A oleuropeína é o composto fenólico mais abundante presente nas folhas da oliveira, sendo que muitos estudos vêm demonstrando que este composto apresenta importantes propriedades antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, entre outras, surgindo o interesse em estudos de métodos para sua extração e aplicação em produtos na área alimentícia, cosmética e farmacêutica. O objetivo deste estudo foi a extração da oleuropeína à partir de folhas de oliva, utilizando solvente não tóxico, para posterior aplicação dos extratos em óleos vegetais a fim de se verificar seu efeito sobre a estabilidade oxidativa dos mesmos. O solvente selecionado para o estudo foi uma mistura de etanol e água (70:30, em massa, condição obtida através de um trabalho prévio), na presença de 1 % de ácido acético. Em uma primeira etapa, foram realizados experimentos de extração utilizando-se as técnicas de maceração (tipo I) e ultrassom (tipo II), em diferentes condições de temperatura (20, 30, 40, 50 e 60°C). Em uma segunda etapa, através de experimentos com maceração à temperatura ambiente, estudou-se o efeito da razão folhas:solvente (1:8, 1:6 e 1:3) e a influência da presença de ácido acético sobre o processo de extração (tipo III). Por fim, realizando-se a maceração na presença de ácido acético, temperatura ambiente e proporção folhas: solvente igual a 1:3, realizaram-se extrações sequenciadas a partir de uma mesma matéria-prima (tipo IV). Os resultados desses experimentos foram expressos em rendimento de oleuropeína (RO), teor de oleuropeína nos extratos (TO) e rendimento global (RG). Analisando-se os experimentos I e II, verificou-se que a temperatura não exerceu influência significativa sobre as respostas RO, TO e RG. Além disso, verificou-se que os valores das respostas para os experimentos com a maceração foram um pouco maiores do que os valores obtidos para as extrações com o auxílio do ultrassom. Nos experimentos tipo III, em linhas gerais, observou-se a influência positiva da presença do ácido acético sobre as respostas estudadas. Verificou-se também que, na presença de ácido, o aumento da quantidade de solvente na extração conduz ao aumento de RO e RG, e à diminuição de TO. Através do experimento tipo IV, constatou-se que mesmo após quatro extrações sequenciadas, ainda não foi possível esgotar a oleuropeína da matéria-prima. Após a obtenção de todos os extratos hidroalcoólicos, selecionou-se um contendo aproximadamente 19 % de oleuropeína para o estudo da estabilidade oxidativa em óleos vegetais (oliva e girassol) utilizando o método Rancimat. A presença de extrato aumentou em 3 horas o tempo de indução do azeite de oliva extra-virgem, e em 2 horas o tempo de indução do azeite de oliva comum. Os óleos de girassol bruto e refinado não apresentaram melhora na estabilidade oxidativa quando adicionados dos extratos. Foram realizados também testes de estabilidade oxidativa através da adição direta de folhas de oliva em pó nos azeites de oliva extra-virgem e comum. Para o azeite extra-virgem, a adição das folhas não proporcionou melhora da estabilidade oxidativa, porém para o azeite comum, houve um aumento de mais de 2 horas no tempo de indução.Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que é possível obter extratos contendo teores significativos de oleuropeína utilizando-se um solvente renovável. Além disso, constatou-se que os mesmos podem ser utilizados como um antioxidante natural em azeite de oliva, melhorando sua estabilidade oxidativa. / Oleuropein is the most abundant phenolic compound present in the leaves of the olive tree, and many studies have shown that this compound has significant antimicrobial properties, antioxidant, anti-inflammatory, among others, emerging interest in studies of methods for extraction and use in products in the food industry, cosmetics and pharmaceuticals. The aim of this study was the extraction of oleuropein from the olive leaf, using non-toxic solvent, for further application of the extracts in vegetable oils in order to check its effect on their oxidative stability. The solvent selected for the study was a mixture of ethanol and water (70:30, % mass, condition obtained from a previous study), in the presence of 1 % acetic acid. In a first step, extraction experiments were conducted using maceration (type I) and ultrasound (type II) under different temperature conditions (20, 30, 40, 50 and 60 ° C). In a second step, through experiments with maceration at room temperature, the effect of the ratio olive leaves:solvent (1:8, 1:6 and 1:3) and the influence of the presence of acetic acid on the process of extraction (type III) was studied. Finally, using maceration in the presence of acetic acid at room temperature and proportion olive leaves:solvent of 1:3, sequencial extractions from the same raw material (type IV) were performed. The results of these experiments were expressed in oleuropein yield (RO), oleuropein content in extracts (TO) and global yield (RG). Analyzing the experiments I and II, it was found that the temperature did not have significant influence on the RO, TO and RG values. Furthermore, it was found the response values for the experiments with maceration was somewhat higher than values obtained for extractions using ultrasound. In type III trials, in general, a positive influence of the presence of acetic acid in the studied answers were observed. It was also found that in the presence of acid, higher amount of solvent leads to an increase of RO and RG values, and a decrease of TO value. Through the experiment type IV, it was found that even after four sequential extractions, it was not possible to exhaust oleuropein raw material. After obtaining all the hydroalcoholic extracts, na extract contanining approximately 19 % of oleuropein was selected for the study of oxidative stability of vegetable oils (olive and sunflower oil), using the Rancimat method. The presence of extract increased in 3 hours the induction time of extra-virgin olive oil, and in 2 hours the induction time of common olive oil. Crude and refined sunflower oils showed no improvement in the oxidative stability when added to the extracts. Oxidative stability tests were also performed by direct addition of olive leaf powder in extra virgin and common olive oil. For extra virgin olive oil, the addition of the powder leaves did not improve the oxidative stability, but for the common oil, an increase of more than 2 hours in induction time was observed. Results demonstrated that it is possible to obtain extracts containing significant concentrations of oleuropein using a renewable solvent. Furthermore, it was found that it can be used as a natural antioxidant in olive oil, improving its oxidative stability.

Este estudo avaliou a eficiência da oleuropeína (OLE) (composto fenólico extraído das folhas de Oliveira) isolada e associada aos sanitizantes comerciais ácido peracético 2% (APA), hipoclorito de sódio 2% (HS), peróxido de hidrogênio 3% (PH), digluconato de clorexidina 2% (DC), cloreto de benzalcônio 1% (CB) e iodofor 2% (IO), para inativação de células em suspensão e biofilmes monoespécie e multiespécie formados em superfícies de aço inoxidável ou microplaca de poliestireno por Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922), todas classificadas como fortes produtores de biofilmes. Os isolados foram semeados em caldo TSB (caldo tripticase soja), incubados (37°C/24h) e corrigidos a ~108células/mL (escala 0,5 McFarland). Para bactérias em suspensão, a resistência a sanitizantes foi determinada pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) em tubos e pelo método de Disco Difusão em Ágar (DDA), no qual as bactérias foram plaqueadas em ágar TSA contendo discos de 6mm de papel filtro embebidos nos sanitizantes. Após a incubação, a medição dos halos de inibição foi feita com paquímetro. Para os ensaios de resistência dos biofilmes aos compostos sanitizantes, foram utilizadas microplacas de poliestireno 96 poços, as quais foram preparadas para incubação-fixação dos biofilmes e submetidas à leitura em espectrofotômetro de ELISA (600 nm). Em seguida, as placas foram lavadas com solução salina tamponada (PBS, pH 7.4) e os sanitizantes inseridos por 1 minuto. Após neutralização com tiossulfato de sódio (5 minutos), as placas foram lavadas com PBS e metanol, coradas com cristal violeta 1% e coradas com ácido acético glacial (33%) para nova leitura a 570nm. A eficácia da remoção do biofilme pelos sanitizantes foi comparada pelo índice de formação de biofilme (IFB). As imagens do aço inoxidável após tratamento com sanitizante foram feitas através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Microscopia Confocal, para visualizar a persistência dos biofilmes. Os valores de CIM (diluição 1:2) mostraram que OLE não teve atividade bactericida. No método DDA, L. monocytogenes, foi resistente à OLE, enquanto E. coli e S. aureus apresentaram resistência intermediária. Os sanitizantes comerciais apresentaram boa atividade bactericida nos ensaios de CIM e DDA, sendo que as associações de OLE aos sanitizantes comerciais aumentaram o efeito germicida. Nos ensaios com biofilmes em monoespécie, somente os sanitizantes comerciais, isolados ou associados com OLE, foram eficazes de reduzir o valor de BFI em microplaca de poliestireno. Em biofilmes multiespécie, OLE apresentou efeito antimicrobiano, sobretudo sobre a associação de L. monocytogenes + E. coli + S. aureus (redução: 91,49%). Nenhum dos compostos avaliados foi capaz de inativar completamente os biofilmes nas superfícies de aço inoxidável, uma vez que células viáveis foram observadas após os tratamentos com os sanitizantes, indicando persistência dos biofilmes. Os resultados indicam que a oleuropeína apresentou potencial para incrementar o efeito bactericida de sanitizantes comerciais para eliminação de biofilmes em superfícies inertes, sendo necessários estudos para compreender os mecanismos de ação dessas combinações. / This study evaluated the efficiency of oleuropein (OLE) (a phenolic compound extracted from Oliveira leaves) alone or in association with commercial sanitizers peracetic acid 2% (PPA), sodium hypochlorite 2% (SH), hydrogen peroxide 3% (HP), chlorhexidine digluconate 2% (CD), benzalkonium chloride 1% (BC) and iodophor 2% (IO), for inactivation of suspended cells and monospecies or multispecies biofilms formed on stainless steel surfaces or microplate polystyrene by Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25922), all classified as strong producers of biofilms. The isolates were grown in TSB (trypticase soy broth), incubated (37°C/24 h) and adjusted to ~108 cells/mL (0.5 McFarland scale). For the bacterial suspensions, resistance to sanitizers was determined by Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in tubes and by Agar Disk Diffusion (ADD), in which the bacteria were plated on TSA agar containing 6mm disks of filter paper soaked in sanitizers. After incubation, measurement of the inhibition halos was done using a caliper rule. For the sanitizer resistance assays with biofilms, polystyrene 96-well microplates were prepared for incubation-fixing of biofilms and read in an ELISA spectrophotometer (600 nm). After, the plates were washed with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) and the sanitizers were placed for 1 minute. After neutralization with sodium thiosulfate (5 minutes), the plates were washed with PBS and methanol, stained with 1% crystal violet and stained with glacial acetic acid (33%) for a new reading at 570 nm. The effectiveness of biofilm removal by each sanitizer was compared using a Biofilm Formation Index (IFB). The images from stainless steel coupons after treatments with sanitizers were obtained by Scanning Electron Microscopy (SEM) and Confocal Microscopy, to view the persistence of biofilms. MIC values (dilution 1: 2) showed that OLE had no bactericidal activity. In the ADD assays, L. monocytogenes was resistant to OLE, while E. coli and S. aureus showed intermediate resistance. Commercial sanitizers showed good bactericidal activity in both CIM and DDA assays, and the associations of OLE with commercial sanitizers increased their germicidal effect. In the monospecies biofilm assays, only commercial sanitizers, isolated or associated with OLE, were effective for reducing the BFI values in polystyrene microplates. In multispecies biofilms, OLE had an antimicrobial effect, especially on the association of L. monocytogenes + E. coli and S. aureus (reduction: 91.49%). None of the compounds evaluated was able to completely inactivate the biofilms on the stainless steel surfaces, since viable cells of bacteria were observed after treatment with sanitizers, indicating persistence of biofilms. The results indicate that oleuropein has the potential to enhance the bactericidal effect of commercial sanitizers to eliminate biofilms on inert surfaces. Further studies are needed to understand the mechanisms of action of these combinations.

Este estudo avaliou a eficiência da oleuropeína (OLE) (composto fenólico extraído das folhas de Oliveira) isolada e associada aos sanitizantes comerciais ácido peracético 2% (APA), hipoclorito de sódio 2% (HS), peróxido de hidrogênio 3% (PH), digluconato de clorexidina 2% (DC), cloreto de benzalcônio 1% (CB) e iodofor 2% (IO), para inativação de células em suspensão e biofilmes monoespécie e multiespécie formados em superfícies de aço inoxidável ou microplaca de poliestireno por Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922), todas classificadas como fortes produtores de biofilmes. Os isolados foram semeados em caldo TSB (caldo tripticase soja), incubados (37°C/24h) e corrigidos a ~108células/mL (escala 0,5 McFarland). Para bactérias em suspensão, a resistência a sanitizantes foi determinada pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) em tubos e pelo método de Disco Difusão em Ágar (DDA), no qual as bactérias foram plaqueadas em ágar TSA contendo discos de 6mm de papel filtro embebidos nos sanitizantes. Após a incubação, a medição dos halos de inibição foi feita com paquímetro. Para os ensaios de resistência dos biofilmes aos compostos sanitizantes, foram utilizadas microplacas de poliestireno 96 poços, as quais foram preparadas para incubação-fixação dos biofilmes e submetidas à leitura em espectrofotômetro de ELISA (600 nm). Em seguida, as placas foram lavadas com solução salina tamponada (PBS, pH 7.4) e os sanitizantes inseridos por 1 minuto. Após neutralização com tiossulfato de sódio (5 minutos), as placas foram lavadas com PBS e metanol, coradas com cristal violeta 1% e coradas com ácido acético glacial (33%) para nova leitura a 570nm. A eficácia da remoção do biofilme pelos sanitizantes foi comparada pelo índice de formação de biofilme (IFB). As imagens do aço inoxidável após tratamento com sanitizante foram feitas através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Microscopia Confocal, para visualizar a persistência dos biofilmes. Os valores de CIM (diluição 1:2) mostraram que OLE não teve atividade bactericida. No método DDA, L. monocytogenes, foi resistente à OLE, enquanto E. coli e S. aureus apresentaram resistência intermediária. Os sanitizantes comerciais apresentaram boa atividade bactericida nos ensaios de CIM e DDA, sendo que as associações de OLE aos sanitizantes comerciais aumentaram o efeito germicida. Nos ensaios com biofilmes em monoespécie, somente os sanitizantes comerciais, isolados ou associados com OLE, foram eficazes de reduzir o valor de BFI em microplaca de poliestireno. Em biofilmes multiespécie, OLE apresentou efeito antimicrobiano, sobretudo sobre a associação de L. monocytogenes + E. coli + S. aureus (redução: 91,49%). Nenhum dos compostos avaliados foi capaz de inativar completamente os biofilmes nas superfícies de aço inoxidável, uma vez que células viáveis foram observadas após os tratamentos com os sanitizantes, indicando persistência dos biofilmes. Os resultados indicam que a oleuropeína apresentou potencial para incrementar o efeito bactericida de sanitizantes comerciais para eliminação de biofilmes em superfícies inertes, sendo necessários estudos para compreender os mecanismos de ação dessas combinações. / This study evaluated the efficiency of oleuropein (OLE) (a phenolic compound extracted from Oliveira leaves) alone or in association with commercial sanitizers peracetic acid 2% (PPA), sodium hypochlorite 2% (SH), hydrogen peroxide 3% (HP), chlorhexidine digluconate 2% (CD), benzalkonium chloride 1% (BC) and iodophor 2% (IO), for inactivation of suspended cells and monospecies or multispecies biofilms formed on stainless steel surfaces or microplate polystyrene by Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25922), all classified as strong producers of biofilms. The isolates were grown in TSB (trypticase soy broth), incubated (37°C/24 h) and adjusted to ~108 cells/mL (0.5 McFarland scale). For the bacterial suspensions, resistance to sanitizers was determined by Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in tubes and by Agar Disk Diffusion (ADD), in which the bacteria were plated on TSA agar containing 6mm disks of filter paper soaked in sanitizers. After incubation, measurement of the inhibition halos was done using a caliper rule. For the sanitizer resistance assays with biofilms, polystyrene 96-well microplates were prepared for incubation-fixing of biofilms and read in an ELISA spectrophotometer (600 nm). After, the plates were washed with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) and the sanitizers were placed for 1 minute. After neutralization with sodium thiosulfate (5 minutes), the plates were washed with PBS and methanol, stained with 1% crystal violet and stained with glacial acetic acid (33%) for a new reading at 570 nm. The effectiveness of biofilm removal by each sanitizer was compared using a Biofilm Formation Index (IFB). The images from stainless steel coupons after treatments with sanitizers were obtained by Scanning Electron Microscopy (SEM) and Confocal Microscopy, to view the persistence of biofilms. MIC values (dilution 1: 2) showed that OLE had no bactericidal activity. In the ADD assays, L. monocytogenes was resistant to OLE, while E. coli and S. aureus showed intermediate resistance. Commercial sanitizers showed good bactericidal activity in both CIM and DDA assays, and the associations of OLE with commercial sanitizers increased their germicidal effect. In the monospecies biofilm assays, only commercial sanitizers, isolated or associated with OLE, were effective for reducing the BFI values in polystyrene microplates. In multispecies biofilms, OLE had an antimicrobial effect, especially on the association of L. monocytogenes + E. coli and S. aureus (reduction: 91.49%). None of the compounds evaluated was able to completely inactivate the biofilms on the stainless steel surfaces, since viable cells of bacteria were observed after treatment with sanitizers, indicating persistence of biofilms. The results indicate that oleuropein has the potential to enhance the bactericidal effect of commercial sanitizers to eliminate biofilms on inert surfaces. Further studies are needed to understand the mechanisms of action of these combinations.

A oleuropeína é o composto fenólico mais abundante presente nas folhas da oliveira, sendo que muitos estudos vêm demonstrando que este composto apresenta importantes propriedades antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, entre outras, surgindo o interesse em estudos de métodos para sua extração e aplicação em produtos na área alimentícia, cosmética e farmacêutica. O objetivo deste estudo foi a extração da oleuropeína à partir de folhas de oliva, utilizando solvente não tóxico, para posterior aplicação dos extratos em óleos vegetais a fim de se verificar seu efeito sobre a estabilidade oxidativa dos mesmos. O solvente selecionado para o estudo foi uma mistura de etanol e água (70:30, em massa, condição obtida através de um trabalho prévio), na presença de 1 % de ácido acético. Em uma primeira etapa, foram realizados experimentos de extração utilizando-se as técnicas de maceração (tipo I) e ultrassom (tipo II), em diferentes condições de temperatura (20, 30, 40, 50 e 60°C). Em uma segunda etapa, através de experimentos com maceração à temperatura ambiente, estudou-se o efeito da razão folhas:solvente (1:8, 1:6 e 1:3) e a influência da presença de ácido acético sobre o processo de extração (tipo III). Por fim, realizando-se a maceração na presença de ácido acético, temperatura ambiente e proporção folhas: solvente igual a 1:3, realizaram-se extrações sequenciadas a partir de uma mesma matéria-prima (tipo IV). Os resultados desses experimentos foram expressos em rendimento de oleuropeína (RO), teor de oleuropeína nos extratos (TO) e rendimento global (RG). Analisando-se os experimentos I e II, verificou-se que a temperatura não exerceu influência significativa sobre as respostas RO, TO e RG. Além disso, verificou-se que os valores das respostas para os experimentos com a maceração foram um pouco maiores do que os valores obtidos para as extrações com o auxílio do ultrassom. Nos experimentos tipo III, em linhas gerais, observou-se a influência positiva da presença do ácido acético sobre as respostas estudadas. Verificou-se também que, na presença de ácido, o aumento da quantidade de solvente na extração conduz ao aumento de RO e RG, e à diminuição de TO. Através do experimento tipo IV, constatou-se que mesmo após quatro extrações sequenciadas, ainda não foi possível esgotar a oleuropeína da matéria-prima. Após a obtenção de todos os extratos hidroalcoólicos, selecionou-se um contendo aproximadamente 19 % de oleuropeína para o estudo da estabilidade oxidativa em óleos vegetais (oliva e girassol) utilizando o método Rancimat. A presença de extrato aumentou em 3 horas o tempo de indução do azeite de oliva extra-virgem, e em 2 horas o tempo de indução do azeite de oliva comum. Os óleos de girassol bruto e refinado não apresentaram melhora na estabilidade oxidativa quando adicionados dos extratos. Foram realizados também testes de estabilidade oxidativa através da adição direta de folhas de oliva em pó nos azeites de oliva extra-virgem e comum. Para o azeite extra-virgem, a adição das folhas não proporcionou melhora da estabilidade oxidativa, porém para o azeite comum, houve um aumento de mais de 2 horas no tempo de indução.Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que é possível obter extratos contendo teores significativos de oleuropeína utilizando-se um solvente renovável. Além disso, constatou-se que os mesmos podem ser utilizados como um antioxidante natural em azeite de oliva, melhorando sua estabilidade oxidativa. / Oleuropein is the most abundant phenolic compound present in the leaves of the olive tree, and many studies have shown that this compound has significant antimicrobial properties, antioxidant, anti-inflammatory, among others, emerging interest in studies of methods for extraction and use in products in the food industry, cosmetics and pharmaceuticals. The aim of this study was the extraction of oleuropein from the olive leaf, using non-toxic solvent, for further application of the extracts in vegetable oils in order to check its effect on their oxidative stability. The solvent selected for the study was a mixture of ethanol and water (70:30, % mass, condition obtained from a previous study), in the presence of 1 % acetic acid. In a first step, extraction experiments were conducted using maceration (type I) and ultrasound (type II) under different temperature conditions (20, 30, 40, 50 and 60 ° C). In a second step, through experiments with maceration at room temperature, the effect of the ratio olive leaves:solvent (1:8, 1:6 and 1:3) and the influence of the presence of acetic acid on the process of extraction (type III) was studied. Finally, using maceration in the presence of acetic acid at room temperature and proportion olive leaves:solvent of 1:3, sequencial extractions from the same raw material (type IV) were performed. The results of these experiments were expressed in oleuropein yield (RO), oleuropein content in extracts (TO) and global yield (RG). Analyzing the experiments I and II, it was found that the temperature did not have significant influence on the RO, TO and RG values. Furthermore, it was found the response values for the experiments with maceration was somewhat higher than values obtained for extractions using ultrasound. In type III trials, in general, a positive influence of the presence of acetic acid in the studied answers were observed. It was also found that in the presence of acid, higher amount of solvent leads to an increase of RO and RG values, and a decrease of TO value. Through the experiment type IV, it was found that even after four sequential extractions, it was not possible to exhaust oleuropein raw material. After obtaining all the hydroalcoholic extracts, na extract contanining approximately 19 % of oleuropein was selected for the study of oxidative stability of vegetable oils (olive and sunflower oil), using the Rancimat method. The presence of extract increased in 3 hours the induction time of extra-virgin olive oil, and in 2 hours the induction time of common olive oil. Crude and refined sunflower oils showed no improvement in the oxidative stability when added to the extracts. Oxidative stability tests were also performed by direct addition of olive leaf powder in extra virgin and common olive oil. For extra virgin olive oil, the addition of the powder leaves did not improve the oxidative stability, but for the common oil, an increase of more than 2 hours in induction time was observed. Results demonstrated that it is possible to obtain extracts containing significant concentrations of oleuropein using a renewable solvent. Furthermore, it was found that it can be used as a natural antioxidant in olive oil, improving its oxidative stability.

A oleuropeína é o mais abundante biofenol presente nas folhas de oliveira (Olea Europaea), com importantes funções antimicrobiana e antioxidante. Estudos visando à obtenção deste composto têm sido conduzidos, porém, muitos deles utilizam solventes tóxicos e métodos caros. A presente dissertação teve por objetivo estudar diferentes metodologias para a obtenção de extratos de folhas de oliva contendo quantidades significativas de oleuropeína. Os extratos foram obtidos a partir de folhas de oliva micronizadas, com ou sem pré-tratamento para redução do teor de clorofila, submetidas a contatos simples ou múltiplos com diferentes solventes, como dietil éter, clorofórmio, acetona, etanol, 1-propanol, 2-propanol, água e soluções hidroalcoólicas com diferentes concentrações. O contato das folhas micronizadas com os solventes foi promovido pelos seguintes métodos: agitação manual em temperatura ambiente, agitação mecânica a 50 ºC, ultrassom ou uma combinação desses dois últimos, totalizando 38 experimentos, sendo que em 17 destes os extratos foram produzidos na forma líquida e 21 na forma sólida. Os resultados mostraram que, de maneira geral, a etapa prévia de redução do teor da clorofila (realizada através de sucessivos contatos com hexano, diclorometano ou ainda, com CO2 supercrítico) não foi vantajosa, devido à elevada quantidade de solventes utilizados em relação às quantidades de extratos obtidos. Nestes experimentos, a maior concentração de oleuropeína, 1,88%, foi detectada no procedimento em que as folhas micronizadas foram previamente umedecidas com etanol e limpas com CO2 supercrítico, e posteriormente colocadas em contato com a mistura etanol e água, na proporção 1:1, utilizando o ultrassom combinado com a agitação mecânica como método de extração. Nos experimentos finais do trabalho, foi estudada ainda a adição de ácidos orgânicos (cítrico ou acético), juntamente com os solventes hidroalcoólicos (diferentes teores de água) no momento da extração da oleuropeína em banho de ultrassom, utilizando amostras que não foram previamente tratadas para remoção da clorofila. A combinação do ácido acético com a solução etanólica contendo 30 % de água resultou em um extrato com 2,17 % de oleuropeína, em apenas 1 contato com o solvente. Quando três contatos foram utilizados, nestas mesmas condições, o teor de oleuropeína aumentou para 4,8 %, maior do que alguns valores encontrados na literatura, utilizando o mesmo método de extração, indicando que processo ainda pode ser otimizado, utilizando técnicas simples e solventes que não agridam o meio ambiente. / Oleuropein is the most abundant biofenol present in olive leaves (Olea europaea), presenting important antioxidant and antimicrobial functions. Studies focusing on obtaining this compound have been conducted; however, many of them use toxic solvents and expensive methods. The present work aimed to study different methodologies for obtaining extracts from olive leaves containing significant amounts of oleuropein. The extracts were obtained from micronized olive leaves, with or without pretreatment for reducing the chlorophyll content, submitted to single and multiple contacts with different solvents such as diethyl ether, chloroform, acetone, ethanol, 1- propanol, 2 -propanol, water and hydroalcoholic solutions at different concentrations. The contact between the micronized leaves and the solvents was promoted by the following methods: manual shaking at room temperature, mechanical agitation at 50 °C, ultrasound or a combination of these last two methods, totaling 38 experiments, from which in 17 of them the extracts were produced in the liquid form, and in 21 in the solid form (as a powder). The results show that, in general, previous step of reducing the content of chlorophyll (performed by successive contacts with hexane, dichloromethane or with supercritical CO2) was not advantageous due to the high amount of solvent used in relation to amounts of extracts. In these experiments, the highest concentration of oleuropein, 1.88 % was detected in the procedure in which the micronized leaves were previously soaked with ethanol and cleaned with supercritical CO2 and then placed in contact with the mixture of ethanol and water in the proportion 1:1, using ultrasound combined with mechanical agitation as extraction method. In the last experiments of the work, the addition of organic acids (citric or acetic acid) together with hydroalcoholic solvents (different water contents) in the extraction of oleuropein in ultrasound was studied, using samples that have not previously been treated for removal of chlorophyll. The combination of acetic acid to the ethanolic solution containing 30 % of water resulted in an extract with 2.17 % of oleuropein, with only one contact to the solvent. When three contacts were used, under the same conditions, the oleuropein content increased to 4.8 %, larger than some values found in the literature, using the same extraction method, indicating that the process can be further optimized using simple techniques and solvents that do not harm the environment.

A oleuropeína é o mais abundante biofenol presente nas folhas de oliveira (Olea Europaea), com importantes funções antimicrobiana e antioxidante. Estudos visando à obtenção deste composto têm sido conduzidos, porém, muitos deles utilizam solventes tóxicos e métodos caros. A presente dissertação teve por objetivo estudar diferentes metodologias para a obtenção de extratos de folhas de oliva contendo quantidades significativas de oleuropeína. Os extratos foram obtidos a partir de folhas de oliva micronizadas, com ou sem pré-tratamento para redução do teor de clorofila, submetidas a contatos simples ou múltiplos com diferentes solventes, como dietil éter, clorofórmio, acetona, etanol, 1-propanol, 2-propanol, água e soluções hidroalcoólicas com diferentes concentrações. O contato das folhas micronizadas com os solventes foi promovido pelos seguintes métodos: agitação manual em temperatura ambiente, agitação mecânica a 50 ºC, ultrassom ou uma combinação desses dois últimos, totalizando 38 experimentos, sendo que em 17 destes os extratos foram produzidos na forma líquida e 21 na forma sólida. Os resultados mostraram que, de maneira geral, a etapa prévia de redução do teor da clorofila (realizada através de sucessivos contatos com hexano, diclorometano ou ainda, com CO2 supercrítico) não foi vantajosa, devido à elevada quantidade de solventes utilizados em relação às quantidades de extratos obtidos. Nestes experimentos, a maior concentração de oleuropeína, 1,88%, foi detectada no procedimento em que as folhas micronizadas foram previamente umedecidas com etanol e limpas com CO2 supercrítico, e posteriormente colocadas em contato com a mistura etanol e água, na proporção 1:1, utilizando o ultrassom combinado com a agitação mecânica como método de extração. Nos experimentos finais do trabalho, foi estudada ainda a adição de ácidos orgânicos (cítrico ou acético), juntamente com os solventes hidroalcoólicos (diferentes teores de água) no momento da extração da oleuropeína em banho de ultrassom, utilizando amostras que não foram previamente tratadas para remoção da clorofila. A combinação do ácido acético com a solução etanólica contendo 30 % de água resultou em um extrato com 2,17 % de oleuropeína, em apenas 1 contato com o solvente. Quando três contatos foram utilizados, nestas mesmas condições, o teor de oleuropeína aumentou para 4,8 %, maior do que alguns valores encontrados na literatura, utilizando o mesmo método de extração, indicando que processo ainda pode ser otimizado, utilizando técnicas simples e solventes que não agridam o meio ambiente. / Oleuropein is the most abundant biofenol present in olive leaves (Olea europaea), presenting important antioxidant and antimicrobial functions. Studies focusing on obtaining this compound have been conducted; however, many of them use toxic solvents and expensive methods. The present work aimed to study different methodologies for obtaining extracts from olive leaves containing significant amounts of oleuropein. The extracts were obtained from micronized olive leaves, with or without pretreatment for reducing the chlorophyll content, submitted to single and multiple contacts with different solvents such as diethyl ether, chloroform, acetone, ethanol, 1- propanol, 2 -propanol, water and hydroalcoholic solutions at different concentrations. The contact between the micronized leaves and the solvents was promoted by the following methods: manual shaking at room temperature, mechanical agitation at 50 °C, ultrasound or a combination of these last two methods, totaling 38 experiments, from which in 17 of them the extracts were produced in the liquid form, and in 21 in the solid form (as a powder). The results show that, in general, previous step of reducing the content of chlorophyll (performed by successive contacts with hexane, dichloromethane or with supercritical CO2) was not advantageous due to the high amount of solvent used in relation to amounts of extracts. In these experiments, the highest concentration of oleuropein, 1.88 % was detected in the procedure in which the micronized leaves were previously soaked with ethanol and cleaned with supercritical CO2 and then placed in contact with the mixture of ethanol and water in the proportion 1:1, using ultrasound combined with mechanical agitation as extraction method. In the last experiments of the work, the addition of organic acids (citric or acetic acid) together with hydroalcoholic solvents (different water contents) in the extraction of oleuropein in ultrasound was studied, using samples that have not previously been treated for removal of chlorophyll. The combination of acetic acid to the ethanolic solution containing 30 % of water resulted in an extract with 2.17 % of oleuropein, with only one contact to the solvent. When three contacts were used, under the same conditions, the oleuropein content increased to 4.8 %, larger than some values found in the literature, using the same extraction method, indicating that the process can be further optimized using simple techniques and solvents that do not harm the environment.