Made available in DSpace on 2014-06-12T23:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8642_1.pdf: 943630 bytes, checksum: 0ef6a23c109d1b1904490d5d9a625d24 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alterações na atividade da glicoproteína-P (gp-P) resultantes da exposição individual à radiação ionizante podem ser cruciais para a eficácia de tratamentos que empregam radioterapia antes da quimioterapia. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo para avaliar o efeito da radiação ionizante na atividade da gp-P. Amostras de sangue periférico de cinco indivíduos sadios foram irradiadas in vitro, separadamente, a partir de uma fonte de cobalto-60, de sorte a receber doses de 0,5 e 2,0 Gy, sendo mantida uma amostra não-irradiada como controle. A atividade da gp-P foi analisada nos linfócitos T CD4 e CD8 através do ensaio de efluxo da rodamina 123 utilizando citometria de fluxo (total 60 leituras), com resultados em porcentagem e índice médio de fluorescência. A comparação da atividade média da gp-P entre os grupos de amostras controle e irradiadas indicou não haver influência da irradiação na atividade da gp-P nos linfócitos T. Entretanto, numa avaliação indivíduo por indivíduo, observou-se mudanças na funcionalidade da gp-P em amostras irradiadas, para alguns casos e doses absorvidas. A análise simultânea dos parâmetros de porcentagem e índice médio de fluorescência mostrou-se fundamental na intercomparação das amostras irradiadas e controle de cada doador. Como base nos resultados obtidos, o protocolo proposto foi considerado adequado para análise da atividade da gp-P após estresse radioativo, configurando-se num importante fator prognóstico à adequação de tratamento pacienteespecífico, em particular para indivíduos suspeitos de apresentarem resistência radioinduzida a múltiplas drogas

Uma das causas mais freqüentes de insucesso terapêutico do câncer, está associada à Resistência a Múltiplas Drogas (MDR). A resistência a múltiplas drogas refere-se ao desenvolvimento de resistência simultânea a uma variedade de agentes citotóxicos que apresentam diferentes sítios de ação e estruturas químicas diversas. Os mecanismos MDR são representados por genes cujos produtos funcionam como bombas, reduzindo o acúmulo intracelular de drogas e a resposta ao tratamento. O linfoma é uma neoplasia comum na espécie, sendo muito responsiva à quimioterapia, embora a recidiva seja esperada e possa estar relacionada ao MDR. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão dos genes MDR-1, MRP e LRP e de seus produtos, em cães com linfoma. Foram colhidas amostras de linfonodos periféricos de 15 cães com linfoma multicêntrico ao diagnóstico e na recidiva (durante a quimioterapia). A expressão dos genes e proteínas MDR foram determinados por RT-PCR e \"Dot Blotting\", respectivamente. As freqüências de expressão ao diagnóstico dos genes MDR, MRP e LRP foram 93,3% igualmente e as freqüências de seus produtos foram 85,8%; 71,5% e 85,8% respectivamente. Na recidiva, as freqüências de expressão dos genes MDR, MRP e LRP elevaram-se para 100% igualmente e as freqüências de suas proteínas foram 92,9% para P-gp e MRP e de 100% para LRP. Portanto, obteve-se uma alta freqüência na expressão do MDR-1/P-gp, MRP e LRP, em quase todos os cães, não só na recidiva, como também ao diagnóstico. É necessário verificar se estes mecanismos podem induzir o fenótipo MDR no linfoma canino multicêntrico. O estudo dos mecanismos MDR trará novas perspectivas para o tratamento de tumores como o linfoma canino. A modulação desses mecanismos por meio de drogas específicas ou por terapia gênica, pode contribuir para o sucesso do tratamento de neoplasias caninas ou humanas. / One of the most frequent causes of treatment failure in cancer is associated to Multiple Drug Resistance (MDR). MDR refers to simultaneous resistance to a variety of cytotoxic agents that have different targets and diversal chemical structures. MDR mechanisms are represented by genes wich encodes proteins that work like pumps, reducing intracellular drug acumulation and the response to treatment. Lymphoma is a common neoplasia in dogs wich is very responsive to chemotherapy, although relapses are expected, including those related to MDR. The aim of this study was to evaluate the possible expression of MDR-1, MRP and LRP genes and their proteins, in dogs with lymphoma. Lymph node samples at diagnosis and at relapse (during chemotherapy) from 15 dogs with multicentric lymphoma were obtained. The expression of MDR genes and proteins were determined by RT-PCR and Dot Blotting. Expression of MDR, MRP and LRP gene were 93,3% at diagnosis and their products were 85,8%; 71,5% and 85,8% respectively. Expression of MDR, MRP and LRP gene increased to 100% at relapse and their proteins were 92,9% to P-gp and MRP and 100% to LRP. High frequency of MDR-1/P-gp, MRP and LRP expressions were found in almost all dogs, not only at relapse but also at diagnosis. It\'s necessary to analyse if these mechanisms can induce the MDR fenotype in canine multicentric lymphoma. The study of MDR mechanisms will conduct the treatment of tumors like canine lymphoma to new perspectives. The modulation of these mechanisms by certain drugs or gene therapy, may contribute to the success in treatment of canine or human neoplasias.

Uma das causas mais freqüentes de insucesso terapêutico do câncer, está associada à Resistência a Múltiplas Drogas (MDR). A resistência a múltiplas drogas refere-se ao desenvolvimento de resistência simultânea a uma variedade de agentes citotóxicos que apresentam diferentes sítios de ação e estruturas químicas diversas. Os mecanismos MDR são representados por genes cujos produtos funcionam como bombas, reduzindo o acúmulo intracelular de drogas e a resposta ao tratamento. O linfoma é uma neoplasia comum na espécie, sendo muito responsiva à quimioterapia, embora a recidiva seja esperada e possa estar relacionada ao MDR. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão dos genes MDR-1, MRP e LRP e de seus produtos, em cães com linfoma. Foram colhidas amostras de linfonodos periféricos de 15 cães com linfoma multicêntrico ao diagnóstico e na recidiva (durante a quimioterapia). A expressão dos genes e proteínas MDR foram determinados por RT-PCR e \"Dot Blotting\", respectivamente. As freqüências de expressão ao diagnóstico dos genes MDR, MRP e LRP foram 93,3% igualmente e as freqüências de seus produtos foram 85,8%; 71,5% e 85,8% respectivamente. Na recidiva, as freqüências de expressão dos genes MDR, MRP e LRP elevaram-se para 100% igualmente e as freqüências de suas proteínas foram 92,9% para P-gp e MRP e de 100% para LRP. Portanto, obteve-se uma alta freqüência na expressão do MDR-1/P-gp, MRP e LRP, em quase todos os cães, não só na recidiva, como também ao diagnóstico. É necessário verificar se estes mecanismos podem induzir o fenótipo MDR no linfoma canino multicêntrico. O estudo dos mecanismos MDR trará novas perspectivas para o tratamento de tumores como o linfoma canino. A modulação desses mecanismos por meio de drogas específicas ou por terapia gênica, pode contribuir para o sucesso do tratamento de neoplasias caninas ou humanas. / One of the most frequent causes of treatment failure in cancer is associated to Multiple Drug Resistance (MDR). MDR refers to simultaneous resistance to a variety of cytotoxic agents that have different targets and diversal chemical structures. MDR mechanisms are represented by genes wich encodes proteins that work like pumps, reducing intracellular drug acumulation and the response to treatment. Lymphoma is a common neoplasia in dogs wich is very responsive to chemotherapy, although relapses are expected, including those related to MDR. The aim of this study was to evaluate the possible expression of MDR-1, MRP and LRP genes and their proteins, in dogs with lymphoma. Lymph node samples at diagnosis and at relapse (during chemotherapy) from 15 dogs with multicentric lymphoma were obtained. The expression of MDR genes and proteins were determined by RT-PCR and Dot Blotting. Expression of MDR, MRP and LRP gene were 93,3% at diagnosis and their products were 85,8%; 71,5% and 85,8% respectively. Expression of MDR, MRP and LRP gene increased to 100% at relapse and their proteins were 92,9% to P-gp and MRP and 100% to LRP. High frequency of MDR-1/P-gp, MRP and LRP expressions were found in almost all dogs, not only at relapse but also at diagnosis. It\'s necessary to analyse if these mechanisms can induce the MDR fenotype in canine multicentric lymphoma. The study of MDR mechanisms will conduct the treatment of tumors like canine lymphoma to new perspectives. The modulation of these mechanisms by certain drugs or gene therapy, may contribute to the success in treatment of canine or human neoplasias.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-09-21Bitstream added on 2014-06-13T19:35:22Z : No. of bitstreams: 1 paula_cjs_me_jabo.pdf: 334942 bytes, checksum: 17d2a17239376692690b930753f05b71 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Cachorros têm sido propostos como possíveis reservatórios de cepas de Escherichia coli patogênicas que causam infecções em cachorros e em humanos. Entre Janeiro e Dezembro de 2006, 92 cepas de E. coli foram analisadas para a detecção da presença de genes produtores de toxina Shigalike (stx 1 e stx 2) e o gene da intimina (eae). Doze cepas de E. coli Shigatoxigênica (STEC) foram detectadas por PCR como portadoras dos genes de Shiga toxina, 7 cepas do gene stx 1 (7,6%), 5 do stx 2 (5,4%) e nenhuma delas apresentando ambos os genes. Nove (9,8%) das cepas de E. coli apresentaram o gene eae e não eram produtoras de Shiga toxina. Os isolados de E. coli foram também examinados para a detecção dos genes codificadores de adesinas (pap, sfa e afa), hemolisina e aerobactina. A freqüência dos genes de virulência detectados nestes isolados foi de 12,0% pap, 1,0% sfa, 10,0% hemolisina e 6,5% aerobactina. Seis destes isolados foram caracterizados como cepas de E.coli patogênica extraintestinal (ExPEC). Entre as cepas de STEC e ExPEC foi encontrado um alto nível de resistência a agentes antimicrobianos (estreptomicina com 81% e 100% e cefalotina com 85,7% e 50% respectivamente) e algumas delas foram caracterizadas como E. coli resistentes a múltiplas drogas (MDREC), o que representa um motivo de preocupação devido ao risco de disseminação dos genes de resistência para a microbiota dos seres humanos. / Dogs have been proposed as a possible reservoir of the pathogenic Escherichia coli that causes infection in dogs and human beings. From January to December 2006, 92 E. coli isolates from 25 diarrheic dogs were analyzed by screening for the presence of Shiga toxin-producing (stx 1 and stx 2) and intimin (eae) genes. Twelve Shiga toxin-producing E. coli (STEC) isolates were detected by PCR to harbor the Shiga toxin genes, 7 isolates the stx 1 (7.6%); 5 the stx 2(5.4%) and none both of them. Nine (9.8%) of the E. coli isolates studied were eae positive non Shiga toxin-producing. The E. coli isolates also were screened for the presence of adhesion-encoding genes (pap, sfa, afa), hemolysin and aerobactin genes. Virulence gene frequencies detected in those isolates were: 12.0% pap, 1.0% sfa, 10.0% hemolysin and 6.5% aerobactin. Ten isolates were characterized as extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) strains. Among STEC and ExPEC isolates was found high level of resistance to antimicrobial agents and some of them as characterized as multidrug resistant E. coli (MDREC), what represent a reason for concern due the risk of dissemination of antimicrobial resistant genes to the microbiota of human beings.

O objetivo deste trabalho foi estudar a utilização de uma nanoemulsão lipídica (LDE) como vetor de oligonucleotídeos antissenso (OAS). A LDE é uma nanoemulsão constituída por 48% de éster de colesterol, 47,8% de fosfolipídeos, 2,3% de triglicérides e 1,9% de colesterol não-esterificado. É capaz de adquirir apoE de HDL e, desta forma, a emulsão pode interagir com o receptor B/E. O comportamento metabólico da LDE se assemelha ao da LDL. OAS agem como inibidores da função de genes, ligando-se à fita oposta (complementar) do RNA mensageiro (mRNA) ou à dupla fita do DNA. Previnem que o mRNA codifique uma proteína funcional. Os mecanismos celulares de resistência a drogas representam diversas formas de proteção da célula e do organismo e estão presentes na maioria das células normais, exercendo funções fisiológicas. Infelizmente, muitos tumores utilizam esses mecanismos para sua própria proteção. A proteína codificada pelo gene MDR1 (ABCB1), a P-gp, é uma glicoproteína de membrana com peso molecular de 170Kda, que funciona como uma bomba orgânica catiônica. Neste trabalho foi observado que o OAS se ligam à LDE, sendo a constante de ligação de 4,2 X 10-3M-1. O complexo OAS/LDE foi capaz de se ligar especificamente ao receptor de LDL e através desta via ser internalizado, pelas células de sarcoma uterino resistentes a doxorrubicina. Os OAS apresentaram após 24 horas distribuição citoplasmática e nuclear e após 48 horas, somente distribuição citoplasmática. Utilizando-se dois diferentes OAS, verificou-se que ambos foram capaz de inibir (70%) a expressão do gene de resistência a múltiplas drogas após 48 horas de incubação, tornando as células mais susceptíveis à ação da doxorrubicina. Assim, o complexo OAS/LDE é um sistema potencialmente promissor para ser utilizado em terapia gênica. / The objective of this study was to evaluate the usefulness of a nanolipid emulsion (LDE) as a vector to carry antisense oligonucleotides (OAS). LDE is a nanoemulsion consisting of 48% cholesterol esters, 47,8% phospholipid, 2,3% triglycerides and 1,9% unesterified cholesterol. It is able to obtain apoE from HDL and interact with B/E receptor. The metabolic behavior of LDE is similar to LDL. OAS are able to inhibit specific gene expression since they bind to a complementary sequence in the mRNA or in the DNA. This binding impairs the synthesis of a functional protein. The cell resistance mechanisms are present in most of normal cells, been involved in physiological process. Tumors are able to use these mechanisms to their own protection. The protein P-gp (MDR1 gene) is a glycoprotein with 170Kda that works as an organic cationic pump. We have observed that LDE was able to bind to the OAS; the binding constant was 4,2 X 10-3M-1. The complex was shown to bind to LDL receptors and then been internalized into a human sarcoma cell line resistant to doxirrubicine. After 24 hours the complex have shown citoplasmatic and nuclear distribution, after 48 hours only citoplasmatic distribution was observed. Two OAS were used. Both OAS strongly inhibited (by 70%) the cell MDR-1 gene expression after 48 hours of incubation and cells turned out to be more susceptible to doxorrubicine action. Therefore, OAS/LDE is promising complex to be used in gene therapy studies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-18Bitstream added on 2014-06-13T19:20:17Z : No. of bitstreams: 1 gerardi_dg_dr_jabo.pdf: 906206 bytes, checksum: 29e6a477f11cbcccee68cc2a21495f1a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tendo em vista a expressão da proteína associada à resistência a múltiplas drogas (MRP1), da enzima glutationa-S-transferase pi (GSTpi) e da proteína p53 com o desenvolvimento da resistência a múltiplas drogas (RMD) nas células neoplásicas, objetivou-se neste estudo avaliar a expressão desses três marcadores, pela imunoistoquímica, em 68 espécimes de neoplasias caninas, incluindo tumores venéreos transmissíveis (TVTC), mastocitomas, carcinomas mamários e de glândula hepatóides e linfomas. Os espécimes foram subdivididos em: TVT, Tumor venéreo transmissível (n=9); TVTR, TVTs resistentes à quimioterapia (n=5); MASTI, mastocitomas cutâneos grau I (n=8); MASTIII, mastocitomas cutâneos grau III (n=8); CARM, carcinomas mamários (n=14); CARH, carcinomas de glândulas hepatóides (n=8); LINFB, linfomas de células B (n=9); LINFT, linfomas de células T (n=7). Resultados mostraram que as expressões da MRP1, GSTpi e p53 foram observadas em 38 (55%), 43 (62,3%) e 50 (72,4%) espécimes, respectivamente. Em 27 (39,1%) espécimes houve coexpressão dos três marcadores. A expressão da MRP1, GSTpi e p53 isoladas ou associadas pôde ser observada em todos os grupos experimentais, exceto o grupo TVTC que não expressou a MRP1. A localização da marcação nas células tumorais foi citoplasmática para MRP1 e nuclear e/ou citoplasmática para a GSTpi e p53. Não foi observada diferença na expressão dos marcadores de resistência a quimioterapia em relação à resistência a quimioterapia (TVT e TVTR), gradação histológica (MASTI e III) e imunofenótipo (LINFB e T). Há relação direta entre o aumento da expressão da MRP1 e da GSTpi nos linfomas T. / Multidrug resistance in tumors involves the expression of multidrug resistance protein-1 MRP1, enzyme glutathione-S-transferase pi (GSTpi), and p53 protein. Therefore, this study aimed at evaluating the expression of these three markers, by immunohistochemistry, in neoplasic cells. Sixty-eight canine tumor samples, including transmissible venereal tumor (TVTC), cutaneous mast cell tumor, mammary carcinoma, hepatoid gland carcinoma, and lymphoma were studied. Samples were assigned into one of the following subgroups: TVT, transmissible venereal tumor (n=9); TVTR, chemoresistant TVT (n=5), MASTI, grade-I cutaneous mast cell tumor (n=8); MASTIII, grade-III cutaneous mast cell tumor (n=8); CARM, mammary carcinoma (n=14); CARH, hepatoid gland carcinoma (n=8); LINFB, B-cell lymphoma (n=9); LINFT, T-cell lymphoma (n=7). We observed that 38 (55%), 43 (62.3%), and 50 (72.4%) samples expressed MRP1, GSTpi, and p53, respectively. Co-expression of the three markers was present in 27 (39.1%) samples. Expression of MRP1, GSTpi, and p53 alone or associated could be observed in all experimental groups, except for TVT group which did not express MRP1. Staining in the tumor cells was cytoplasmatic to MRP1, and both nuclear and cytoplasmatic to GSTpi and p53. No significant difference in the expression of the markers could be observed with relation to chemoresistance (TVT and TVTR), histological grade (MASTI and MASTIII) and immunophenotype (LINFB and LINFT). A direct relation was present between the raise of the expression of MRP1 and GSTpi in T cells lymphoma.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-05Bitstream added on 2014-06-13T20:35:49Z : No. of bitstreams: 1 cardoso_pa_me_jabo.pdf: 283666 bytes, checksum: 9d4635249701354d18b4a667c65f5861 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de cepas de Escherichia coli produtoras de Shiga toxina (STEC) em queijos mussarela produzidos artesanalmente. Foram analisadas 59 amostras de queijo, produzidas no Vale do Jequitinhonha (Nordeste de Minas Gerais, Brasil). Isolando-se 147 cepas de E. coli e através da técnica de PCR, foram investigadas a presença dos genes da Shiga toxina (stx 1 e stx 2) e da intimina (eae). Dezesseis cepas bacterianas (10,8%) apresentaram o gene stx ( todas portavam o gene stx 1) e 13 delas também se mostraram eae positivas. Os isolados de E. coli foram também examinados para a detecção dos genes codificadores de adesinas (pap, sfa e afa). Não foram identificados nenhum desses genes.Todas as cepas STEC isoladas foram pesquisadas para resistência a 12 agentes antimicrobianos. As resistências predominantes detectadas foram de 37,5% para estreptomicina, 37,5% para a tetraciclina, 31,2% para a ampicilina e 31,2% para a amicacina. A resistência a múltiplas drogas foi encontrada em 5 cepas (31,2%). A presença dos genes codificadores dos fatores de virulência indica que o queijo mussarela produzido artesanalmente pode representar um risco à saúde dos consumidores. / The aim of the present study was to investigate the occurrence of Escherichia coli strains presenting the Shiga toxin gene (probably STEC strains) in mussarela cheese produced by artesanal method in the Jequitinhonha Valey (Northeast of Minas Gerais State, Brazil). Fifty-nine cheese samples were analyzed and a hundred forty seven strains of E. coli were isolated. Using the PCR method the strains were screened for the Shiga toxin (stx 1 and stx 2) and the intimin (eae) genes. Sixteen isolates (10,8%) carried the stx gene (all of them showed the stx 1 gene ) and thirteen also presented the eae gene. Using the same method the strains were screened for the presence of pap, afa, and sfa genes, adhesin genes caracteristics of the E. coli extraintestinal pathogenic strains (ExPEC). None of them showed these adhesin genes and could not be classified as an ExPEC strains. The susceptibility of the probably STEC strains to twelve antimicrobial drugs were evaluated. The most important resistance was detected to the streptomycin (37,5%), tetracycline (37,5%), ampicillin (31,2%) and amikacin (31,2%). The multidrug resistance was detected in 5 isolates (31,2%). The presence of coding genes for virulence factors in the E. coli isolates recovered from mussarela cheese produced by artesanal method could represent a risk for the human health.

O objetivo deste trabalho foi estudar a utilização de uma nanoemulsão lipídica (LDE) como vetor de oligonucleotídeos antissenso (OAS). A LDE é uma nanoemulsão constituída por 48% de éster de colesterol, 47,8% de fosfolipídeos, 2,3% de triglicérides e 1,9% de colesterol não-esterificado. É capaz de adquirir apoE de HDL e, desta forma, a emulsão pode interagir com o receptor B/E. O comportamento metabólico da LDE se assemelha ao da LDL. OAS agem como inibidores da função de genes, ligando-se à fita oposta (complementar) do RNA mensageiro (mRNA) ou à dupla fita do DNA. Previnem que o mRNA codifique uma proteína funcional. Os mecanismos celulares de resistência a drogas representam diversas formas de proteção da célula e do organismo e estão presentes na maioria das células normais, exercendo funções fisiológicas. Infelizmente, muitos tumores utilizam esses mecanismos para sua própria proteção. A proteína codificada pelo gene MDR1 (ABCB1), a P-gp, é uma glicoproteína de membrana com peso molecular de 170Kda, que funciona como uma bomba orgânica catiônica. Neste trabalho foi observado que o OAS se ligam à LDE, sendo a constante de ligação de 4,2 X 10-3M-1. O complexo OAS/LDE foi capaz de se ligar especificamente ao receptor de LDL e através desta via ser internalizado, pelas células de sarcoma uterino resistentes a doxorrubicina. Os OAS apresentaram após 24 horas distribuição citoplasmática e nuclear e após 48 horas, somente distribuição citoplasmática. Utilizando-se dois diferentes OAS, verificou-se que ambos foram capaz de inibir (70%) a expressão do gene de resistência a múltiplas drogas após 48 horas de incubação, tornando as células mais susceptíveis à ação da doxorrubicina. Assim, o complexo OAS/LDE é um sistema potencialmente promissor para ser utilizado em terapia gênica. / The objective of this study was to evaluate the usefulness of a nanolipid emulsion (LDE) as a vector to carry antisense oligonucleotides (OAS). LDE is a nanoemulsion consisting of 48% cholesterol esters, 47,8% phospholipid, 2,3% triglycerides and 1,9% unesterified cholesterol. It is able to obtain apoE from HDL and interact with B/E receptor. The metabolic behavior of LDE is similar to LDL. OAS are able to inhibit specific gene expression since they bind to a complementary sequence in the mRNA or in the DNA. This binding impairs the synthesis of a functional protein. The cell resistance mechanisms are present in most of normal cells, been involved in physiological process. Tumors are able to use these mechanisms to their own protection. The protein P-gp (MDR1 gene) is a glycoprotein with 170Kda that works as an organic cationic pump. We have observed that LDE was able to bind to the OAS; the binding constant was 4,2 X 10-3M-1. The complex was shown to bind to LDL receptors and then been internalized into a human sarcoma cell line resistant to doxirrubicine. After 24 hours the complex have shown citoplasmatic and nuclear distribution, after 48 hours only citoplasmatic distribution was observed. Two OAS were used. Both OAS strongly inhibited (by 70%) the cell MDR-1 gene expression after 48 hours of incubation and cells turned out to be more susceptible to doxorrubicine action. Therefore, OAS/LDE is promising complex to be used in gene therapy studies.

Orientadores: João Ernesto de Carvalho, Mary Ann Foglio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:15:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Longato_GiovannaBarbarini_D.pdf: 11931836 bytes, checksum: 6a9508b3296a68bdd39eb4630f1e89de (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O câncer é a segunda causa de morte da população nos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Caracteriza-se pelo desenvolvimento de células instáveis que tendem a não responder aos estímulos internos e externos que controlam a proliferação, diferenciação e morte celular. O crescente entendimento da biologia tumoral tem fornecido alvos moleculares para a triagem orientada de quimioterápicos e de agentes quimiopreventivos, geralmente de origem natural ou sintetizados com base em produtos naturais. A partir do extrato bruto diclorometânico das folhas de Piper regnellii foram isolados dois compostos, o eupomatenóide-5 e o apiol. O eupomatenóide-5 é uma neolignana cuja potencial atividade anticâncer foi demonstrada in vitro (cultura de células tumorais humanas) e in vivo (tumor sólido de Ehrlich) em trabalhos anteriores publicados pelo nosso grupo. Dentre as linhagens mais sensíveis, MCF-7 (mama) e 786-0 (rim) foram selecionadas para dar continuidade aos estudos de mecanismo de ação deste composto. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que o eupomatenóide-5 possui ação multialvo, uma vez que demonstraram claramente que existe um mecanismo de ação diferente para cada linhagem celular. Sugere-se que o efeito antiproliferativo do eupomatenóide-5 esteja associado com indução de apoptose em linhagem MCF-7 e necrose programada em linhagem 786-0. O apiol, outro composto isolado, é um fenilpropanóide com conhecida ação bloqueadora dos canais de cálcio. Sabe-se que a inibição de canais de cálcio tem relação com a reversão da resistência a múltiplas drogas (MDR) e, por este motivo, o efeito do apiol sobre a glicoproteína-P, uma das principais proteínas moduladoras dessa resistência, foi avaliado; entretanto o apiol não inibiu sua ação. Por outro lado, neste estudo foi possível evidenciar que embora tenha apresentado atividade citostática baixa para as linhagens tumorais, ele potencializou a atividade específica dos quimioterápicos doxorrubicina e vincristina quando associado a estes em linhagens tumorais com e sem fenótipo de resistência, sugerindo um efeito sinérgico. Além disso, o apiol potencializou a atividade antiproliferativa do eupomatenóide-5 e essa associação reduziu a quantidade de células tumorais de Ehrlich em modelo in vivo, sem sinais de toxicidade evidentes. Os resultados encorajam o aprofundamento desses estudos para a determinação dos mecanismos de ação envolvidos nas atividades anticâncer do eupomatenóide-5 e de reversão da MDR do apiol / Abstract: Cancer is the second leading cause of mortality worldwide. The loss of normal cell growth control is the main event in the development of cancer and includes specific steps known as cell proliferation, differentiation and apoptosis. Natural compounds are good source of new anticancer agents, being the investigation into cell death mechanisms involved in this activity a significant endeavor. From the crude dichloromethane extract of Piper regnellii leaves two compounds were obtained: eupomatenoid-5 and apiole. Eupomatenoid-5 is a neolignan whose in vitro (tumor cell line culture) and in vivo (Ehrlich solid tumor) anticancer activity was previously reported by our group. Among the cancer cell lines most sensible to eupomatenoid-5 treatment, MCF-7 (breast) and 786-0 (kidney) were chosen to continue the cell death mechanism of action studies. The results obtained suggest that eupomatenoid-5 is a multiple-target compound. Our findings support the possibility that eupomatenoid-5 might be acting in both cell death via: apoptosis in MCF-7 cell line and programmed necroptosis in 786-0 cell line. Apiole, the other compound isolated, is a phenylpropanoid and a calcium channel blocker. Recent pharmacological studies have reported the ability of several calcium channel blockers to reverse the multidrug resistance (MDR) and, therefore, the effect of apiole on P-glycoprotein (P-gp), the main protein involved in MDR, was evaluated. Apiole did not inhibit P-gp and, moreover, presented low cytotoxic activity for the most tumor cell lines. Nonetheless, the combined therapy with chemotherapies (doxorubicin and vincristine) was efficient in potentializing their antiproliferative action in tumor cell lines with or without resistance phenotype, suggesting synergic effect. Furthermore, apiole potentiated the antiproliferative activity of eupomatenoid-5 and this association reduced the in vivo tumor cell quantity with no side effects. The results encourage further studies to be developed with the aim to determine the mechanisms of action involved in the anticancer activity of eupomatenoid-5 and in the MDR reversion by apiole / Doutorado

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-29 / Introdução: O carcinoma renal (CR) é relativamente raro comparado a outros cânceres. Um dos mais potentes mitógenos tumorais, o fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, é regulado por inúmeras vias, particularmente Ras e Akt, que são alvo de inúmeros agentes terapêuticos, dentre eles o sorafenibe. Estas vias de sinalização têm importante papel no desenvolvimento e manutenção da resistência a múltiplas drogas (MDR). A Echinácea purpúrea é utilizada como tratamento alternativo para alguns tipos de câncer, sendo promissora para a terapêutica de CR. Objetivo: Analisar o efeito da Echinácea purpúrea (Ech) na viabilidade celular, apoptose, nas vias de sinalização Ras e Akt, bem como na angiogênese tumoral através do VEGF e potenciais alterações na resistência a múltiplas drogas. Métodos: O fitoterápico Ech, foi adicionado à cultura de células Caki-1 para posterior análise da viabilidade celular (Cristal Violeta), apoptose (Citometria de fluxo), liberação da enzima Lactato Desidrogenase – DHL (Bio 200) e expressão protéica do VEGF, Ras e Akt (Western blot) e expressão gênica MDR, MRP, LRP (PCR-RT). Os experimentos foram realizados após 24, 48 e 72 horas de tratamento. Os resultados foram analisados pelo teste Anova One Way, com p<0,001 vs CT (X ± EP vs CT). Resultados: Os grupos tratados com Ech demonstraram diminuição significante da viabilidade celular, dose e tempo dependentes comparado aos seus controles. Nós observamos um aumento significante na porcentagem de células apoptóticas no grupo de 72 horas comparado com o grupo controle: 4,7±0,4 vs. 7,6±0,7 (p<0,001), respectivamente. Também, observamos diminuição na expressão protéica (p<0,001) da Akt (0,301±0,02 vs. 0,193±0,009) e VEGF (0,729±0,01 vs. 0,439±0,01) em 48 horas, bem como com 24 horas na proteína Ras (0,484±0,05 vs. 0,289±0,02). Analisando a expressão gênica das proteínas de resistência a múltiplas drogas, Ech causou diminuição substancial de 100% para as proteínas MDR e MRP e decréscimo de 25% na proteína LRP, sugerindo importante efeito nestas proteínas. Conclusão: Baseado em nossos resultados, observamos que a Ech apresenta propriedades anti-oncogênica, uma vez que demonstrou atividade sobre a viabilidade e apoptose celular. Da mesma forma, Ech apresentou importante papel sobre as vias de sinalização Akt e Ras, sendo estas importantes mediadoras da progressão do ciclo celular e do processo apoptótico. Essas vias inibidas demonstraram importante papel na inibição do VEGF, assim como, na regulação da resistência a múltiplas drogas. / Introduction: The renal cell carcinoma (CR) is relatively rare compared to other cancers. One of the most potent tumor mitogen, vascular endothelial growth factor, VEGF is regulated by numerous pathways, especially Ras and Akt, which are targets of many therapeutic agents, among them sorafenib. These signaling pathways play an important role in the development and maintenance of the multidrug resistance (MDR). Echinacea purpurea is used as an alternative treatment for some cancers, and promising for the treatment of CR. Aim: Analyze the effect of Ech purpurea (Ech) on the cellular viability, apoptosis, Ras and Akt signaling pathway as well as tumor angiogenesis throughout VGEF and potential proteins alteration in the cellular resistance to drugs. Methods: Herbal echinacea were added to cell culture Caki-1 for subsequent analysis of cell viability (Crystal Violet), apoptosis (flow cytometry), release of the enzyme lactate dehydrogenase - LDH (Bio 200), protein expression of VEGF, Ras and Akt (Western blot ) and gene expression MDR, MRP, LRP (RT-PCR). The experiments were performed after 24, 48 and 72 hours of treatment. The results were analyzed by One Way ANOVA, p <0.001 vs CT (X ± SE vs CT). Results: Group treated with Ech demonstrated decrease in cell viability dose and time dependent compared to the control (IC50, 150mg/mL) from 0 to 300ug/mL (p<0.001). We observed a statistically significant increase of apoptotic cells for group 72 hours comparing with control group: 4.7±0.4 vs. 7.6±0.7 (p<0.001), respectively. Also, a decrease in protein expression (p<0.05) of the Akt (0.301±0.02 vs. 0.193±0.009) and VEGF (0.729±0.01 vs. 0.439±0.01) in 48 hours, as well as Ras in 24 hours (0.484±0.05 vs. 0.289±0.02) were obtained. By analyzing the genic expression of the proteins resistance to multiple drugs, Ech caused a substantial decrease of 100% for MDR and MRP with 25% decreases in LRP, suggesting an important effect in blunt the resistance protein to drugs. Conclusion: To our knowledge, the Ech has anti-oncogenic properties since it showed activity on the viability and apoptosis. Likewise, Ech has its role on the signaling pathways Akt and Ras, which are important mediators of cell cycle progression and apoptosis. These blunted pathways demonstrated an important role on VEGF inhibition, as well as in the regulation of multidrug resistance. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações