O receptor ativado do peroxissomo γ (PPAR-γ) é regulador do metabolismo e diferenciação do tecido adiposo, sendo um alvo conhecido das tiazolidinedionas (TZD), utilizadas para o tratamento do diabetes tipo 2 (DM2). As TZD agem como um agente sensibilizador da ação da insulina nos tecidos periféricos e tem sido especulado que as TZDs podem ter um papel na função da célula , prevenindo perda de massa e melhorando a sua viabilidade a longo prazo. Este efeito seria supostamente mediado pela transcrição de genes que favoreceriam a lipólise, diminuindo o conteúdo intracelular de triglicérides e, portanto, diminuindo a lipotoxicidade. Entretanto, alguns estudos também mostraram efeito nulo ou mesmo deletério das TZDs sobre as ilhotas pancreáticas. Na realidade, o papel de genes-alvo para o PPAR- nas ilhotas pancreáticas é ainda pouco conhecido. Estudamos o perfil de expressão gênica induzido pelo tratamento com Pioglitazona (Pio), uma TZD aprovada e disponível para uso clínico no tratamento do DM2, em ilhotas pancreáticas murídeas em cultura primária, com concentrações normal e suprafisiológica de glicose no meio de cultura. As ilhotas foram obtidas de ratos wistar machos de dois meses de idade e isoladas pelo método do gradiente de Ficoll e então cultivadas em 5,6 mM ou 23 mM de glicose por 24h, sendo tratadas com Pio 10 M ou DMSO 0,1% (veículo). A Pioglitazona foi cedida pela Takeda Farmacêutica, Osaka, Japão. O RNA foi extraído com Trizol e purificado com o kit RNeasy (Qiagen). As amostras foram marcadas e hibridizadas no microarranjo de cDNA Mouse Panchip 13k, usando-se cinco replicatas biológicas diferentes para cada condição. A análise estatística dos dados do microarranjo foi feita com o uso do programa significance analysis of microarrays (SAM) com uso de taxa de descobrimento falso (FDR) de 20%. A análise das vias acometidas foi feita com o Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com). Os resultados de expressão gênica foram confirmados por RT-qPCR. Em concentração de 5,6 mM de glicose no meio de cultura, 101 genes foram modulados pela Pio, sendo 49 regulados para cima, com aumento de sua expressão na presença da droga e 52 genes regulados para baixo. Em 23 mM de glicose, 1.235 genes foram afetados, sendo 621 para cima e 623 para baixo. A comparação entre as duas condições revelou 74 genes que foram modulados em ambas as concentrações de glicose. A análise das vias biológicas alteradas mostrou que genes relacionados ao metabolismo de lípides foram modulados em ambas as concentrações de glicose. Em 23 mM foi ainda significativo o grupo de genes relacionados a ciclo celular e morte celular que tiveram sua expressão modificada pela presença da droga na cultura. Este dado demonstrou que além de seus efeitos conhecidos nos adipócitos, o sensibilizador de insulina Pioglitazona modula a expressão de genes nas ilhotas pancreáticas, especialmente na presença de concentrações suprafisiológicas de glicose, afetando notadamente genes relacionados ao metabolismo lipídico, sendo vários deles ligados a lipogênese, como Srebf1, Scd2 e Fabp4 cujas expressões aumentaram em ambas as concentrações de glicose. Além disso foi observado aumento na expressão de genes com atividade pró-apoptótica como Tnf, Bad, Bax, Caspase4, Fadd e Myc. A Pioglitazona parece induzir um perfil gênico desfavorável em ilhotas pancreáticas mantidas em cultura em concentrações suprafisiológicas de glicose. / Peroxisome proliferator-activator receptor-γ (PPAR-γ) is a target for thiazolidinedione (TZD) antidiabetic drugs and a regulator of adipose tissue differentiation and metabolism. TZD act as an insulin sensitizing agent on peripheral tissues. It has been speculated that TZD could play a role on beta-cell function, preventing loss and improving viability in the long-term. This effect is supposed to be mediated through a potential benefit against lipotoxicity, favouring lypolisis and decreasing intracellular tryglicerides content. Nevertheless some studies also showed a lack or even a potential deleterious effect of TZD on islets. The role of PPAR-γ target genes in pancreatic islets is actually still largely unclear. We studied the gene expression profile induced by the treatment with Pioglitazone (Pio), an approved TZD for T2DM therapy, on rat pancreatic islets primary culture both at normal and supraphysiological glucose medium concentrations. Islets were obtained from 2 month-old, male, wistar rats and isolated through the Ficoll gradient method and then cultured with 5.6 mM or 23 mM of glucose concentration for 24h, being treated with Pio 10 µM or DMSO 0.1% (vehicle). Pioglitazone was provided by Takeda Pharmaceuticals, Osaka, Japan. RNA was extracted with Trizol (Sigma) and purified with RNeasy kit (Qiagen). Samples were labeled and then hybridized on the Mouse PanChip 13k cDNA microarray, using 5 different biological replicates for each test condition. Statistical Analysis of the microarray data was performed using significance analysis of microarrays (SAM) with a false discovery rate of 20%. Pathways assessment was performed through Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com). Gene expression results were confirmed through RT-qPCR. At 5.6 mM glucose 101 genes were modulated by Pio, 49 upregulated and 52 downregulated. At 23 mM, 1,235 genes were affected, 612 upregulated and 623 downregulated. Comparison between both conditions revealed 74 genes that were similarly modulated at both glucose concentrations. Pathway analysis of perturbed genes revealed biologically relevant networks related to lipid metabolism at both glucose medium concentrations. At 23 mM, cell cycle and cell death pathways were significant modulated as well. These data demonstrates that in addition to known effect in adipocytes, the insulin sensitizing agent Pioglitazone modulates gene expression in pancreatic islets, especially in the presence of supraphysiological glucose concentrations, affecting especially lipid metabolism and mechanisms of cell death and cell cycle. Considering the ontology of modulated genes it seems to be a trend towards lypogenesis (increased Srebf1, Scd2 and Fabp4 RNA expressions) with Pio treatment also enhancing the abundance of some genes considered to be pro apoptotic like Tnf, Bad, Bax, Caspase4, Fadd and Myc. Pioglitazone seems to induce a negative gene expression profile in islets cultured at high glucose concentrations.

O presente trabalho teve por objetivo identificar fragmentos homólogos a genes de resistência em Brassica oleracea e Zea mays, por meio da amplificação por PCR, utilizando oligonucleotídeos homólogos a regiões conservadas de genes de resistência de plantas. Em B. oleracea, os oligonucleotídeos foram desenhados com base na seqüência de um gene homólogo ao RPS2 de Arabidopsis thaliana descrito em B. oleracea. Um fragmento de 2,5 Kb foi amplificado em duas linhagens. Os fragmentos amplificados apresentaram polimorfismo de comprimento entre as linhagens, gerando um marcador molecular. Este marcador foi utilizado em uma população F2 segregante para resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris oriunda do cruzamento entre as linhagens BI-16 e Lc201. O marcador, no entanto, não apresentou-se ligado a nenhum gene de resistência a este patógeno. Análise da expressão por meio de RT-PCR detectou a expressão do fragmento homólogo nas linhagens resistente e suscetível de B. oleracea com e sem inoculação, indicando que o gene é expresso constitutivamente. Em Z. mays, oligonucleotídeos sintetizados com base em seqüências de milho homólogas a genes de resistência, denominadas Pics, e a ESTs de milho, também homólogos a genes de resistência, foram utilizados para amplificação em linhagens resistente e suscetível a Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola e Phaeosphaeria maydis. Um par de oligonucleotídeos amplificou um fragmento polimórfico entre as linhagens resistente e suscetível a E. turcicum. Este foi utilizado em uma população segregante, mas também não observou-se ligação com o gene Ht de resistência a E. turcicum. Nas demais linhagens, os fragmentos foram monomórficos. Os oligonucleotídeos baseados em ESTs amplificaram fragmentos em todas as linhagens parentais. Esses fragmentos foram digeridos com enzimas de restrição, mas não apresentaram polimorfismo entre nenhuma das linhagens. Os resultados indicaram que a estratégia de utilização de seqüências conservadas é eficiente para amplificação de genes homólogos. O polimorfismo entre estes homólogos pode ser usado como marcador molecular para detecção de genes de interesse. Todavia, nem sempre estes marcadores estão ligados a esses genes. / The aim of this work was to identify homologs of resistance genes in Brassica oleracea and Zea mays by PCR amplification using primers based on conserved domains of plant resistance genes. In B. oleracea, the primers were based on the sequence of a homolog of the Arabidopsis thaliana RPS2 gene previously described in B. oleracea. A 2.5 Kb fragment was amplified on two lines. These fragments showed length polymorphisms between lines, based on which a molecular marker was developed. This marker was used in a F2 population, derived from the crossing between the inbred lines BI-16 and Lc201, and which segregates to resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris. The marker, however, was not linked to any Xcc resistance gene. Expression analyses by RT-PCR detected the expression of these homologs on both resistant and susceptible lines with and without inoculation, indicating that the gene is constitutively expressed. In Z. mays, primers based on resistance gene homologs sequences, named Pics, and on maize ESTs homologous to disease resistance genes, were used to amplify genomic fragments on resistant and susceptible lines to Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola and Phaeosphaeria maydis. A set of primers amplified a polymorphic fragment between lines resistant and susceptible to E. turcicum. This fragment was used in a segregating population, but no linkage was detected between this marker and the E. turcicum resistance gene Ht. Among the other lines, the fragments were not polymorphic. The primers based on ESTs amplified fragments on all parental lines. These fragments were digested with restriction enzymes but did not reveal any polymorphism between lines. The results indicated that the strategy of using conserved sequences is efficient to amplify disease resistance gene homologs. The polymorphism among these homologs may be used as a molecular marker, but these markers are not always linked to disease resistance genes.

1,25(OH)2D3 em concentrações elevadas (10-100nM) exerce efeito antiproliferativo e altera o perfil de expressão gênica de linhagens de câncer de mama. Entretanto, o estudo de linhagens não considera as interações epitéliomesênquima, as quais regulam o desenvolvimento do tumor. Além disso, elevadas concentrações de 1,25(OH)2D3 induzem hipercalcemia in vivo. Nossa proposta foi avaliar as ações de uma dose relativamente baixa de 1,25(OH)2D3, concentração que pode ser alcançada in vivo (0,5nM), e uma concentração farmacológica (100nM) em cultura organotípica de câncer de mama, modelo próximo ao fisiológico que simula as condições in vivo, no perfil de expressão gênica.Para isto, avaliamos a integridade da via pela indução do gene alvo CYP24A1. Inicialmente foram avaliadas amostras de 5 pacientes. Biópsias de câncer de mama foram seccionadas, cultivadas e tratadas por 24h com 1,25(OH)2D3 0.5nM ou 100nM. A cultura organotípica manteve-se viável com preservação das características teciduais e índice de proliferação. O perfil de expressão gênica foi determinado pela análise do chip de microarray (U133 Plus 2.0, Affymetrix). Foram regulados 394 genes (Repeated Measures ANOVA, p<0.05, variação de expressão ³ 1,5) incluindo genes envolvidos em resposta imune e metabolismo celular primário. Foram selecionados 7 genes vitamina D induzidos (cuja variação de expressão foi ³ 2 e concordância no sentido da regulação). Análises complementares foram realizadas em um segundo grupo de pacientes (n=16) cujas amostras foram processadas da mesma maneira por qPCR. Estes genes eram: CD14, IL33, BMP6; DPP4, CA2, SHE e IL1RL1. Observou-se indução da expressão de CA2, DPP4 e CD14 mediante tratamento com 1,25(OH)2D3 100nM e CA2, também pela concentração 0,5nM. Além disso, avaliamos a expressão de genes candidatos num modelo in vitro de transformação mamária composto por células HME, HMELT, HMELT+Ras e também a linhagem MCF7, sob as mesmas condições de tratamento (por qPCR, western blotting, microscopia confocal e ELISA). Todos genes candidatos foram regulados positivamente pela vitamina D no modelo de progressão após o tratamento (RT-qPCR). Dentre eles, CD14, IL1RL1 e SHE também foram induzidos em células MCF7. A fração solúvel de CD14 mostrouse significativamente aumentada, assim como houve indução da proteína CA2 nas linhagens HME and HMELT tratadas com a VD. Concluindo, temos que a via de sinalização da vitamina D é funcional em secção de tecido tumoral cultivadas ex vivo, modelo que preserva as interações epitélio-estroma e simula as condições in vivo. Dentre os diversos genes modulados pela 1,25(OH)2D3, encontram-se CYP24A1, CA2, DPP4 e CD14, os quais podem representar biomarcadores da ação deste hormônio no câncer de mama. / High 1,25(OH)2D3 (VD) concentrations (10-100nM) exerts antiproliferative effects and modifies gene expression profile in breast cancer (BC) cell lines. However, studies conducted in cell lines disconsider stromal-epithelium interactions, which are known to regulate breast cancer development. Besides, high VD concentrations may cause hypercalcemia in vivo. Our aim was to evaluate the effects of a relatively low (0,5nM) concentrations of 1,25(OH)2D3 which can be attained in vivo, and pharmacological concentrations (100nM) in an organ culture model, a physiological model which mimics in vivo conditions, by means of differential gene expression profile. Vitamin D pathway integrity was evaluated by the expression of the target gene, CYP24A1. Freshly excised human BC tumor samples were sliced and cultivated in complete culture media containing vehicle, 0.5nM or 100nM 1,25(OH)2D3 for 24 hours. Organotypic culture remained viable with preserved tissue architecture and proliferation index for at least 24 hours. Affymetrix (U133 Plus 2.0) gene expression profiles obtained in five separate tissue samples for each treatment revealed 394 regulated genes (Repeated Measures ANOVA, p<0.05, fold induction ³ 1,5). Biological functions over-represented included immune response and primary cellular metabolism. Expression of seven candidate genes (CD14, IL33, BMP6; DPP4, CA2, SHE and IL1RL1; fold induction ³ 2) was further evaluated in a large number of samples (n=16) using qPCR. Among them, CA2, DPP4 and CD14 were induced by 1,25(OH)2D3 100nM. CA2 was also induced after 1,25(OH)2D3 0.5nM treatment. Expression of candidate genes was also assessed in a model of mammary epithelial cell transformation HME, HMELT, HMELT+Ras and also MCF7 cells treated with VD by qPCR, western blotting, confocal microscopy and ELISA assays. The seven genes were confirmed upregulated by VD (RT-qPCR analysis) in the cell transformation model. Among them, CD14, IL1RL1 and SHE were also modulated in MCF7 cells. A significant increase in soluble CD14 and induction of CA2 protein levels was also detected in HME and HMELT VD treated cells. In conclusion, VD signaling pathway is functional in BC slices cultured ex vivo, a model which preserves stromalepithelial interactions and mimics in vivo conditions. Several genes regulated by 1,25(OH)2D3 were identified in this model and CYP24A1, CA2, DPP4 and CD14 may represent biomarkers of vitamin D action in human breast cancer.

Aplicando tecnologia de microarray, objetivamos traçar o perfil do programa de maturação das Mo-DC pulsadas com HIV autólogo inativado por AT-2, a fim de identificar marcadores específicos de ativação funcional e sugerir um perfil de expressão de genes úteis na identificação de respostas ao modelo in vitro das Mo-vacina DC. Essas informações podem ajudar a estabelecer assinaturas moleculares das funções celulares mais relevante para a melhoria das vacinas terapêuticas. O perfil transcricional foi analisado com base das vias celulares moduladas das Mo-DCs no estado imaturo, transitório e maduro. O HIV-1 inativado por AT-2 induz ativação de genes associados à apresentação de antígenos. Os conjuntos de genes do citoesqueleto podem influenciar a mudança de comportamento migratório das Mo-DCs ativadas. O aumento na expressão dos receptores celulares contribuem para o recrutamento de monócitos, DCs e macrófagos para o local da infecção. Além disso, modulam a resposta imune inata e adaptativa, incluindo a polarização das células Th e sub-regulação da resposta inflamatória, que pode interferir significativamente com a resposta imune. Coletivamente, o perfil transcricional das Mo-DCs induzido pelo HIV-1 inativado com AT-2 reflete uma significativa reprogramação imunológica e celular das células envolvidas na resposta imune do hospedeiro. Os resultados deste estudo focaram na interpretação de genes específicos dos perfis de transcrição das Mo-DCs como modelo terapêutico utilizado na vacina anti-HIV. As análises de assinaturas gene associado e sua correlação as respostas funcionais simplificam a identificação de indivíduos susceptíveis a vacina e a compreensão de eventuais falhas em ensaios clínicos. Microarray permitiu a análise quantitativa e simultânea da expressão de um elevado número de genes. Os estudos do perfil de expressão foram extremamente úteis para identificar os eventos moleculares e vias envolvidas nas funções de celular induzida por estímulos específicos. Em particular, os resultados sobre o padrão global da expressão dos genes subjacentes as modificações induzidas pelo HIV-1 inativado por AT-2, na fase inicial da administração do antígeno, pôde ser extremamente útil para a identificarmos marcadores de ativação e avaliar os efeitos biológicos que poderiam estar envolvidos para modificação e otimização de estratégias vacinação com Mo-DC / Applying microarray technology, we intend to profile the program to mature Mo-DC pulsed with autologous inactivated HIV by AT-2, in order to identify specific markers of functional activation and suggest a profile of expression of specific genes, useful identification of responders to in vitro model of Mo-DC vaccine. Such information may help to establish detailed molecular signatures of cellular functions most relevant to improving the therapeutic vaccines. The transcriptional profile was analyzed on the basis of the cellular pathways modulated in immature MoDC, transitional MoDC and mature MoDC. The AT-2-inactivated HIV-1 induction of MoDC results in the activation of genes associated with antigen presentation functions. A set of cytoskeletal genes that may potentially mediate shape change and migratory behavior of activated MoDC is also observed. The increase in the expression of immune receptors contribute to the recruitment of monocytes, DCs, and macrophages to the site of infection. Moreover, they modulate both innate and adaptive immune response, including the polarization of Th cells, and the down-regulation of the inflammatory response, which may significantly interfere with the immune response. Collectively, the transcriptional profile induced by AT-2-inactivated HIV-1 in MoDc reflects a significant cellular and immunological reprogramming of cells directly involved in the host immune response. The results of this study focused on the interpretation of specific genes of transcription profile of MoDC used in therapeutic HIV vaccine model. Supplementing the analyses with examination of associated gene signatures and their correlation to functional responses will simplify the identification of responsive vaccine individuals and the understanding of eventual failures in individuals enrolled in clinical trials. Microarray approach allows quantitative and simultaneous analysis of gene expression of a large amount of genes and the systematic studies of expression patterns are extremely useful for identify molecular events and key pathways involved in cellular functions induced by specific stimuli. In particular, data on the global pattern of gene expression underlying the modifications induced by AT-2-inactivated HIV-1 in MoDC, at early stages of antigen administration, may be extremely helpful for the identification of exclusive activation markers to trace the biological effects of modifications/optimizations of the MoDc vaccination strategy

Recentemente desenvolvida, a biotecnologia denominada por Microarrays permite o monitoramento simultâneo dos valores de expressão gênica de centenas de milhares de genes, fator este que traz uma nova interpretação aos resultados obtidos em pesquisas desenvolvidas nas mais diversas áreas do conhecimento incluindo, por exemplo, a Farmacologia e Medicina, uma vez que os resultados obtidos são interpretados ao nível molecular. Contudo, apesar de muita tecnologia ser empregada à técnica de Microarrays, sua aplicação ainda ocasiona algumas complicações decorrentes, por exemplo, das inúmeras fontes de variação existentes, da escala das respostas ou da natural dificuldade de se analisar uma grande quantidade de fragmentos genéticos avaliados sob poucas unidades experimentais. Frente a estas complicações, atualmente, muitas são as propostas metodológicas de análises estatísticas para atenuar ou eliminar os problemas inerentes à técnica de Microarrays e propiciar a extração de resultados mais confiáveis a partir dos valores de expressão gênica, porém muitos desafios ainda persistem. Sob esta colocação, o presente trabalho procurou explorar duas metodologias de análise estatística alternativas no que diz respeito a seus conceitos, embora ambas tenham sido contextualizadas ao problema de Microarrays e aplicadas para se atingir o mesmo objetivo: possibilitar a identificação dos genes diferencialmente expressos sob distintas condições experimentais. A primeira metodologia consistiu da aplicação de Modelos de Análise de Variância de efeitos fixos com a adoção de modificações nas estatísticas de teste, metodologias de correções para múltiplos testes e a construção de gráficos vulcão. Já, a segunda metodologia consistiu da contextualização e aplicação da Teoria da Resposta ao Item TRI aos experimentos de Microarrays, abordagem esta pouco explorada na análise deste tipo de dado, mas a qual possibilita a seleção de genes diferencialmente expressos a partir de uma medida latente estimada para cada gene e a construção de uma escala para as categorias de resposta de expressão gênica. A motivação para este trabalho originou de um experimento de Microarrays com ratos congênicos disponibilizado pelo Laboratório de Cardiologia e Genética Molecular do Instituto do Coração (InCor-USP) cujo objetivo é identificar genes associados à hipertensão. / Recently developed, the biotechnology denominated Microarrays permits a simultaneous monitoring of the gene expression values of hundred thousands of genes; fact that introduces a new interpretation of the results obtained in researches developed in many distinct areas including, for example, Pharmacology and Medicine, once the obtained results are read according to the molecular level. However, despite the fact that much technology is used in the Microarrays technique, its application still causes some implications, for example, the countless sources of existing variance, the scale of answers or the natural difficulty in analyzing a large number of genetic fragments measured by few experimental units. Facing such complications, a lot of methodologies were suggested in order to reduce or eliminate the problems caused by the Microarrays technique and also foster the obtainment of more reliable results from the gene expression values, yet many challenges still persist. Under this perspective, the present work aimed at exploring two alternative methodologies regarding concepts, despite both were contextualized according to the Microarrays problem and applied with the same objective: enabling the identification of the genes differently expressed under different experimental conditions. The first methodology was composed by the application of Analysis of Variance Models of fixed effects with changes in the test statistics, correction methodologies for multiple tests and volcano plot. The second methodology consisted of the contextualization and application of the Item Response Theory IRT towards the Microarrays experiments, being this one not much explored in analysis that use this kind of data, but enabling the selection of genes differently expressed from an estimated latent trait for each gene and the construction of a scale for the categories of gene expression answers. The motivation for the present work came from an experiment of Microarrays with congenic mice made available by the Cardiology and Molecular Genetics Laboratory of the Heart Institute (InCor-USP) that aimed at identifying genes associated with hypertension.

Recentemente desenvolvida, a biotecnologia denominada por Microarrays permite o monitoramento simultâneo dos valores de expressão gênica de centenas de milhares de genes, fator este que traz uma nova interpretação aos resultados obtidos em pesquisas desenvolvidas nas mais diversas áreas do conhecimento incluindo, por exemplo, a Farmacologia e Medicina, uma vez que os resultados obtidos são interpretados ao nível molecular. Contudo, apesar de muita tecnologia ser empregada à técnica de Microarrays, sua aplicação ainda ocasiona algumas complicações decorrentes, por exemplo, das inúmeras fontes de variação existentes, da escala das respostas ou da natural dificuldade de se analisar uma grande quantidade de fragmentos genéticos avaliados sob poucas unidades experimentais. Frente a estas complicações, atualmente, muitas são as propostas metodológicas de análises estatísticas para atenuar ou eliminar os problemas inerentes à técnica de Microarrays e propiciar a extração de resultados mais confiáveis a partir dos valores de expressão gênica, porém muitos desafios ainda persistem. Sob esta colocação, o presente trabalho procurou explorar duas metodologias de análise estatística alternativas no que diz respeito a seus conceitos, embora ambas tenham sido contextualizadas ao problema de Microarrays e aplicadas para se atingir o mesmo objetivo: possibilitar a identificação dos genes diferencialmente expressos sob distintas condições experimentais. A primeira metodologia consistiu da aplicação de Modelos de Análise de Variância de efeitos fixos com a adoção de modificações nas estatísticas de teste, metodologias de correções para múltiplos testes e a construção de gráficos vulcão. Já, a segunda metodologia consistiu da contextualização e aplicação da Teoria da Resposta ao Item TRI aos experimentos de Microarrays, abordagem esta pouco explorada na análise deste tipo de dado, mas a qual possibilita a seleção de genes diferencialmente expressos a partir de uma medida latente estimada para cada gene e a construção de uma escala para as categorias de resposta de expressão gênica. A motivação para este trabalho originou de um experimento de Microarrays com ratos congênicos disponibilizado pelo Laboratório de Cardiologia e Genética Molecular do Instituto do Coração (InCor-USP) cujo objetivo é identificar genes associados à hipertensão. / Recently developed, the biotechnology denominated Microarrays permits a simultaneous monitoring of the gene expression values of hundred thousands of genes; fact that introduces a new interpretation of the results obtained in researches developed in many distinct areas including, for example, Pharmacology and Medicine, once the obtained results are read according to the molecular level. However, despite the fact that much technology is used in the Microarrays technique, its application still causes some implications, for example, the countless sources of existing variance, the scale of answers or the natural difficulty in analyzing a large number of genetic fragments measured by few experimental units. Facing such complications, a lot of methodologies were suggested in order to reduce or eliminate the problems caused by the Microarrays technique and also foster the obtainment of more reliable results from the gene expression values, yet many challenges still persist. Under this perspective, the present work aimed at exploring two alternative methodologies regarding concepts, despite both were contextualized according to the Microarrays problem and applied with the same objective: enabling the identification of the genes differently expressed under different experimental conditions. The first methodology was composed by the application of Analysis of Variance Models of fixed effects with changes in the test statistics, correction methodologies for multiple tests and volcano plot. The second methodology consisted of the contextualization and application of the Item Response Theory IRT towards the Microarrays experiments, being this one not much explored in analysis that use this kind of data, but enabling the selection of genes differently expressed from an estimated latent trait for each gene and the construction of a scale for the categories of gene expression answers. The motivation for the present work came from an experiment of Microarrays with congenic mice made available by the Cardiology and Molecular Genetics Laboratory of the Heart Institute (InCor-USP) that aimed at identifying genes associated with hypertension.

O receptor ativado do peroxissomo &#947; (PPAR-&#947;) é regulador do metabolismo e diferenciação do tecido adiposo, sendo um alvo conhecido das tiazolidinedionas (TZD), utilizadas para o tratamento do diabetes tipo 2 (DM2). As TZD agem como um agente sensibilizador da ação da insulina nos tecidos periféricos e tem sido especulado que as TZDs podem ter um papel na função da célula , prevenindo perda de massa e melhorando a sua viabilidade a longo prazo. Este efeito seria supostamente mediado pela transcrição de genes que favoreceriam a lipólise, diminuindo o conteúdo intracelular de triglicérides e, portanto, diminuindo a lipotoxicidade. Entretanto, alguns estudos também mostraram efeito nulo ou mesmo deletério das TZDs sobre as ilhotas pancreáticas. Na realidade, o papel de genes-alvo para o PPAR- nas ilhotas pancreáticas é ainda pouco conhecido. Estudamos o perfil de expressão gênica induzido pelo tratamento com Pioglitazona (Pio), uma TZD aprovada e disponível para uso clínico no tratamento do DM2, em ilhotas pancreáticas murídeas em cultura primária, com concentrações normal e suprafisiológica de glicose no meio de cultura. As ilhotas foram obtidas de ratos wistar machos de dois meses de idade e isoladas pelo método do gradiente de Ficoll e então cultivadas em 5,6 mM ou 23 mM de glicose por 24h, sendo tratadas com Pio 10 M ou DMSO 0,1% (veículo). A Pioglitazona foi cedida pela Takeda Farmacêutica, Osaka, Japão. O RNA foi extraído com Trizol e purificado com o kit RNeasy (Qiagen). As amostras foram marcadas e hibridizadas no microarranjo de cDNA Mouse Panchip 13k, usando-se cinco replicatas biológicas diferentes para cada condição. A análise estatística dos dados do microarranjo foi feita com o uso do programa significance analysis of microarrays (SAM) com uso de taxa de descobrimento falso (FDR) de 20%. A análise das vias acometidas foi feita com o Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com). Os resultados de expressão gênica foram confirmados por RT-qPCR. Em concentração de 5,6 mM de glicose no meio de cultura, 101 genes foram modulados pela Pio, sendo 49 regulados para cima, com aumento de sua expressão na presença da droga e 52 genes regulados para baixo. Em 23 mM de glicose, 1.235 genes foram afetados, sendo 621 para cima e 623 para baixo. A comparação entre as duas condições revelou 74 genes que foram modulados em ambas as concentrações de glicose. A análise das vias biológicas alteradas mostrou que genes relacionados ao metabolismo de lípides foram modulados em ambas as concentrações de glicose. Em 23 mM foi ainda significativo o grupo de genes relacionados a ciclo celular e morte celular que tiveram sua expressão modificada pela presença da droga na cultura. Este dado demonstrou que além de seus efeitos conhecidos nos adipócitos, o sensibilizador de insulina Pioglitazona modula a expressão de genes nas ilhotas pancreáticas, especialmente na presença de concentrações suprafisiológicas de glicose, afetando notadamente genes relacionados ao metabolismo lipídico, sendo vários deles ligados a lipogênese, como Srebf1, Scd2 e Fabp4 cujas expressões aumentaram em ambas as concentrações de glicose. Além disso foi observado aumento na expressão de genes com atividade pró-apoptótica como Tnf, Bad, Bax, Caspase4, Fadd e Myc. A Pioglitazona parece induzir um perfil gênico desfavorável em ilhotas pancreáticas mantidas em cultura em concentrações suprafisiológicas de glicose. / Peroxisome proliferator-activator receptor-&#947; (PPAR-&#947;) is a target for thiazolidinedione (TZD) antidiabetic drugs and a regulator of adipose tissue differentiation and metabolism. TZD act as an insulin sensitizing agent on peripheral tissues. It has been speculated that TZD could play a role on beta-cell function, preventing loss and improving viability in the long-term. This effect is supposed to be mediated through a potential benefit against lipotoxicity, favouring lypolisis and decreasing intracellular tryglicerides content. Nevertheless some studies also showed a lack or even a potential deleterious effect of TZD on islets. The role of PPAR-&#947; target genes in pancreatic islets is actually still largely unclear. We studied the gene expression profile induced by the treatment with Pioglitazone (Pio), an approved TZD for T2DM therapy, on rat pancreatic islets primary culture both at normal and supraphysiological glucose medium concentrations. Islets were obtained from 2 month-old, male, wistar rats and isolated through the Ficoll gradient method and then cultured with 5.6 mM or 23 mM of glucose concentration for 24h, being treated with Pio 10 µM or DMSO 0.1% (vehicle). Pioglitazone was provided by Takeda Pharmaceuticals, Osaka, Japan. RNA was extracted with Trizol (Sigma) and purified with RNeasy kit (Qiagen). Samples were labeled and then hybridized on the Mouse PanChip 13k cDNA microarray, using 5 different biological replicates for each test condition. Statistical Analysis of the microarray data was performed using significance analysis of microarrays (SAM) with a false discovery rate of 20%. Pathways assessment was performed through Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com). Gene expression results were confirmed through RT-qPCR. At 5.6 mM glucose 101 genes were modulated by Pio, 49 upregulated and 52 downregulated. At 23 mM, 1,235 genes were affected, 612 upregulated and 623 downregulated. Comparison between both conditions revealed 74 genes that were similarly modulated at both glucose concentrations. Pathway analysis of perturbed genes revealed biologically relevant networks related to lipid metabolism at both glucose medium concentrations. At 23 mM, cell cycle and cell death pathways were significant modulated as well. These data demonstrates that in addition to known effect in adipocytes, the insulin sensitizing agent Pioglitazone modulates gene expression in pancreatic islets, especially in the presence of supraphysiological glucose concentrations, affecting especially lipid metabolism and mechanisms of cell death and cell cycle. Considering the ontology of modulated genes it seems to be a trend towards lypogenesis (increased Srebf1, Scd2 and Fabp4 RNA expressions) with Pio treatment also enhancing the abundance of some genes considered to be pro apoptotic like Tnf, Bad, Bax, Caspase4, Fadd and Myc. Pioglitazone seems to induce a negative gene expression profile in islets cultured at high glucose concentrations.

O presente trabalho teve por objetivo identificar fragmentos homólogos a genes de resistência em Brassica oleracea e Zea mays, por meio da amplificação por PCR, utilizando oligonucleotídeos homólogos a regiões conservadas de genes de resistência de plantas. Em B. oleracea, os oligonucleotídeos foram desenhados com base na seqüência de um gene homólogo ao RPS2 de Arabidopsis thaliana descrito em B. oleracea. Um fragmento de 2,5 Kb foi amplificado em duas linhagens. Os fragmentos amplificados apresentaram polimorfismo de comprimento entre as linhagens, gerando um marcador molecular. Este marcador foi utilizado em uma população F2 segregante para resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris oriunda do cruzamento entre as linhagens BI-16 e Lc201. O marcador, no entanto, não apresentou-se ligado a nenhum gene de resistência a este patógeno. Análise da expressão por meio de RT-PCR detectou a expressão do fragmento homólogo nas linhagens resistente e suscetível de B. oleracea com e sem inoculação, indicando que o gene é expresso constitutivamente. Em Z. mays, oligonucleotídeos sintetizados com base em seqüências de milho homólogas a genes de resistência, denominadas Pics, e a ESTs de milho, também homólogos a genes de resistência, foram utilizados para amplificação em linhagens resistente e suscetível a Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola e Phaeosphaeria maydis. Um par de oligonucleotídeos amplificou um fragmento polimórfico entre as linhagens resistente e suscetível a E. turcicum. Este foi utilizado em uma população segregante, mas também não observou-se ligação com o gene Ht de resistência a E. turcicum. Nas demais linhagens, os fragmentos foram monomórficos. Os oligonucleotídeos baseados em ESTs amplificaram fragmentos em todas as linhagens parentais. Esses fragmentos foram digeridos com enzimas de restrição, mas não apresentaram polimorfismo entre nenhuma das linhagens. Os resultados indicaram que a estratégia de utilização de seqüências conservadas é eficiente para amplificação de genes homólogos. O polimorfismo entre estes homólogos pode ser usado como marcador molecular para detecção de genes de interesse. Todavia, nem sempre estes marcadores estão ligados a esses genes. / The aim of this work was to identify homologs of resistance genes in Brassica oleracea and Zea mays by PCR amplification using primers based on conserved domains of plant resistance genes. In B. oleracea, the primers were based on the sequence of a homolog of the Arabidopsis thaliana RPS2 gene previously described in B. oleracea. A 2.5 Kb fragment was amplified on two lines. These fragments showed length polymorphisms between lines, based on which a molecular marker was developed. This marker was used in a F2 population, derived from the crossing between the inbred lines BI-16 and Lc201, and which segregates to resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris. The marker, however, was not linked to any Xcc resistance gene. Expression analyses by RT-PCR detected the expression of these homologs on both resistant and susceptible lines with and without inoculation, indicating that the gene is constitutively expressed. In Z. mays, primers based on resistance gene homologs sequences, named Pics, and on maize ESTs homologous to disease resistance genes, were used to amplify genomic fragments on resistant and susceptible lines to Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola and Phaeosphaeria maydis. A set of primers amplified a polymorphic fragment between lines resistant and susceptible to E. turcicum. This fragment was used in a segregating population, but no linkage was detected between this marker and the E. turcicum resistance gene Ht. Among the other lines, the fragments were not polymorphic. The primers based on ESTs amplified fragments on all parental lines. These fragments were digested with restriction enzymes but did not reveal any polymorphism between lines. The results indicated that the strategy of using conserved sequences is efficient to amplify disease resistance gene homologs. The polymorphism among these homologs may be used as a molecular marker, but these markers are not always linked to disease resistance genes.

O objetivo deste trabalho foi estudar a utilização de uma nanoemulsão lipídica (LDE) como vetor de oligonucleotídeos antissenso (OAS). A LDE é uma nanoemulsão constituída por 48% de éster de colesterol, 47,8% de fosfolipídeos, 2,3% de triglicérides e 1,9% de colesterol não-esterificado. É capaz de adquirir apoE de HDL e, desta forma, a emulsão pode interagir com o receptor B/E. O comportamento metabólico da LDE se assemelha ao da LDL. OAS agem como inibidores da função de genes, ligando-se à fita oposta (complementar) do RNA mensageiro (mRNA) ou à dupla fita do DNA. Previnem que o mRNA codifique uma proteína funcional. Os mecanismos celulares de resistência a drogas representam diversas formas de proteção da célula e do organismo e estão presentes na maioria das células normais, exercendo funções fisiológicas. Infelizmente, muitos tumores utilizam esses mecanismos para sua própria proteção. A proteína codificada pelo gene MDR1 (ABCB1), a P-gp, é uma glicoproteína de membrana com peso molecular de 170Kda, que funciona como uma bomba orgânica catiônica. Neste trabalho foi observado que o OAS se ligam à LDE, sendo a constante de ligação de 4,2 X 10-3M-1. O complexo OAS/LDE foi capaz de se ligar especificamente ao receptor de LDL e através desta via ser internalizado, pelas células de sarcoma uterino resistentes a doxorrubicina. Os OAS apresentaram após 24 horas distribuição citoplasmática e nuclear e após 48 horas, somente distribuição citoplasmática. Utilizando-se dois diferentes OAS, verificou-se que ambos foram capaz de inibir (70%) a expressão do gene de resistência a múltiplas drogas após 48 horas de incubação, tornando as células mais susceptíveis à ação da doxorrubicina. Assim, o complexo OAS/LDE é um sistema potencialmente promissor para ser utilizado em terapia gênica. / The objective of this study was to evaluate the usefulness of a nanolipid emulsion (LDE) as a vector to carry antisense oligonucleotides (OAS). LDE is a nanoemulsion consisting of 48% cholesterol esters, 47,8% phospholipid, 2,3% triglycerides and 1,9% unesterified cholesterol. It is able to obtain apoE from HDL and interact with B/E receptor. The metabolic behavior of LDE is similar to LDL. OAS are able to inhibit specific gene expression since they bind to a complementary sequence in the mRNA or in the DNA. This binding impairs the synthesis of a functional protein. The cell resistance mechanisms are present in most of normal cells, been involved in physiological process. Tumors are able to use these mechanisms to their own protection. The protein P-gp (MDR1 gene) is a glycoprotein with 170Kda that works as an organic cationic pump. We have observed that LDE was able to bind to the OAS; the binding constant was 4,2 X 10-3M-1. The complex was shown to bind to LDL receptors and then been internalized into a human sarcoma cell line resistant to doxirrubicine. After 24 hours the complex have shown citoplasmatic and nuclear distribution, after 48 hours only citoplasmatic distribution was observed. Two OAS were used. Both OAS strongly inhibited (by 70%) the cell MDR-1 gene expression after 48 hours of incubation and cells turned out to be more susceptible to doxorrubicine action. Therefore, OAS/LDE is promising complex to be used in gene therapy studies.

Compostos carcinogênicos estruturalmente diversos ligam-se covalentemente ao DNA formando adutos que, se não reparados, provocam mutações. Inicialmente relacionados apenas a compostos exógenos, atualmente há várias evidências de que compostos gerados endogenamente poderiam modificar o DNA gerando adutos. Dentre os compostos endógenos, os produtos carbonílicos &#945;,&#946;-insaturados destacam-se pois reagem como agentes alquilantes bifuncionais com as bases do DNA, formando adutos exocíclicos. O 2,4-decadienal (DDE) é um aldeído &#945;,&#946;-insaturado que além de estar presente em alimentos e poluentes, é um dos mais importantes produtos da lipoperoxidação. Embora há várias indicações sobre a ação genótoxica do DDE, nenhum aduto deste composto com nucleobases havia sido caracterizado. O presente trabalho mostrou que o DDE é um agente alquilante versátil sendo capaz de gerar cinco adutos diferentes. Este estudo também mostrou que o DDE é capaz de gerar os mesmos adutos que outros dois importantes produtos da lipoperoxidação: o 4-0H-nonenal e o 2-octena1. Todos os adutos foram detectados em DNA tratado in vitro com o DDE. Para possibilitar a detecção dos adutos em sistemas mais complexos, foi desenvolvido um método extremamente sensível baseado em HPLC interfaceado com espectrometria de massa em tandem com ionização por electrospray. Foi também desenvolvida uma estratégia de incorporação de um dos adutos (III) em oligonucleotídeos por via química. A estratégia foi utilizada com sucesso na incorporação do aduto em oligonucleotídeos de sequências diversas. Os oligonucleotídeos foram utilizados em ensaios de reparo por excisão de base e replicação in vitro. / Structurally diverse carcinogenic compounds bind covalently to DNA producing adducts that can, if not repaired, lead to mutations. Firstly restricted to exogenous compounds, nowadays there are evidences that compounds endogenously generated can modify DNA forming adducts. Among these endogenous compounds, &#945;,&#946;-unsaturated carbonyl products are of special interest due their reactivity as bifunctional alkylating agents towards DNA bases leading to exocyclic adducts. 2,4-decadienal (DDE) is an &#945;,&#946;-unsaturatedaldehyde that in addition to be present in food and pollutants, it is one of the most important lipid peroxidation products. Despite of many indications about the DDE genotoxic properties, there was no information about adducts produced between this compounds and nucleobases. This work showed DDE as a versatile DNA alkylating agent being able to generate five different adducts. This study also showed that DDE can generate the same adducts produced from two other important lipid peroxidation products: 4-0H-nonenal and 2-octena1. All adducts were detected in DNA treated in vitro with DDE. To allow adduct detection in more complex systems, we developed a highly sensitive method based on HPLC coupled to electrospray/tandem mass spectrometry. A strategy to incorporate one adduct (III) into oligonucleotides was also developed. The strategy was successfully applied in the adduct incorporation into diverse sequences of oligonucleotides. They were utilized in base excision repair and in vitro replication experiments.