plus .... / Mestre
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Análise dos indicadores da osteogênese, citotoxicidade e genotoxicidade de substitutos ósseos em osteoblastos-like /

Milhan, Noala Vicensoto Moreira. January 2013 (has links)
Orientador: Samira Esteves Afonso Camargo / Co-orientador: Renata Falchete do Prado / Banca: Cacio de Moura Netto / Banca: Marcia Carneiro Valera Garakis / Resumo: O objetivo deste estudo foi investigar in vitro os indicadores osteogênese, a citotoxicidade e genotoxicidade de osteoblastos-like (MG 63) em contato indireto com três substitutos ósseos: Hidroxipatita bovina (HA) (Bio-Oss®- Geistlich), Beta fosfato tricálcico (β-TCP - Bionnovation) e Beta fosfato tricálcico experimental (β-TCP experimental). Os osteoblastos-like foram expostos aos materiais por 24 h, por meio da utilização de meio condicionado pelos substitutos ósseos na concentração de 16 mg/mL. Os indicadores da osteogênese foram analisados pelos testes atividade de fosfatase alcalina, conteúdo de proteína total e formação de nódulos de mineralização. A viabilidade celular foi mensurada pelo teste de MTT e a genotoxicidade foi determinada pela formação de micronúcleos (MNT) nas células após exposição aos substitutos ósseos e também ao etilmetano sulfanato (controle positivo). Os dados obtidos foram submetidos aos testes estatísticos ANOVA, comparação múltipla de Tukey (Post Hoc) e teste Z (p<0,05). Pelo teste de MTT observou-se que nenhum dos materiais avaliados foi citotóxico, sendo que o β -TCP, seguido pelo Bio-Oss®, induziram proliferação celular após 24 h. O ensaio de MNT indicou que nenhum dos substitutos ósseos apresentou genotoxicidade. Em relação aos indicadores da osteogênese, foi observado que as células em contato com os materiais foram capazes de induzir a osteogênese e que esse processo foi influenciado pelo período de cultura dos osteoblastos-like em contato com os substitutos ósseos. O conteúdo de proteína total apresentou-se maior em geral aos 10 dias, enquanto a atividade de fosfatase alcalina foi superior em todos os materiais aos 14 dias, semelhante à formação de nódulos de mineralização, que também apresentou pico de formação no período de 14 dias. Dentre os substitutos ósseos avaliados, foi constatado que ... / Abstract: The aim of this study was to investigate in vitro the indicators of osteogenesis, the cytotoxicity and genotoxicity of osteoblast-like (MG 63) in indirect contact with three bone substitutes: Hydroxypatite Bovine (HA) (Bio -Oss ® - Geistlich), Beta Tricalcium Phosphate (β -TCP - Bionnovation) and experimental Beta Tricalcium Phosphate (β -TCP experimental). The osteoblasts-like were exposed to the materials for 24 h, through the use of conditioned medium by bone substitutes in the concentration of 16 mg/mL. The indicators of osteogenesis were analyzed by alkaline phosphatase activity, total protein content and formation of mineralized nodules. Cell viability was measured by MTT assay and genotoxicity was determined by the formation of micronuclei (MNT) in the cells after exposure to the bone substitute and also to the etilmetano sulfanato (positive control). The data obtained were submitted to ANOVA, Tukey's multiple comparison (Post Hoc) and Z test (p < 0,05 ). The MTT assay showed that none of the tested materials was cytotoxic. Furthemore, the β -TCP, followed by Bio- Oss® , induced proliferation of cells after 24 h. The MNT test indicated that none of the bone substitutes was genotoxic. Concerning the indicators of osteogenesis, it was observed that cells in contact with the materials were able to induce osteogenesis and that this process was influenced by the period of culture of osteoblast-like in contact with bone substitutes. The total protein content was the highest in general on the 10th day, while the alkaline phosphatase activity was the highest in all the materials on the 14th day, similar to the formation of mineralized nodules, which also showed the highest values on the 14th day. Among the evaluated bone substitutes, it was found that the β-TCP induced higher osteogenesis than others on all the tests. Based on the results of this study, it was concluded that all..... / Mestre
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Estudo da expressão de osteopontina em sistemas de coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas humanas e seus efeitos sobre o fenótipo neoplásico e a ativação osteoclástica / Expression of osteopontin in cocultures of osteoblastic cells and squamous cell carcinoma cells and its effects on the neoplastic cell phenotype and osteoclastic activation

Teixeira, Lucas Novaes, 1981- 26 August 2018 (has links)
Orientador: Paulo Tambasco de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-26T15:44:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_LucasNovaes_D.pdf: 3520593 bytes, checksum: e42a5497740bc09fe80b9a6a035947df (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O carcinoma espinocelular (CEC) oral representa a neoplasia maligna mais prevalente das estruturas bucais, podendo invadir o tecido ósseo e promover sua reabsorção em até 56% dos casos. A expressão da proteína matricelular osteopontina (OPN) tem sido relacionada a uma maior agressividade de neoplasias malignas, incluindo o CEC oral. No tecido ósseo, a OPN representa a proteína mais abundante da matriz não colágena, concentrada nas interfaces ósseas, i.e. lâminas limitantes, linhas de cimentação e reversas, sendo essencial para adesão e funções de osteoblastos e osteoclastos. Apesar de no microambiente tumoral a OPN estar associada a um fenótipo neoplásico mais agressivo, ainda não está estabelecido o papel da OPN secretada por osteoblastos sobre células neoplásicas derivadas de CEC oral e o impacto sobre osteoclastos. O presente estudo teve como objetivos avaliar a expressão de OPN em sistemas de coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas malignas humanas e os efeitos da expressão de OPN secretada por osteoblastos sobre o fenótipo neoplásico in vitro. Adicionalmente, avaliou-se o efeito das coculturas sobre a atividade osteoclástica. Células epiteliais neoplásicas malignas derivadas de CEC oral (SCC9) foram plaqueadas sobre membranas de Transwell®, recobertas ou não por uma camada fina e uniforme de Matrigel, e cocultivadas com células osteoblásticas (SAOS-2) durante seu pico de expressão de OPN (10o dia de cultura). Células SCC9 expostas a culturas SAOS-2 silenciadas para OPN por RNA de interferência (RNAi) e células SCC9 cultivadas isoladamente foram usadas como controles. Após 24 h de cocultivo, células SCC9 foram avaliadas, quantitativamente, para adesão, proliferação, migração e invasão de Matrigel. A atividade de osteoclastos derivados de células monocíticas U-937 foi avaliada, quantitativamente, por meio dos ensaios de reabsorção de fosfato cálcio e de dosagem de citocinas em eluentes obtidos de células SCC9 e SAOS-2 após o cocultivo durante o pico de OPN ou com o seu silenciamento. A análise estatística foi realizada pelo teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (p < 0,05). Os resultados indicaram indução recíproca na expressão de OPN em SAOS-2 e SCC9 em cocultura. A OPN secretada por células SAOS-2 afetou o fenótipo de culturas SCC9, promovendo a adesão e a proliferação celulares e a invasão de Matrigel, a qual também estava aumentada, mas em menor intensidade, com o silenciamento para OPN. A migração celular não foi afetada. O cocultivo com SAOS-2, principalmente durante o pico de OPN, resultou na sobre-expressão das citocinas IL 6 e IL 8 pelas células SCC9, aumentando a capacidade de células osteoclásticas em reabsorver fosfato de cálcio. Conjuntamente, esses resultados sugerem que a OPN derivada de osteoblastos afeta as interações entre células epiteliais neoplásicas malignas, osteoblastos e osteoclastos, possivelmente contribuindo para a progressão de lesões ósseas do CEC oral / Abstract: The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most prevalent malignant neoplasm of the oral structures. It may invade bone in up to 56% of the cases and promote osteoclast-mediated bone extracellular matrix (ECM) resorption. Expression of the matricellular protein osteopontin (OPN) in malignant neoplasms, including OSCC, has been positively correlated with aggressive tumor behavior. OPN is the most abundant non collagenous ECM protein in bone, where it preferentially accumulates at interfaces, including cement lines, laminae limitantes and reversal lines, being essential for the adhesion and function of osteoblasts and osteoclasts. Despite the importance attributed to OPN in the tumor microenvironment, indicative of more aggressive neoplastic phenotypes, the effects of osteoblast-derived OPN on OSCC cells and on OSCC-induced osteoclast activity are still not fully understood. The present in vitro study aimed to evaluate temporal expression of OPN in cocultures of human osteoblastic cells and malignant neoplastic epithelial cells and the effects of osteoblast-derived OPN on the neoplastic cell phenotype. Additionally, the effects of cocultures on osteoclastic activity were evaluated. Human OSCC-derived epithelial cells (SCC9 cell line) were plated on Transwell® membranes coated or not by a thin uniform layer of Matrigel and cocultured with human osteoblastic cells (SAOS-2 cell line) during its peak of OPN expression (day 10 of SAOS-2 culture). SCC9 cells exposed to OPN-silenced SAOS-2 cultures by means of interference RNA and SCC9 cells cultured alone were used as controls. At 24 h of coculture, SCC9 cells were quantitatively evaluated for cell adhesion, proliferation, migration and invasion of Matrigel. The impact of coculturing SCC9 and SAOS-2 cells either during the OPN peak expression or under the silencing of OPN was quantitatively evaluated in terms of calcium phosphate resorption by U-937-derived osteoclastic cells and expression of cytokines in the culture medium by ELISA assay. The statistical analyses were carried out using the non-parametric Kruskal-Wallis test (p < 0.05). The results showed a reciprocal induction of SAOS-2 and SCC9 cells in terms of OPN expression over the coculture interval. SAOS-2-secreted OPN altered the SCC9 cell phenotype, leading to enhanced cell adhesion and proliferation and higher Matrigel invasion, which was also enhanced, but to a lesser degree, by SAOS-2 cultures silenced for OPN. Cell migration was not affected. Cocultures with SAOS-2, mainly during the peak expression of OPN, resulted in overexpression of IL 6 and IL 8 by SCC9 cells, which corresponded with an enhanced resorptive capacity of osteoclastic cells. Taken together, the results suggest that osteoblast-derived OPN affects the interactions among malignant neoplastic epithelial cells, osteoblasts and osteoclasts, likely contributing to the progression of bone lesions in OSCC / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia
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Rol de los bisfosfonatos en la estimulación de células óseas : receptor y vías de señalización involucradas

Lezcano, Virginia Alicia 01 November 2011 (has links)
La alta afinidad de los bisfosfonatos (BPs) por la hidroxiapatita del hueso y la capacidad que tienen para inhibir la resorción ósea hace que sean el medicamento de elección para la prevención y el tratamiento de enfermedades donde la acti-vidad osteoclástica se encuentra exacerbada. Sin embargo, el mecanismo de acción preciso de los BPs, principalmente en osteoblastos, aún no ha sido completamente elucidado. En el presente trabajo de tesis se investigó la existencia de una entidad receptora para el amino-BP Alendronato (ALN) en células osteoblásticas ROS 17/2.8, a partir del cual se induce un mecanismo de transducción de señales intracelulares. Además, se estudió la modulación por ALN de las cascadas de señalización de las proteínas quinasas activadas por mitóge-nos (MAPKs), y su participación en la proliferación de estas células. Los estudios realizados demuestran que las células osteoblásticas presentan un sitio de unión específico para el ALN, que es reversible, saturable y de alta afinidad. Mediante ensayos de ligado en células (HeLa) que no expresan conexina 43 (Cx43), se determinó que esta proteína no es necesaria para la unión del BP a la célula. Además, el ligado específico en osteoblastos cuya Cx43 basal se trató con desacoplantes de hemicanales demostró que la formación del conexón tampoco es necesaria para la unión del BP a la célula. Adicio-nalmente, se comprobó en ambas líneas celulares que el BP es capaz de ingresar, por un mecanismo aún no estudiado, observándose mayor distribución en citoplasma y región perinuclear. El desplazamiento de ALN ligado observado en presencia de sustratos de fosfatasas, evidenció a estas enzimas como posibles moléculas blanco de BP. A su vez, se demostró por primera vez la expresión basal de proteínas tirosina fosfatasas (PTPs) receptoras de membrana y citoplas-máticas en osteoblastos y se observó que ALN inhibió la actividad de todas las PTPs estudiadas, al igual que el conoci-do inhibidor de PTPs, ortovanadato. Tratamientos a tiempos cortos con ALN promovieron la fosforilación de las MAPKs ERK1/2, ERK5, p38 y p46 JNK, en forma dependiente del tiempo. De la misma manera que los inhibidores de fosfatasas, ortovanadato y fluoruro de sodio, el BP produjo un aumento en la proliferación, tanto de células ROS 17/2.8 como de aquellas que no expresan Cx43, a 48 h de tratamiento en forma dependiente de la dosis. Estos resultados en conjunto indican que si bien esta proteína es requerida en la acción anti-apoptótica del BP en osteocitos y osteoblastos según estudios previos, no es necesaria para el ligado de ALN a la célula como tampoco para su efecto proliferativo. Los resul-tados presentados en este trabajo de tesis son aportes originales al conocimiento del mecanismo de acción de los amino-BPs en células osteoblásticas y podrían ser de relevancia para la mejora de las terapias preventivas de enfermedades metabólicas óseas frecuentes. / The high affinity of bisphosphonates (BPs) for hydroxyapatite and their ability to inhibit bone resorption makes them the drug widely used in the clinic for the prevention and treatment of diseases in which osteoclast activity is exacer-bated. However, the precise mechanism of action of BPs, particularly in osteoblasts, has not yet been completely understood. In this thesis work it was investigated the existence of a receptor entity for the amino-BP alendronate (ALN) in ROS 17/2.8 osteoblastic cells, from which it induces a mechanism of intracellular signal transduction. In addition, the modulation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) signaling pathways induced by ALN and their involvement in the proliferation of osteoblasts were studied. The results reported here provide strong evidences that osteoblastic cells present a specific binding site, which is reversible and satu-rable, with high affinity for ALN. Binding assays in cells (HeLa) that do not express connexin 43 (Cx43), demonstrated that this protein is not necessary for BP binding to the cell. Furthermore, specific ALN binding to osteoblasts treated with agents that disassemble Cx43 hemichannels showed that the pore formation is not either required for BP binding to the cell. Additionally, both cell lines internalized ALN from solution, by a mechanism not yet studied, showing a wide distribution in cytosol and peri-nuclear region. The displacement of ALN bound to ROS 17/2.8 cells by phosphatases substrates, suggests that these enzymes may be molecular targets. Moreover, it was demonstrated for the first time the basal expression of cytoplasmic and receptor-like protein tyrosine phosphatase (PTPs) in osteoblasts. Additionally, like the most frequently used PTP inhibitor, orthovanadate; ALN inhibited the phosphatase activity of all the PTPs evaluated. Short-term treatment with BP increased phosphorilation of ERK1/2, ERK5, p38 and p46 JNK MAPKs in a time-dependent manner. Like the PTPs inhibitors, orthovanadate and sodium fluoride, the BP induced an increase in osteoblastic cells proliferation, as well as in cells that do not express Cx43, in a dose-dependent manner after 48 h of treatment. These results altogether indicate that Cx43 is not necessary for the BP binding to the cell and the proliferative effect, even though this protein is required for the antiapoptotic action of ALN on osteoblasts and osteocytes. The results presented in this thesis work are original contributions to the knowledge of amino-BP mechanism of action on osteoblastic cells and may be of relevance to the improvement of the preventive therapies applied for common bone diseases.
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Proposição de estabelecimento dos protocolos de coleta de tecido ósseo, cultura primária e linhagem celular, e de caracterização de células humanas semelhantes a osteoblastos, oriundas da mandíbula

Zortéa Júnior, Alberto João January 2006 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. / Made available in DSpace on 2012-10-22T16:32:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 241825.pdf: 1265824 bytes, checksum: e3eddb973f6cbfc318b76c8783d96909 (MD5)
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Análise dos efeitos tóxicos dos tratamentos de periimplantite nos osteoblastos cultivados sobre diferentes tipos de superfícies de implantes

Benfatti, Cesar Augusto Magalhães January 2006 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. / Made available in DSpace on 2012-10-22T13:40:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T19:54:37Z : No. of bitstreams: 1 234090.pdf: 661881 bytes, checksum: dae7c636883271b4bb3bca7f0407d491 (MD5) / O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito dos tratamentos químicos de periimplantite nos osteoblastos cultivados sobre implantes com diferentes superfícies. Osteoblastos provenientes de uma cultura primária de ratos foram cultivados por 48 e 72 horas sobre implantes com superfície usinada (grupo 1), texturizada por ataque ácido (grupo 2) e por jateamento de partículas de óxido de alumínio mais ataque ácido (grupo 3), tratadas ou não com EDTA e ácido cítrico suplementado com tetraciclina. A toxicidade dos tratamentos de periimplantite foi determinada pela contagem do número de osteoblastos presentes na superfície dos implantes durante os dois períodos analisados. No período inicial os implantes submetidos aos tratamentos de descontaminação obtiveram um número de células significantemente menor do que os grupos controles, já com 72 horas houve uma tendência de igualar o número de células dos grupos experimentais quando comparados com os grupos controles. Os resultados mostram uma diminuição da toxicidade dos produtos testados com o passar do tempo e que após 48 horas essa toxicidade não é prejudicial à proliferação celular, sugerindo a viabilidade clínica da utilização desses produtos com o objetivo de tornar as superfícies implantares mais favoráveis aos tecidos. Contudo ainda serão necessários estudos adicionais para afirmar com segurança qual dos tratamentos é biologicamente melhor para cada tipo de superfície de implante e seus efeitos sobre a reparação tecidual in vivo.
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Efeito do ranelato de estrôncio na proliferação, viabilidade e ativação de osteoblastos murinos in vitro / Effect of strontium ranelate on the proliferation, viability and activation of murine osteoblasts in vitro

Bezerra, Ariel Valente 13 February 2017 (has links)
BEZERRA, A. V. Efeito do ranelato de estrôncio na proliferação, viabilidade e ativação de osteoblastos murinos in vitro. 55 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Morfofuncionais) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Programa de Pós Graduação em Ciências Morfofuncionais (pcmf.ufc@gmail.com) on 2017-11-28T12:14:43Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_avbezerra.pdf: 2366656 bytes, checksum: 838cff6e33710583d5948915908acda8 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-11-28T13:41:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_avbezerra.pdf: 2366656 bytes, checksum: 838cff6e33710583d5948915908acda8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-28T13:41:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_avbezerra.pdf: 2366656 bytes, checksum: 838cff6e33710583d5948915908acda8 (MD5) Previous issue date: 2017-02-13 / The bone tissue is classified as a specialized connective tissue composed by organic and inorganic matrix, osteoclasts and osteoblastic lineage cells. In pathologic procedures, the bone tissue’s homeostasis can be reestablished with some pharmacological therapies, as strontium ranelate, widely used to treat osteoporosis post menopause, because of its inhibitory effects over the osteoclasts and the activation of the osteoblasts. The mechanisms involved, however, are still not completely clarified. OBJECTIVES: This paper has as objective to evaluate the direct effect of strontium ranelate in murine proliferation and activation of osteoblasts, and the possible mechanisms involved. METHODOLOGY: To evaluate the viability and cell proliferation were performed trials of MTT and immunolabeling with Ki67, respectively, after 24 and 48 hours of osteoblasts’ incubation with strontium ranelate. For the MTT, it was used different concentrations of ranelate (0,01; 0,1; 1; 10; 100 and 1000 mM), and by the obtained results, two concentrations (0,01 and 0,1 mM) were selected for the next trials: immunolabeling with Ki67, Western Blot to investigate the protein expression of BMP2, SMAD2/3OPG, RANKL, and alkaline phosphatase (FAO). It was still performed the quantification of the levels of FAO in a culture medium, using specific kits of LABTEST®, after 24, 48, 72 and 120 hours of incubation with strontium ranelate. The mineralization was evaluated by the von Kossa Staining Protocol for Calcium among 7, 14, and 21 days. RESULTS: A significant increase of the viability of osteoblasts was observed after these cells incubation with 0,01 and 0,1 mM of strontium ranelate for 24 hours. BMP2 increased significantly in these two concentrations of the drug used in the period of 24 hours by the Western Blot trial. In the trial to measure the FAO in culture medium, it was observed a significant increase of FAO after incubation with 0,1mM of ranelate for 24 hours. In the von Kossa trial, it was observed an increase and acceleration of mineralization in concentrations of 0,01 and 0,1 mM.CONCLUSION: The results suggest a positive effect of the strontium ranelate in proliferation, viability, and activation of osteoblasts, possibly because of the higher expression of BMP and FAO by osteoblasts. Therefore, promising studies can be performed with the strontium ranelate with its application in regenerating bone defects. / O tecido ósseo é classificado como um tecido conjuntivo especializado composto por matriz orgânica e inorgânica, osteoclastos e células da linhagem osteoblástica. Nos processos patológicos, a homeostasia do tecido ósseo pode ser reestabelecida com algumas terapias farmacológicas como o Ranelato de estrôncio, já largamente utilizado para tratamento da osteoporose pós-menorpausa, devido seus efeitos inibitórios sobre os osteoclastos e ativação de osteoblastos. Os mecanismos envolvidos, no entanto, ainda não foram completamente esclarecidos. OBJETIVOS: Este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito direto do ranelato de estrôncio na proliferação e ativação de osteoblastos murinos, e os possíveis mecanismos envolvidos. METODOLOGIA: Para a avaliação da viabilidade e proliferação celular foram realizados os ensaios de MTT e imunomarcação com Ki67, respectivamente, após 24 e 48 horas de incubação dos osteoblastos com ranelato de estrôncio. Para o MTT foram utilizadas diferentes concentrações de ranelato (0,01; 0,1; 1; 10; 100 e 1000 mM), e a partir dos resultados obtidos, duas concentrações (0,01 e 0,1 mM) foram selecionadas para os ensaios posteriores: imunomarcação com Ki67, Western Blot para investigar a.expressão proteica de BMP2, SMAD2/3, OPG, RANKL e fosfatase alcalina (FAO) . Foi realizado, ainda, a quantificação dos níveis de FAO no meio de cultura, utilizando “kits” específicos da LABTEST®, após 24, 48, 72 e 120h de incubação com ranelato de estrôncio. A mineralização foi avaliada pelo teste de Von Kossa nos períodos de 7, 14 e 21 dias. RESULTADOS: Um aumento significativo na viabilidade de osteoblastos foi observado após a incubação dessas células com 0,01 e 0,1mM de ranelato de estrôncio por 24h, assim como um aumento importante na proliferação celular com a dose de 0,01 mM no período de 24h. A BMP2 aumentou de forma significativa nas duas concentrações da droga utilizadas no período de 24 pelo ensaio de Western Blot. No ensaio para a dosagem de FAO no meio de cultura, foi observado aumento significativo de FAO após a incubação com 0,1mM de ranelato em 24 horas. No ensaio de Von Kossa foi observada aumento e aceleração da mineralização nas concentrações de 0,01 e 0,1 mM. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem um efeito positivo do ranelato de estrôncio na proliferação, viabilidade e ativação de osteoblastos, uma vez que aumentou a expressão de BMP e FAO pelos osteoblastos. Desse modo, estudos promissores podem ser realizados com o ranelato de estrôncio com o seu emprego na regeneração de defeitos ósseos.

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