La mayoría de los estudios sobre la activación glial utilizan cultivos puros o mixtos de células gliales, y en general, los agentes que se emplean para inducirla ejercen directamente sobre las células gliales. En contraste, hay pocos trabajos donde se considere la muerte neuronal como el estímulo que se desencadena la activación glial. Se desconoce la señal que desencadena la activación glial en respuesta al daño neuronal, pero se sugiere que tanto alteraciones en los contactos neurona-glía como la presencia de determinados factores solubles secretados por las neuronas dañadas pueden jugar un papel importante en este proceso. En este trabajo se profundizó en el conocimiento del papel de la glía en respuesta al daño neuronal y del proceso de activación glial desencadenado por dos modelos de muerte neuronal: la muerte neuronal por excitotoxicidad mediante concentraciones elevadas de glutamato y la muerte neuronal por apoptosis mediante la deprivación de K+ del medio de cultivo. Se ha comprobado que las células gliales de cultivos neurona-glía de cerebelo responden al daño neuronal con cambios funcionales asociados con una activación glial, tal como ocurre in vivo. Sin embargo, aunque en los dos modelos experimentales de daño neuronal utilizados (excitotoxicidad y apoptosis) se produce la muerte de la mayoría de las neuronas a las 24 h, hay diferencias en la respuesta de los distintos parámetros gliales evaluados en función del tipo de muerte neuronal inducida. En respuesta a la muerte neuronal por excitotoxicidad, en las células gliales hay producción o activación de factores relacionados con una respuesta proinflamatoria, incrementan su proliferación y su actividad fagocítica. En respuesta a la muerte neuronal por apoptosis las células gliales no producen moléculas proinflamatorias ni proliferan, pero su actividad fagocítica se induce de manera más rápida que en el modelo de excitotoxicidad. En este caso, la activación glial queda restringida a la detección y eliminación de las neuronas dañadas sin que haya producción de factores que puedan amplificar la activación glial y transformarla en nociva. Los resultados obtenidos muestran que el estado en que se encuentran las células gliales puede tener un papel importante en la respuesta neuronal a estímulos nocivos. Esto podría ser de gran importancia para el diseño de estrategias que permitan potenciar aquellas propiedades protectoras de las células gliales activadas o inhibir aquellas que son nocivas para las neuronas, con la finalidad de favorecer los mecanismos de neuroprotección ante un determinado estímulo nocivo. / In physiological conditions, glial cells play a key role in the normal function of the central nervous system (CNS) both during development and in the adult. Moreover, they are essential to the response of the CNS to pathological conditions. Astroglial and microglial cells respond to neuronal damage with morphological and functional changes and thus become reactive or activated glial cells. Given the complexity of studying glial activation in vivo, numerous authors have approached the subject using in vitro experimental models. However, most experimental approaches use glial cell cultures, and/or the stimulus used to induce glial activation is an in?ammatory agent or a mixture of cytokines that have a direct effect and cause signi?cant modi?cations of glial cells. In contrast, comparatively few studies have addressed glial activation in the presence of neurons employing neuronal damage as the inducing stimulus. The nature of the signal that induces glial activation in response to neuronal damage remains unknown, although direct contact between neuronal and glial cells as well as soluble factors delivered by the damaged neurons probably play an important role.In the present work, we have studied glial activation occurring in cerebellar neuronal-glial cell cultures in response to different forms of neuronal death. First, these neuronal-glial cultures were exposed to a high concentration of glutamate, which induces excitotoxic neuronal death. Second, we exposed cerebellar neuronal-glial cultures, which need to be cultured in a medium containing a high concentration of K+ (25 mM K+), to serum-free medium containing a normal concentration of K+ (5 mM K+), a well established and widely used model of apoptosis in cerebellar granule neurons.Our results show that glial cells in neuronal-glial cultures respond to neuronal damage with functional changes associated with glial activation, as occurs in vivo. However, the pattern of response differs depending on the kind of damage induced in the neurons. Although the two experimental models of neuronal damage used (excitotoxicity and apoptosis) resulted in the death of most neuronal cells after 24 h, differences were observed in the response of the various glial parameters evaluated.In the presence of excitotoxic neuronal death, glial cells increase their production of agents associated with an in?ammatory response, as well as proliferate and become phagocytic. This appears to be a drastic reactive response of glial cells that, on the one hand, clears the extracellular milieu of any neuronal debris or factors released by the dying neurons that may negatively affect the cellular homeostasis, and on the other, results in the production of factors that in turn can be deleterious for the remaining live cells. In contrast, glial cells do not produce pro-in?ammatory molecules in the presence of apoptotic neuronal death, but phagocytic activity is quickly induced. In this case, glial activation appears to constitute a preventative response resulting from a crosstalk between dying neuronal cells and glial cells, aimed at preventing alterations in the extracellular milieu through the release of injuring factors by dying neurons, as well as limiting the glial response as much as possible.Our results show that the response of neurons to a certain stimulus depends on the presence of glial cells. Our results also show that different aspects of glial activation are independently regulated in response to neuronal damage. It would be of interest to identify the different signal transduction pathways involved in each case. In this way, it may be possible to speci?cally interfere with individual aspects of glial activation in order to favour actions of reactive glial cells that could help neurons to overcome a negative stimulus and, likewise, to inhibit activities that enhance neuronal damage.

Ante el hallazgo de Rane et.al (1999) que la Cdk4 es esencial para la proliferación post-natal de la célula beta y de que su hiperactividad (modelo Cdk4R24C) causa hiperplasia de las células beta, las hipótesis de trabajo planteadas fueron: 1. A pesar del efecto de la molécula Cdk4 en la proliferación de la célula beta, la hiperactividad de la Cdk4 no debe alterar la fisiología del islote.2. La molécula Cdk4 puede estar implicada en la proliferación de las células beta de los islotes pancreáticos humanos, del mismo modo que ocurre en los ratones. Si éste es el caso, la Cdk4 constituiría una diana terapéutica potencial en el proceso de regeneración de la masa beta-celular, para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1.3. La hiperplasia beta celular provocada por la molécula Cdk4R24C induce tolerancia inmunológica hacia los autoantígenos pancreáticos de la DMT1 en la cepa NOD, y al mismo tiempo, provee al organismo de una fuente de regeneración de la masa beta-celular ya destruida a partir de las células beta aún existentes. De esta forma, la hiperplasia de la masa beta-celular inhibe el proceso autoinmune y repara el daño ocasionado por el mismo.Los resultados obtenidos se resumen a continuación:1. La hiperplasia de la célula beta pancreática no provoca cambios ni en la glicemia ni en la insulinemia de los ratones Cdk4R24C CD1/129Sv. 2. La mutación Cdk4R24C en un background CD1/129Sv no provoca cambios fisiológicos destacables (biosíntesis y conversión de proinsulina a insulina y oxidación/utilización de glucosa) en la célula beta, a pesar de la hiperplasia pancreática que provoca. 3. Los ratones Cdk4R24C CD1/129 tienen un retorno más rápido a los niveles basales de glicemia después de un estímulo intraperitoneal de glucosa, debido a una mayor secreción de insulina. 4. Los islotes humanos infectados con vectores lentivirales portadores de la mutación Cdk4R24C tienen una mayor proliferación, y esta proliferación es debida al aumento de proliferación de la célula beta.5. La mutación Cdk4R24C en un fondo genético de susceptibilidad a padecer DMT1 (NOD), provoca una aceleración de la diabetes tanto en los machos como en las hembras Cdk4R24C NOD y un aumento de incidencia de la enfermedad en los machos.6. La aceleración y aumento de la incidencia en machos es debida a la mayor proliferación de los linfocitos procedentes de nódulos linfáticos frente al péptido de insulina B12-25, una mayor activación de los esplenocitos, un aumento de la proliferación basal de los esplenocitos y una disminución de la susceptibilidad a la apoptosis.7. La aceleración de la diabetes en hembras es debida a una proliferación superior de los esplenocitos frente al péptido GAD p65, unos niveles superior de CD3 en su superficie, un número superior de células CD4 activadas y un aumento de los niveles de la proteína GFAP en el páncreas de las hembras Cdk4R24C/R24C. 8. En el modelo Cdk4R24C NOD/SCID, con ausencia de linfocitos T y B, la mutación R24C disminuye la incidencia acumulativa de diabetes por transferencia adoptiva de linfocitos de animales pre-diabéticos WT, pero no retrasa su aparición.Ante estos resultados podemos concluir que:1. La expresión de la Cdk4R24C en un background CD1/129Sv no provoca cambios fisiológicos destacables en los islotes pancreáticos. 2. La forma mutada de la proteína Cdk4 (Cdk4R24C) induce una proliferación de la célula beta humana dependiente de glucosa. 3. La expresión ubicua de la Cdk4R24C en un fondo genético NOD, predispuesto genéticamente a padecer DMT1, exacerba el fenotipo diabético. Dicha exacerbación es debida a la hiperactividad del repertorio inmunológico ocasionada por la presencia de la mutación R24C.4. La expresión de la Cdk4R24C en la célula beta, con ausencia de linfocitos T y B mutados, protege del ataque autoinmune por transferencia de linfocitos WT.

La adiponectina es una adipocitoquina sintetizada y secretada exclusivamente por el tejido adiposo. Actúa en diversos órganos y tiene propiedades anti-diabéticas y anti-aterogénicas, además de ser una de las hormonas con mayores propiedades sensibilizadoras de la insulina. La adiponectina ejerce sus efectos en el metabolismo de la glucosa y los lípidos a través sus receptores, adipoR1 y adipoR2. En el primer trabajo se demostró que la expresión de adipoR1 en IAAT no estuvo alterada en obesidad ni diabetes en tejido adiposo intraabdominal humano y se correlacionó con los niveles plasmáticos de FFA, mientras que la expresión de adipoR2 en IAAT se encontró disminuida en obesidad y diabetes en tejido adiposo intraabdominal humano y se asoció con componentes metabólicos implicados en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular en la obesidad. Dada la importancia de la expresión de adiponectina y sus receptores, así como también de otras adipocitoquinassecretadas por el adipocito maduro en la patogenia de la obesidad y la diabetes, entender los mecanismos epigenéticos de la activación transcripcional en la diferenciación fue el objetivo de nuestro segundo estudio. Para esto examinamos las modificaciones pos-traduccionales de la histona H3 en los promotores de genes adipogénicos claves tanto de expresión temprana como tardía durante todo el proceso de la adipogenesis.Mediante el uso de la técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), realizados en células 3T3-L1 en diversos días durante el proceso de diferenciación adipocitaria, demostramos que los promotores de adiponectina, glut4, gpd1 y leptina están enriquecidos en dimetilación de H3-K4 en el día 0 de diferenciación (D0), cuando ninguno de estos genes está aún expresado. Un estudio detallado del locus de adiponectina reveló que la dimetilación de H3K4 en estas células indiferenciadas está limitada en la región promotora, donde se encontró además asociada con ocupación de la RNA pol II. El inicio de la transcripción de adiponectina, coincide con la hiperacetilación de H3 (D3-4) y con la trimetilación de H3K4 en la región promotora de la misma (D2-3). Este mismo patrón de modificación de histonas se observó en células primarias de ratón pero no en fibroblastos de ratón 10T/2, que aún no está comprometida hacia la línea adipogénica. La inhibición parcial de la dimetilación en H3K4 mediante el tratamiento con el inhibidor resultó en una disminución de la expresión de apM1, así como también en una disminución en la adipogénesis, detectada por una disminución en la incorporación de lípidos. En resumen, el segundo trabajo de esta tesis, muestra que la dimetilación en H3K4 y el reclutamiento de la RNA polII en los promotores de genes adipogénicos claves son marcas distinguibles de células que están determinadas y se han comprometido hacia la línea celular adipogénica. Estas mismas marcas, están ausentes en las mismas regiones de los promotores, en células pluripotenciales que representan un paso previo en el proceso de diferenciación desde células totipotenciales a adipocitos maduros y en los promotores de genes que se encuentran silenciados y no se expresan en células determinadas hacia la línea adipogénica (3T3-L1). En adipocitos diferenciados, la transcripción activa de estos genes es acompañada por hiperacetilación en H3, di y trimetilación en H3K4, así como también la extensión de estas modificaciones hacia las regiones codificantes del gen. La dimetilación en H3K4 es necesaria para la expresión génica de adiponectina, así como también para el desarrollo de una normal diferenciación adipocitaria. No obstante, son necesarios más estudios para dilucidar cuales son los factores de transcripción y cofactores necesarios en el establecimiento de dicho patrón.

L'increment de la prevalença de l'obesitat durant les últimes dècades conjuntament amb el limitat efecte sobre la perduda de pes corporal, així com els diversos efectes adversos produïts pels tractaments actualment disponibles, impliquen la necessitat de trobar noves aproximacions terapèutiques al tractament d'aquesta malaltia. El tungstat sòdic s'ha mostrat com un nou i potencial agent per al tractament de l'obesitat, mitjançant l'increment de la despesa energètica i la reducció del guany ponderal com s'ha observat en rates amb obesitat induïdes per la dieta. A causa del paper clau de la leptina com citocina reguladora de l'homeòstasi energètica, l'objectiu d'aquest estudi ha estat la determinació de la implicació de la leptina en l'efecte reductor de guany ponderal del tungstat.El tractament amb tungstat en models deficients en la leptina o el receptor de la leptina, perd el seu efecte sobre la reducció del pes corporal i de la ingesta, i sobre l'increment de la despesa energètica. Els ratolins ob/ob trasplantats amb teixit adipós de ratolins control, recuperen parcialment els nivells circulants de leptina, el que provoca un reducció del pes corporal i la ingesta, a més d'un increment en la despesa energètica. Aquests efectes en els ratolins trasplantats es van veure magnificats com a conseqüència del tractament amb tungstat. Els animals sense deficiències en la sistema de senyalització de la leptina també redueixen la ingesta i el pes corporal i incrementen la despesa energètica en resposta al tungstat, i a quests efectes estan acompanyats de canvis en el perfil d'expressió gènica en el teixit adipós marró, contràriament al que s'observa en els animals amb deficiències en leptina, en els que no hi ha canvis en el teixit adipós marró.L'expressió hipotalàmica dels gens Npy, Agrp i Cart, involucrats en la regulació de l'homeòstasi energètica mitjançant la leptina, està modificada pel tractament amb tungstat d'una forma depenent a la leptina. Aquests resultats indiquen que el tungstat es comporta com un potenciador de l'acció de la leptina per a reduir la ingesta i incrementar la termogènesis mitjançada pel teixit adipós marró, promovent la reducció del guany ponderal i l'adipositat. A més l'acció del tungstato està mitjançada, com a mínim en part, per la potenciació dels efectes de la leptina en l'hipotàlem. / The worldwide increasing prevalence of obesity last decades and the limited effects on body weight (BW) loss as well as several adverse effects of current available treatments, implies the necessity to find new approaches to treat this disease. Sodium tungstate has been evidenced as a potential novel agent to treat obesity, by increasing energy expenditure and reducing BW gain in diet induced obese (DIO) rats. Since leptin is a key regulator of energy homeostasis, the aim of the current study was to determine the implication of this adipocytokine on tungstate antiobesity effects. Tungstate treated leptin deficient animals did not change BW, food intake (FI) or whole-body energy expenditure (EE). Wild-type adipose tissue transplanted ob/ob mice partially restored circulating leptin levels leading to a reduction of BW, FI, and an increase of EE. Magnified effects were recorder in these animals with tungstate treatment. Animals with no deficit in the leptin signaling system also reduced FI and BW and increased EE in response to tungstate, acompanied with gene expression changes in brown adipose tissue (BAT), in contrast to leptin deficient animals in which no BAT changes were detected. Hypothalamic Npy, Agrp and Cart gene expression, involved in leptin regulation of energy homeostasis, were modified by tungstate in a leptin-dependent manner. These results indicate that tungstate behaves as an enhancer of leptin actions to reduce FI and increase BAT mediated thermogenesis, promoting the reduction of BW gain and adiposity. Furthermore tungstate actions are partially mediated by enhancing the hypothalamic leptin effects.

La memoria titulada "Estudio de los mecanismos implicados en la neurodegeneración estriatal en modelos murinos de la enfermedad de Huntington" ha perseguido determinar la implicación de las neurotrofinas endógenas BDNF y la NT-3 en la susceptibilidad de las neuronas estriatales en modelos transgénicos y excitotóxicos de la enfermedad de Huntington, estudiar la implicación de los agregados intraneuronales y de la excitotoxicidad mediada por los receptores NMDA en modelos transgénicos de la enfermedad de huntington y analizar el potencial de dos aproximaciones terapéuticas para la enfermedad de Huntington basadas en la administración de BDNF intra-estriatal o en el silenciamiento del gen causante de la patología. En dicha memoria se han empleado modelos murinos de la enfermedad de Huntington, el modelo excitotóxico y diversos modelos transgénicos con alteraciones específicas de los niveles de BDNF o la NT-3, ratones condicionales de la huntingtina mutada, así como también cultivos primarios y de precursores neuronales estriatales. Los resultados se han presentado como 3 artículos científicos originales publicados en revistas indexadas ("The Journal of Neuroscience" y "Neuroscience") y un artículo original en fase de preparación. Además, se ha realizado una discusión conjunta de los resultados presentados en los diferentes artículos científicos cumpliendo completamente con lo objetivos planteados. En conjunto, los resultados aportan datos relevantes que ayudan a entender la fisiopatología de la enfermedad de Huntington y la fisiología de las neuronas estriatales. En esta tesis se ha determinado que la disminución de los niveles de neurotrofinas afecta diferencialmente la susceptibilidad de las neuronas estriatales en modelos murinos y excitotóxicos de la enfermedad de Huntington. Así, el BDNF es el factor que modula el inicio y la severidad de la alteraciones motoras asociados a la degeneración selectiva de las neuronas estriatales de proyección en el modelo transgénico R6/1. Por su parte es la NT-3 el factor neurortófco que modula la susceptibilidad excitotóxica de las neuronas estriatales al regular la expresión de los receptores de glutamato tipo NMDA. Además, se ha demostrado que la toxicidad de los agregados intraneuronales presentes en los modelos transgénicos de la enfermedad de Huntington podría depender de su ubicación y el grado de empaquetamiento de la huntingtina dentro del agregado, puesto que dos modelos con el mismo número de agregados estriatales difieren significativamente en el grado de neuropatología estriatal. Además, se logró la reversión total de la patología en un modelo transgénico condicional a pesar de la presencia de agregados de tipo amiloideo, sugiriendo que este tipo de agregados no constituyen la especie más tóxica de la huntingtina mutada. Por último, se ha demostrado que los tratamientos basados en la administración del BDNF o en el silenciamiento del gen de la huntingtina mutada son capaces de revertir ciertas alteraciones neuropatológicas y funcionales de las neuronas estriatales en modelos transgénicos de la enfermedad de Huntington, apoyando la hipótesis de que estas herramientas constituyen alternativas terapéuticas efectivos para la enfermedad de Huntington.

El pàncreas és una glàndula amb una porció tant endocrina com exocrina que regula l'absorció, emmagatzematge i utilització dels nutrients digerits. Concretament, les cèl·lules beta són les responsables del manteniment dels nivells de glucosa de l'organisme, i en el cas de malalties com la diabetis mellitus tipus 1 són destruïdes per mecanismes autoimmunes. Per substituir aquest tipus cel·lular seria interessant aillar cèl·lules troncals adultes i dirigir la seva diferenciació cap a un fenotip de cèl·lula productora d'insulina.Els transportadors de resistència a multidrogues ABCG2 s'han proposat recentment com a marcadors de cèl·lules troncals en diferents teixits adults. Concretament en el pàncreas, on encara hi ha controvèrsia sobre l'origen i localització de les cèl·lules troncals, aquest marcador podria identificar a la possible població cel·lular troncal amb implicacions en el procés de transdiferenciació endocrina. L'aproximació experimental d'aquesta tesi es basa en aillar la població ABCG2(+) de pàncreas de rata i realitzar una caracterització del seu fenotip i propietats.Els nostres resultats indiquen que les cèl·lules obtingudes corresponen al fenotip de cèl·lules pancreàtiques estrellades, tant en estat quiescent com en estat actiu. A més, hem detectat la presència de marcadors de diferents tipus de cèl·lules troncals adultes en el cultiu: nestina, NCAM, FGFR1-IIIb, Thy-1,1. Posteriorment hem evaluat la seva capacitat de transdiferenciació en fenotip endocrí, concretament de cèl·lula productora d'insulina, a través del cultiu en Matrigel (matriu extracel·lular comercial) i exendin-4 (anàleg de GLP-1). Aquest tractament indueix en les cèl·lules estrellades en estat quiescent l'expressió del transportador Glut2, les convertases d'insulina PC1/3, PC2, així com la presència de pèptid C i la secreció d'insulina en resposta a estimulació amb glucosa.La secreció de factors solubles per part de les cèl·lules estrellades amb fenotip actiu és un fet àmpliamente conegut, així que ens vam plantejar caracteritzar mitjançant proteòmica el secretoma d'aquestes cèl·lules, i estudiar possibles efectes paracrins de les molècules identificades sobre la població ductal. El medi condicionat provinent de cèl·lules estrellades pancreàtiques provoca una inhibició significativa de la proliferació de les cèl·lules ARIP tractades, així com canvis d'expressió gènica a les mateixes (disminució del marcador ductal CK19, i increment del factor de transcripció PDX1, crucial en la diferenciació endocrina). Els resultats suggereixen que TGF1 secretat per les cèl·lules pancreàtiques estrellades inhibeix la proliferación de les cèl·lules ARIP ductals tractades amb medi condicionat. De l'estudi del secretoma destaquem la identificació de 37 proteïnes solubles i 24 proteïnes intracel·lulars. Algunes d'aquestes molècules identificades per primera vegada en el secretoma d'aquest tipus cel·lular com PEDF o LIF, podrien exercir els canvis d'expressió gènica observats en les cèl·lules ARIP tractades amb medi condicionat provinent de cèl·lules pancreàtiques estrellades.En resum, tant les cèl·lules pancreàtiques estrellades com el seu secretoma obren noves vies d'investigació amb implicacions en processos de regeneració pancreàtica. / Numerous studies have reported that certain stem cells are characterized by the expression of ABCG2 transporter. In the present study we aim to identify new ABCG2(+) pancreatic cell populations and to explore their properties. We isolated and expanded ABCG2(+) cells from pancreata of lactating rats. The expanded cell population demonstrated a phenotype of pancreatic stellate cells (PaSC). The cell culture in Matrigel plus exendin-4, led to an increase in PDX-1 expression and induction of CK19. Moreover, endocrine genes, such as insulin, IAPP, glucagon, GLUT2, chromograninA, and convertases PC1/3, and PC2 were also detected. Immunocytochemical analysis showed co-localization of insulin and C-peptide, while ultrastructural studies revealed the presence of endocrine granules. Insulin secretion of these cells was detected in the cell culture medium. Active pancreatic stellate cells secrete many soluble factors important in pancreas physiology. Most of them are associated with fibrosis and matrix turnover. However, other roles including paracrine effects on  cell progenitors have not been investigated. In pancreas, there is no consensus on the nature of the adult pancreatic stem cells or where these progenitors are located. Ductal cells with capacity of transdifferentiation into endocrine phenotype have been described, but the external and morphogenic signals that determine their differentiation are still unknown.Subsequently, we characterized for the first time the PaSC secretome, and we identified 61 proteins using two-dimensional electrophoresis (2D) coupled to mass spectrometry MALDI-TOF and peptide mass fingerprinting. The conditioned media from the obtained PaSC was used to culture ARIP ductal cell line for 24 or 72 hours, and we analysed possible changes in a proliferation and differentiation level. We concluded that this media can reduce by 40% ARIP proliferation without affecting their viability, and the molecule responsible of that effect is TGF1 secreted by PaSC. This conditioned media also reduces 0,48-fold ductal marker CK19 mRNA expression, and can increase 5,4-fold PDX1 mRNA in this cell line, a transcription factor crucial in pancreatic endocrine differentiation. We localize in the PaSC secretome several novel proteins that could be involved in differentiation processes, such as PEDF, Wnt5b and LIF.

El síndrome de Down (SD) se caracteriza por retraso mental, alteraciones motoras y la aparición de neuropatología tipo Alzheimer a edades tempranas. En el adulto con SD, los cambios neurodegenerativos presentan características diferenciales respecto a las observadas en la EA, pese a que comparte sus signos neuropatológicos. Estas diferencias se deben a que el proceso neurodegenerativo es consecuencia específica de las alteraciones en el neurodesarrollo y la plasticidad neuronal. La hipótesis del efecto de dosis génica en el síndrome de Down (SD) se basa en que el desequilibrio de dosis de genes específicos conduciría a niveles elevados de proteínas concretas con consecuencias fenotípicas. Sin embargo sólo algunos de ellos podrán tener consecuencias observables debido a posibles efectos compensatorios. Proponemos que Dyrk1A es uno de esos genes dosis-sensibles que en base a su patrón de expresión y a los sustratos de fosforilación identificados, podría participar en las alteraciones motoras, cognitivas y el proceso neuropatológico tipo EA en personas con SD a través de la afectación de la neuritogénesis y la neuroplasticidad.DYRK1A es un gen del cromosoma 21 que codifica para una serin-treonin quinasa de actividad dual que se expresa principalmente en médula espinal, cerebelo y núcleos motores relacionados y en estructuras prosencefálicas. Recientemente se ha implicado Dyrk1A en procesos de proliferación y diferenciación neuronal, en la regulación del ciclo celular, en aprendizaje y memoria y en procesos neurodegenerativos.El objetivo general de esta Tesis Doctoral consiste en determinar el papel del gen DYRK1A en el proceso degenerativo presente en el SD, tanto durante el neurodesarrollo como el asociado al envejecimiento y sus mecanismos patogenéticos, utilizando como aproximación experimental modelos de ratón genéticamente modificados con diferente dosis de este gen. Se aborda la descripción y caracterización del impacto de cambios en los niveles de expresión de Dyrk1A en el proceso neurodegenerativo y se estudian los aspectos mecanísticos que posiblemente subyacen a estos procesos, tanto a nivel neuroquímico, centrándonos en dos sistemas de neurotransmisión específicamente relacionados con función cognitiva, como a nivel celular, donde principalmente abordamos aspectos relacionados con neuritogénesis.Nuestros resultados implican a Dyrk1A en el deterioro asociado a la edad de la función motora y la memoria reciente, posiblemente a través de la alteración en los sistemas de neurotransmisión dopaminérgico y colinérgico, respectivamente. Además, sugieren que la sobreexpresión de Dyrk1A tiene consecuencias patogenéticas en los procesos de neuritogénesis, probablemente a través de la modulación de la dinámica del citoesqueleto de actina. Estas alteraciones podrían ser responsables de la falta de efectos cognitivo-conductuales observada en ratones transgénicos en el modelo den neuroplasticidad in vivo (enriquecimiento ambiental). / Aging in Down syndrome (DS) is accompanied by neuropathological features of Alzheimer's disease (AD). In fact, a close relationship exists between both pathologies, so that DS has been proposed as a model to study the predementia stages of AD. The goals of this work were to understand the pathogenic mechanism of AD related to genetic environments associated with DS. To this end we focused on a candidate gene overexpressed in DS, Dyrk1A. Dyrk1A is a serin treonin kinase that has been proposed to participate in neurogenesis, cognitive processes and DS neuropathology. We analyzed the role of Dyrk1A in the altered structural plasticity, neurogenic processes and cognitive function during the AD progression in DS, using murine models with different Dyrk1A dosage. Behavioural, histological and neurochemical studies showed a role of Dyrk1A in AD in DS. Our results involved Dyrk1A in the age-associated decline of motor function and recent memory, possible through an alteration in the dopaminergic and colinergic neurotransmitter systems respectively. Moreover, Dyrk1A overexpression had pathogenetic consecuences in the neuritogenesis process, probably affecting the actin cytoskeleton dynamic regulation. Theses alterations might be responsables of the lack of cognitive/behavioural effects observed in transgenic mice in the in vivo neuroplasticity model.

La presente tesis posee una introducción donde se plantea y explica la sintomatología, genética y fisiopatología de la enfermedad de Huntington (EH). También explicamos los distintos modelos animales usados para el estudio de la enfermedad y resaltamos su relevancia para propuestas terapéuticas. Seguidamente introducimos lo que son las ideas principales de la tesis. Estas son, el interés por el estudio de los procesos fisiopatológicos de aparición más temprana para la planificación terapéutica adecuada, la importancia de la neurotrofina llamada BDNF como reguladora de la mayoría de todos estos procesos y, finalmente, la propuesta de una línea de intervención mediante el uso de terapia génica-celular teniendo en cuenta los dos primeros puntos. Los resultados que hemos obtenido en esta tesis indican y muestran que existe una alteración clara y temprana de múltiples moléculas sinápticas relacionadas con la plasticidad sináptica y, además, estos se encuentran altamente relacionados con los primeros síntomas (cognitivos) detectables en todos los modelos animales estudiados. Adicionalmente, encontramos que la neurotrofina BDNF es uno de los mayores reguladores de estos procesos y por eso la proponemos como elemento terapéutico potencial principal. Como consecuencia a este último punto, se diseñaron unos animales transgénicos, en colaboración con los Drs. Friedman y Patterson de la Universidad McGill de Canadá, que sobre-expresa BDNF solamente en astrocitos. Se aislaron estos tipos celulares de estos animales transgénicos, se cultivaron y se expandieron para luego utilizarlos como terapia celular en modelos animales transgénicos transplantándolos intra-cerebralmente con resultados bioquímicos, morfológicos y funcionales satisfactorios. Conjuntamente, todos estos puntos nos sirven para demostrar que una terapia temprana centrada en las alteraciones sinápticas y mediante la administración de BDNF controlada tiene el potencial de mejorar la sintomatología en la EH o retrasar significativamente su aparición sin efectos colaterales adversos importantes. / The present thesis has an introduction where the symptomatology, genetics and physiopathology of Huntington's Disease (HD) are explained. Distinct mouse models used in the present thesis and their usefulness are also exhibited. Next, the main ideas and messages of the thesis are presented; first, the interest to study the earliest physiopathologic processes in order to draw up a plan for therapeutics. On the other hand, we focused on the relevance of the neurotrophin namely BDNF in the modulation of the disease. Finally, is also proposed the use of gene/cell therapy accordingly to the first two aims of the thesis. The results obtained show and demonstrate the existence of clear and early alterations of several molecules related to synaptic plasticity and function. Moreover, all these molecular alterations are highly involved and correlated with the first detectable cognitive symptoms in all mouse models tested. Furthermore, we found that the neurotrophin BDNF is one of the strongest regulator of the physiopathologic processes studied here. For this reason, we propose the neurotrophin as a major candidate for HD therapeutics. In line with this, in collaboration with the Drs. Friedman and Patterson from the McGill University in Canada, a new transgenic animal has been generated. This mouse over-express BDNF under control of the GFAP promoter (pGFAP-BDNF mice). We cultured astrocytes derived from these mice and grafted them in striata of wt mice. These transgenic astrocytes, when grafted and subjected to excitotoxic stimuli, were more neuroprotective than wt grafted astrocytes. Altogether demonstrates that an early therapeutic intervention focused on synaptic alterations by delivering BDNF in a conditional way have the potential to improve the symptomatology of HD and delay significantly its onset without important collateral and negative effects.

En 1997 se aisló en Japón la primera cepa de S. aureus con resistencia intermedia a glucopéptidos (GISA o VISA, glycopeptide o vancomycin -intermediate S. aureus). Hasta hoy se han descrito unos 25 casos de infecciones por GISA. Además de estos casos, y quizás como un fenómeno de mayor relevancia, se ha detectado la presencia de heterorresistencia a vancomicina (hVISA o hGISA) con una frecuencia mucho mayor. La heterorresistencia se entiende como la presencia de cepas con CMIs a vancomicina en el rango sensible (hasta 4 microgrs./ml) pero que, con frecuencias variables, contienen subpoblaciones con CMIs elevadas que podrían seleccionarse al ser expuestas a tratamientos prolongados. Las cepas con heterorresistencia serían precursoras de las cepas con resistencia intermedia (con CMIs mayor o igual que 8 microgrs./ml).El objetivo de este estudio fue evaluar si las infecciones producidas por cepas guisa presentan una dificultad terapéutica añadida al ser tratadas con glucopéptidos (GP), y, por otro, si existe diferencia entre la eficacia in vivo del tratamiento con GPs en monoterapia y una combinación entre GPs y beta-lactámicos (beta-L).Para ello se desarrolló un modelo de peritonitis en el ratón, en el que se estudió eltratamiento de la infección producida por cuatro cepas de S. aureus con diferente sensibilidad a GPs (cepas MSSA, MRSA, hGISA y GISA, CMIs a vancomicina: 1, 2, 4 y 8 microgrs./ml respectivamente). Se estudiaron los antibióticos vancomicina, teicoplanina, cloxacilina y cefotaxima, solos y en combinación frente a la infección producida por cada una de las cuatro cepas. Previamente, se llevó a cabo un estudio in vitro mediante curvas de letalidad para evaluar las combinaciones de estudio y un estudio farmacocinético previo en los ratones con los antibióticos de estudio para determinar las dosis que más se aproximaran a los valores farmacocinéticos/farmacodinámicos (PK/PD) que se dan en humanos. El modelo de peritonitis en el ratón consistió en la inoculación intraperitoneal de una suspensión de S. aureus y, posteriormente, el tratamiento con diferentes pautas terapéuticas (monoterapias y combinaciones con GP +beta-L). Los animales fueron sacrificados al finalizar el tratamiento para obtener muestras de sangre y líquido peritoneal (LP). El recuento de ufc/ml en LP fue el parámetro utilizado como medida de eficacia terapéutica.La eficacia de la monoterapia con vancomicina o teicoplanina decreció progresivamente para cada una de las cuatro infecciones en estudio (producidas respectivamente por las cepas MSSA, MRSA, hGISA y GISA), siendo significativamente menor en las cepas hGISA y GISA que en las cepas MSSA y MRSA. La eficacia se correlacionó significativamente con la sensibilidad de las cepas a vancomicina. A pesar de que in vitro se observó sinergia para las combinaciones entre GPs y beta-L frente a las cuatro cepas de estudio, éstas no mejoraron significativamente la eficacia in vivo de las monoterapias. La eficacia de la monoterapia con vancomicina fue equivalente a la combinación de vancomicina con cloxacilina.Existe una pérdida significativa de eficacia en el tratamiento con glucopéptidos de la peritonitis experimental por S. aureus producida por cepas hGISA y GISA respecto a la infección producida por cepas MRSA sensibles a vancomicina. Aunque existe cierta base microbiológica que describe el efecto sinérgico in vitro de las combinaciones entre glucopéptidos y beta-lactámicos, los estudios in vivo no confirman un papel decisivo de éstas en el tratamiento de las infecciones por GISA en la clínica.

La meningitis neumocócica es una enfermedad grave con elevada morbimortalidad y su tratamiento constituye un problema no completamente resuelto desde la aparición en todo el mundo de resistencias a penicilina y cefalosporinas. Meropenem es un carbapenémico que tiene una buena actividad in vitro frente a los principales patógenos que causan meningitis. El clásico modelo de meningitis en el conejo puede no ser adecuado para estudiar meropenem por la facilidad en hidrolizar la Dehidropeptidasa I.El objetivo del estudio es evaluar la eficacia terapéutica de meropenem y rifampicina solos y combinados, frente a dos cepas con diferente sensibilidad a betaláctámicos, utilizando los modelos de meningitis en conejo y en cobaya, y determinar si el modelo de meningitis en conejo puede utilizarse para estudiar meropenem.DISEÑO DEL ESTUDIO. Estudio in vitro mediante curvas de letalidad. Estudio in vivo en el modelo de meningitis en el conejo y en la cobaya. En ambos estudios se ensayan varias pautas antibióticas frente a dos cepas de neumococo, una sensible y otra resistente a penicilina y cefalosporinas. Previamente se hacen estudios de farmacocinética de los antibióticos en ambos modelos animales, para establecer las dosis y el intervalo entre las mismas. RESULTADOS. En las curvas de letalidad meropenem es bactericida y rifampicina bacteriostático. La combinación de ambos fármacos es sinérgica o indiferente. En el modelo de la cobaya todos los tratamientos, excepto rifampicina son bactericidas desde las 6 horas. En el modelo del conejo, meropenem es bactericida a las 6 horas frente a la cepa sensible, pero con la cepa resistente se observan fracasos terapéuticos a las 6 horas, siendo bactericida a las 24 horas. La combinación de meropenem más rifampicina mejora significativamente la eficacia de meropenem en solitario en la cepa resistente.CONCLUSIONES. La combinación de meropenem y rifampicina in vitro es sinérgica o indiferente. Meropenem ha demostrado su eficacia en el tratamiento de la meningitis neumocócica en la cobaya, frente a dos cepas con diferente sensibilidad a betalactámicos. La combinación de meropenem más rifampicina no aumenta la eficacia del meropenem en solitario.No hay congruencia entre el modelo del conejo y de la cobaya. El retardo en la eficacia de meropenem frente a la cepa resistente en la meningitis en el conejo sugiere que este modelo no es adecuado para estudiar este antibiótico y pone de manifiesto la importancia de la correcta elección del modelo animal en el desarrollo de estudios de eficacia antibiótica.Meropenem y la combinación de meropenem y rifampicina pueden ser considerados como una alternativa en el tratamiento de la meningitis bacteriana, y constituyen un tratamiento adecuado para las meningitis producidas por neumococos resistentes a cefalosporinas. / "Experimental study efficacy of meropenem and rifampin in the therapy of β-lactams-susceptible and -resistant pneumococcal meningitis"TEXT:The increasing spread of cephalosporin- resistant strains has reduced the therapeutic options for pneumococcal meningitis. Meropenem is a broad-spectrum carbapenem antibiotic which is highly active against the major bacterial pathogens causing meningitis, and penetrates well into the cerebrospinal fluid. Results with meropenem in the experimental rabbit model of penumococcal meningitis have been controversial and the possible role of renal dehydropeptidase I in meropenem efficacy has been suggested.The aim of this study was to determine the in vitro and in vivo efficacies of meropenem alone and combined with rifampin against two Streptococcus pneumoniae strains with different susceptibility to β-lactams using the rabbit and the guinea pig meningitis models, and the possible influence of the animal model over results. Two strains of Streptococcus pneumoniae with different susceptibility to beta-lactams have been used in a guinea pig model and the classical rabbit meningitis model. In vitro killing curves meropenem was bactericidal and rifampin was bacteriostatic. Combinations of meropenem plus rifampin were synergic or indifferent. All treatments were bactericidal from 6 h in the guinea pig model. In the rabbit model meropenem was bactericidal at 6 h against the susceptible strain but against the resistant therapeutical failures were recorded at 6 h being bactericidal at 24 h. In the resistant strain the addition of rifampin improves the activity of meropenem alone. In conclusion, meropenem have shown bactericidal activity in both experimental models and might be a good option in the management of pneumococcal meningitis. This work emphasises the importance of an adequate election of the animal model for the appropriate development of studies of antimicrobial efficacy.