O objetivo deste trabalho foi modificar os procedimentos da maturação in vitro (MIV) para induzir a competência de oócitos bovinos com intensa atividade da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH), determinada pelo emprego do corante vital Azul de Cresil Brilhante (BCB). Foram realizados dois experimentos; no primeiro trabalho foi realizada a MIV de oócitos após a identificação da atividade da G6PDH, empregando-se a seguinte proporção: competentes (sem atividade enzimática)/não competentes - 10:01, respectivamente. Os resultados revelaram um efeito negativo dos oócitos não competentes sobre a capacidade dos competentes em realizarem a MIV, a FIV e a CIV. Os resultados sugerem que para aumentar a produção de embriões deve-se realizar a MIV de oócitos competentes e não competentes, separadamente. O objetivo do segundo experimento foi verificar se a prolongação do tempo de MIV (30h) afetaria as taxas de MIV, FIV e CIV obtidas a partir de oócitos não competentes. Os oócitos não competentes não foram afetados, positiva ou negativamente, pelo prolongamento do tempo de MIV, no entanto, os oócitos competentes sofreram decréscimo na capacidade de serem fecundados e desenvolverem-se até o estágio de blastocistos. Podemos concluir que as modificações realizadas no procedimento da MIV não foram capazes de induzir competência em oócitos com intensa atividade da enzima G6PDH. / The present work aimed modify the in vitro maturation (IVM) procedure to induce competence of bovine oocytes with high glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) activity. Two experiments were carried out; the first non-competent oocytes (with high enzymatic activity) were matured with competent oocyte (lower G6PDH activity) on proportion of 1:10, respectively. The second experiment aimed observe the effect of prolonged IVM (from 24 to 30h) on the cleavage and development rates in oocytes with higher enzymatic activity. Our data showed that oocytes with lower enzymatic activity did not induce competence of higher G6PDH activity oocyte. However, we observed a negatively effect on the cleavage and development rates on oocytes competent, then, to increase the number of embryos in vitro produced we need to mature oocytes competent and non-competent separately. In the second experiment, the non-competent gametes submitted to prolonged IVM were not affected, however, competent oocytes were negatively affect by prolonged IVM. We can concluded that the IVM modifications did not able to induce the competence in the oocytes with high G6PDH activity.

In this project, the eggs of tench (Tinca tinca) were used for the evaluation of changes in fatty acid (FA) composition and lipid classes during in vitro ova ageing until the occurrence of over-ripening. Stripped ova of 6 females were collected separately and stored in sterile cell culture plates in an incubator at 20 °C for up to 24 hours post stripping (HPS). Stored ova were fertilized at 0, 2, 4, 6, 8, 10 and 24 HPS. Egg eyeing and hatching rates were assessed as indices of egg quality. Upon fertilization at each HPS, samples were taken separately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C till further analyses. Differences in the FA and lipid composition and embryo survival rates at the different fertilization times post-stripping were evaluated. The lipid fraction was extracted from the oocytes according to Hara and Radin (1978). The lipid content of the samples was determined gravimetrically from total extracted lipid. The FA were then analysed with a gas chromatograph equipped with a flame ionisation detector and PVT injector. The peaks were identified by comparing their retention times with those of authentic standards. Major lipid classes and the phospholipid classes were separated according to (Olsen and Henderson, 1989). Quantitative analysis of the separated lipid- and phospholipid classes was done by scanning the plates after derivatisation with a CAMAG TLC Scanner 3 (Camag, Switzerland). Identification of the lipid classes was performed by comparison with authentic standards applied on the same plate. In present study no significant changes were observed in lipid content and composition during storage of eggs until over-ripening. As well FA composition did not change over time indicating another reason of deterioration of oocyte quality than the proposed lipid oxidation. However individual fishes in this study showed much different fertilization rates that corresponded with their levels of cholesterol and triacylglycerols in minor degree.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:07Z : No. of bitstreams: 1 000847150.pdf: 860477 bytes, checksum: 76e841df35fa2f2e934e0f4bedb91cbc (MD5) / O presente estudo visou avaliar a resposta ovariana a superestimulação utilizando 80UI de FSH e 300UI de eCG após ablação por laparoscopic ovum pic-up (LOPU1) de todos os folículos visíveis presentes em ambos os ovários. Determinar o melhor momento para realização de uma nova LOPU (LOPU2), mediante a avaliação ultrassonográfica dos ovários a cada 12 horas após LOPU1. E comparar a respostas ovariana do tratamento Duplo LOPU (DLOPU) com o tratamento One Shot adaptado de Baldassarre (1996), quanto a quantidades dos Complexos Cumulos-Oócito (COCs), e qualidade das estruturas obtidas e após processo de maturação in vitro (MIV) por 24 horas. Foi determinado o momento para realização da LOPU2 em 36 horas após a superestimulação. A média de folículos presentes na avaliação ultrassonográfica imediatamente antes a LOPU em ambos os tratamentos foi cerca de 9 estruturas, não diferindo da media de folículos aspirados, a taxa de recuperação comum aos dois tratamentos foi de 62,5%. A avaliação imediata das estruturas obtidas bem como a após 24 de MIV demonstrou que não houve diferença qualitativa COCs entre os tratamentos / The present study aimed to evaluate the ovarian response to superstimulation using 80UI FSH and eCG 300UI after ablation LOPU (LOPU1) of all follicles present in both ovaries. Determine mlehor time to make a new LOPU (LOPU2) by ultrasound evaluation of the ovaries every 12 hours LOPU1. And comparing the responses ovarian DLOPU treatment with the treatment Ono Shot adapted Baldassarre (1996) with the DLOPU described here, the amounts of COC and quality of the structures obtained after process and IVM for 24 hours. It was determined the time for completion of LOPU2 in 36 hours after the overstimulation. The mean number of follicles present in the ultrasonographic evaluation immediately before the LOPU in both treatments was about 9 structures did not differ from follicles aspirated media, the recovery rate common to the two treatments was 62.5%. Immediate assessment of the structures obtained as well as after 24 IVM demonstrated that COCs do not hear qualitative difference between treatments

Submitted by FELIPE MORALES DALANEZI null (fmdalanezi@gmail.com) on 2016-03-01T17:52:28Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_EV_MIV_Felipe_Dalanezi.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-03-01T19:24:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dalanezi_fm_me_bot.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-01T19:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dalanezi_fm_me_bot.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Vários são os componentes que tem a capacidade de interferir no metabolismo e desenvolvimento do oócito no interior do folículos, dentre esses fatores estão As EVs. Sendo assim o objetivo deste estudo foi avaliar a modulação da maturação oocitária in vitro pelas EVs extraídos de vacas submetidas ao estresse térmico (ET) ou não. Para tanto 12 vacas da raça holandesa foram submetidas ao ET e 12 vacas foram mantidas em condições de termo-neutralidade, em seguida tiveram seus folículos aspirados em dois momentos do ciclo estral (pré-ovulação e desvio). Após a separação das EVs do fluido folicular, e visualizados pela microscopia eletrônica. Então As EVs foram colocados em meio de maturação para avaliação da ação destas vesículas durante a maturação oocitária. Após 22 horas de maturação, os oócitos e as células do cummulus foram recuperados para posterior análise de progressão da maturação e também para expressão de genes de interesse. Não foi observada diferença estatística entre os grupos na análise de progressão meiótica nem na integridade do DNA. Indicando que As EVs não interferiram na morfologia oocitária. A expressão gênica no entanto demonstrou que genes relacionados a expansão do cummulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), metabolismo energético (BMP15,CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 e 4) e apoptose (BCL2 e STAT3), apresentaram expressão diminuída no grupo termo-neutro. Os dados do nosso estudo indicam que o ambiente termo-neutro levou a uma sinalização intrafolicular das EVs com a finalidade de indicar uma situação favorável para o oócito. / There are several components that have the ability to interfere with the metabolism and development of the oocyte in side of follicles, among these factors are the EVs. Thus the aim of this study was to evaluate the modulation of oocyte maturation in vitro by EVs extracted from cows under heat stress or not. For that, 12 Holstein cows were subjected to heat stress and 12 cows were kept in a thermo-neutral conditions, then had their follicles aspirated in two stages of the estrous cycle (pre-ovulation and deviation). After separation of the EVs from follicular fluid, and visualized by electron microscopy. The EVs were placed in maturation medium for evaluation of the action of these vesicles during oocyte maturation. After 22 hours of maturation, oocytes and cummulus cells were recovered for further analysis of meiotic progression and for expression of genes of interest. There was no statistical difference between the groups in meiotic progression analysis or the DNA integrity. Indicating that the EVs not interfere in oocyte morphology. Gene expression however demonstrated that genes related to the expansion of the cumulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), energy metabolism (BMP15, CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 and 4) and apoptosis (BCL2 and STAT3) showed decreased expression the thermo-neutral group. The data from our study indicate that the thermo-neutral environment led to a intrafollicular signaling EVs in order to indicate a favorable situation for the oocyte.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:21:59Z : No. of bitstreams: 1 cordeiro_mf_dr_jabo.pdf: 737504 bytes, checksum: 28b79a078c889bdd457fb2f63a6e13b7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O uso repetido da laparoscopia para aspiração folicular (LAF) associado ou não à estimulação hormonal foi avaliado. Para tanto foram utilizadas 40 fêmeas caprinas sem-raça-definida, divididas aleatoriamente em 4 grupos com 10 animais cada, sendo: Grupo 1 - adultas estimuladas com 80 mg de FSHp e 300 UI de eCG; Grupo 2 - adultas não estimuladas (controle); Grupo 3 - prépúberes estimuladas com metade das doses preconizadas para o G1 e Grupo 4 - pré-púberes não estimuladas. Cada fêmea foi submetida a seis sessões de colheita com intervalo de uma semana entre as intervenções. A estimulação hormonal foi feita em dose única, 36 horas antes do ato operatório. A técnica consistiu do uso de duas punções para a introdução do endoscópio e da pinça de manipulação atraumática. Após a visualização dos ovários, os folículos visíveis na sua superfície foram puncionados com auxílio de agulha de aspiração acoplada a um sistema de vácuo. Os oócitos encontrados foram classificados de acordo com a qualidade, submetidos à maturação in vitro por 27 horas, e posteriormente fixados e corados para avaliação do estádio de maturação. A técnica utilizada, embora tenha apresentado redução da qualidade dos oócitos, não interferiu na taxa de maturação ao longo das seis intervenções. A resposta ovariana diminuiu com o uso repetido da estimulação com FSH exógeno. Não houve comprometimento da condição corporal e da fertilidade dos animais. A avaliação das funções hepática e renal e da analgesia, indica que o protocolo anestésico utilizado é seguro e eficiente para este tipo de procedimento cirúrgico. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a técnica de laparoscopia para aspiração folicular é adequada para a obtenção de oócitos de fêmeas caprinas pré-púberes e adultas. / The repeated use of the laparoscopy to follicular aspiration (LFA) associated or not the hormonal stimulation was evaluated. Forty crossbred goat females were used, divided randomly in 4 groups with 10 animals each, being: Group 1 - adult stimulated with 80 mg of FSHp and 300 UI of eCG; Group 2 - adult not stimulated (control); Group 3 - pre-pubertal stimulated with half of the dose praised for the G1 and Group 4 - prepubertal not stimulated. Each female was submitted the six sessions of harvest with interval of one week between the interventions. The hormonal stimulation was made in only dose, 36 hours before the surgery. The technique consisted of the use of two punctions for the introduction of the endoscopy and the clamp atraumatic manipulation. After the visualization of the ovaries, the visible follicles in its surface were punched with aid of needle of aspiration connected to a vacuum system. The recovery oocytes were classified in accordance with the quality, submitted to in vitro maturation for 27 hours, and later fixed and stained for evaluation of maturation state. The used technique does not interfered in the maturation rate although oocytes quality has reduced. However the ovulatory response diminished with the repeated use of exogenous FSH stimulation. Damage was not observed in corporal condition nor fertility. The evaluation of the hepatic function, renal and pain analysis, showed that the anaesthetic protocol used is safe and efficient for this type of surgery. In conclusion, the technique of laparoscopy to follicular aspiration is adjusted for the attainment of oocytes in goat females adult and prepubertal.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007Bitstream added on 2014-06-13T20:06:45Z : No. of bitstreams: 1 carmo_mt_dr_botfmvz.pdf: 1969502 bytes, checksum: 198972891441c6a64f8bf48146e2e8b1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A fêmea da espécie eqüina é considerada monovulatória sazonal, o que é ator limitante a produção de embriões ao longo do ano. Esta limitação poderia inimizada se houvesse uma resposta superovulatória eficiente em melhorar a ção de embriões. Protocolos mais recentes desenvolvidos em nosso atório utilizando-se o Extrato de Pituitária Eqüina (EPE) têm permitido uma esposta superovulatória. Contudo o número de embriões recuperados ainda sido inferior ao das ovulações, em conseqüência de fatores ainda não inados. O presente estudo teve por objetivo: verificar se o tratamento com o - administrado duas vezes ao dia, altera a maturação nuclear e citoplasmática I ito, avaliar o ambiente folicular mensurando os níveis de 17(3-estradiol, E5~)tlerona, progesterona, inibina e óxido nítrico, bem como o perfil eletroforético eínas no fluido folicular entre éguas superovuladas e não superovuladas. amos também o transporte do oócito para o oviduto. Este trabalho foi o em quatro experimentos: Experimento I Estudo do transporte dos oócitos oviduto de éguas superovuladas com extrato de pituitária eqüina; ento II Efeito da superovulação na recuperação de oócitos quando da ~-es foliculares guiadas por ultra-sonografia; Experimento 111 Avaliação do e folicular de éguas superovuladas; Experimento IV Avaliação da ''ação oocitária de éguas superovuladas com extrato de pituitária equina. O ento I foi desenvolvido na Universidade de Rio Cuarto (Argentina), foram _za.:las 22 éguas de 3 - 12 anos, (09 éguas controles; 13 éguas tratadas _ . Estes animais foram... / The equine female is considered a seasonal mono-ovulatory specie, which is a restrictive factor in respect to embryo production throughout the year. This limitation could be minimized if an efficient superovulatory response and consequent improvement of embryo production were possible. More recent protocols developed in our lab using EPE (equine pituitary extract) have allowed a good superovulatory response. However, the number of embryos recovered has been inferior to the number of ovulations detected due to unknown factors. The present study has the following objectives: Verify if the EPE treatment administered twice daily would alter the oocyte cytoplasmic and nuclear maturation; and to evaluate the follicular environment by measuring estradiol 17-, testosterone, progesterone, inhibin and nitric oxide. The electrophoresis pattern of proteins in follicular fluid from superovulated and non- superovulated mares was determined. In addition, the oocyte transport through the oviduct was investigated. The present study was divided into four experiments. Experiment I: Study of oocyte transport to the oviduct in superovulated mares using equine pituitary extract. Experiment II: Effect of superovulation on oocyte recovery using transvaginal ultrasound guided follicular aspiration. Experiment III: Evaluation of follicular environment in superovulated mares. Experiment IV: Oocyte maturation in superovulated in mares using equine pituitary extract. Experiment I was performed at Rio Cuarto University, Argentina. In the related study, 22 mares aging from 3 to 12 years were used (9 control mares, 13 EPE treated mares). These mares were monitored daily by ultrasound until the presence of a follicle ≥ 30mm in diameter, being then examined twice daily. The superovulation protocol used consisted in 25mg of EPE twice a day, intramuscularly, starting at day 7 post- ovulation... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-17Bitstream added on 2015-05-14T16:59:09Z : No. of bitstreams: 1 000829407.pdf: 3139564 bytes, checksum: ac15cce43cb3520f922ab5d6b73802ab (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho teve como objetivo geral averiguar o efeito da BL-I e da ROS em bloquear temporariamente a retomada da meiose, atuando sobre os fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos e a expansão das células do cumulus oophoros. No Experimento I, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6, 12 e 24 h na presença de duas concentrações de ROS (12,5 μM e 25 μM) ou na presença de BL-I (50 μ e 100 μM) ou na presença da associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) e em seguida foram cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h, 12 h ou 24 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos por 6 ou 12 h foram fertilizados e cultivados in vitro. O tratamento com ROS e BL-I não resultou em atraso na quebra da vesícula germinativa em relação ao controle. Entretanto, quando utilizados por 24 h, elevadas taxas de degeneração oocitária foram encontradas. Quando estes fármacos foram utilizados por 12 h com reversão por mais 12 h, verificamos uma menor taxa produção de blastocistos em relação ao grupo controle. No entanto, após a retirada do bloqueio por 6 h e maturação por 18 h um maior número de oócitos tratados tanto com ROS, como BL-I encontraram-se em MII. Da mesma forma, ao reduzirmos a dose e o tempo de inibição, os grupos tratados por 6 h de inibição meiótica e reversão por 18 h apresentaram taxas de produção embrionária similares ao grupo controle. No Experimento II, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6h na presença de 12,5 μM de ROS ou na presença de 50 μM de BL-I ou com a associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) sendo em seguida cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos foram fertilizados, cultivados in vitro e os embriões produzidos foram submetidos a vitrificação. Os grupos BI-I e ROS + BL-I apresentaram superioridade de produção embrionária, tanto em relação ao grupo ROS como o controle. O grupo ... / This work had as main objective to investigate the effect of BL-I and ROS in temporarily blocking the resumption of meiosis, acting on the factors that control the meiotic cell cycle of bovine oocytes and expansion of cumulus oophoros cells. In Experiment I, the oocytes remained in IVM mediafor 6, 12 and 24h in the presence of two concentrations of ROS (12.5 μM and 25 μM) or in the presence of BL-I (50 μ to 100 mM) or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in a drug-free IVM media for 18, 12 or 24 h. After this time, the inhibited oocytes by 6 or 12 h were fertilized and cultured in vitro. Treatment with ROS and BL-I did not resulted in delay in germinal vesicle breakdown in relation to control. However, when used for 24 h, higher rates of oocyte degeneration were found. When these drugs were used for 12 h with reversion for more than 12 h, a lower blastocyst production rate compared to the control group was verified. However, after removal of the blockage for 6 h and maturation for 18 h, a higher number of oocytes treated with both ROS and BL-I were found in MII. Similarly, when the dose and duration of inhibition were reduced, the groups treated for 6 h of meiotic inhibition and reversion for 18 h showed similar embryo production rates to the control group. In Experiment II, oocytes remained in IVM mediafor 6 h in the presence of 12.5 μM of ROS or the presence of 50 μM of BL-I or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in drug-free IVM media for 18 h. After this time, the inhibited oocytes were fertilized in vitro and the produced embryos were submitted to vitrification. The BI-I and ROS + BL-I groups showed superiority in embryo production, both in relation to the control as ROS group. The ROS + BL-I group showed higher rate of re-expansion after vitrification. Additionally, embryos from BL-I and BL-I + ROS showed lower number of apoptotic cells when compared to ... / FAPESP: 2010/18994-4

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-04Bitstream added on 2015-05-14T16:58:53Z : No. of bitstreams: 1 000826973.pdf: 1421350 bytes, checksum: cb9046da915832bdb24f2e31bcc45a06 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi quantificar a abundância de genes associados com a competência de desenvolvimento em oócitos (GDF-9, BMP15 e OOSP1) e nas células do cumulus (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 e ADAM17), a partir de oócitos imaturos (VG), maturados in vivo (MIVO) e cultivados em meio de MIV com diferentes macromoléculas (SFB, BSA ou PVA), diferentes concentrações de EGF ou pré-cultivados com butirolactona I (BLI) antes da MIV. O delineamento experimental consistiu de três experimentos de MIV de oócitos bovinos, a saber: experimento 1, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo 10% de SFB ou 1 mg/mL de PVA ou 4 mg/mL de BSA; experimento 2, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo EGF (nas concentrações de 0, 10 e 100 ng/mL); e experimento 3, complexos cumulus-oócito maturados in vitro na ausência (BL0) ou presença de pré-maturação com 10 μM de BLI ( BL12, 12 horas de pré-maturação e 12 horas de MIV; BL24, 24 horas de prématuração e 24 horas de MIV). A quantidade relativa de transcritos para o gene GREM1, PTGS2, PFKP e AREG foi maior do que (P<0,05) nas células do cumulus de oócitos MIVO, nos experimentos 1 e 2 e para o gene GREM1 no experimento 3. No experimento 1, o grupo SFB exibiu maior (P<0,05) abundância de transcritos de GREM1 e AREG entre os grupos MIV. No experimento 2, a adição de 10 ng/mL ao meio de MIV propiciou uma regulação positiva de EREG. No experimento 3, BL12 apresentou maior (P<0,05) abundância de AREG e o BL24 de EREG e PTX3. Entre os grupos de MIV, o gene GREM1 foi expresso em maior quantidade (P<0,05) no BL12. Não houve diferença estatística nos experimentos 1, 2 e 3 entre os grupos de oócitos MIV, MIVO e VG para os genes GDF9, BMP15 e OOSP1. Conclui-se que, a utilização de diferentes macromoléculas, diferentes concentrações de EGF e a realização de précultivo com BLI altera a transcrição nas células ... / The aim of this study was to quantify the abundance of genes associated with the development of oocyte competence in oocytes (GDF-9, BMP15 and OOSP1) and in cumulus cells (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 and ADAM-17) of immature oocytes (GV), in vivo matured (IVMO) and cultured in IVM medium with different macromolecules (FCS, BSA or PVA), different EGF concentrations or pre-cultured with butyrolactone I (BLI) before IVM. The experimental design consisted of three IVM experiments of bovine oocytes, namely: experiment 1, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing 10% FCS or 1 mg/mL PVA or 4 mg/mL BSA; Experiment 2, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing EGF (at concentrations of 0, 10 and 100 ng/mL); and Experiment 3, cumulus-oocyte complex in vitro matured in the absence (BL0) or presence of pre-maturation with 10 μM de BLI (BL12, 12 hours of pre-maturation and 12 hours of IVM, BL24, 24 hours of pre-maturation and 24 hours of IVM). The relative amount of transcripts for GREM1, PTGS2, PFKP and AREG gene was larger than (P <0.05) in cumulus cells of IVMO oocytes in experiments 1 and 2 and for GREM1 gene in experiment 3. In experiment 1, the FCS group exhibited higher (P <0.05) abundance of transcripts of GREM1 and AREG among MIV groups. In experiment 2, the addition of 10 ng/ml to the IVM medium provided an upregulation of EREG. In experiment 3, BL12 showed higher (P <0.05) abundance of AREG and BL24 of EREG and PTX3. Among IVM groups, the GREM1 gene was expressed in larger quantities (P <0.05) in BL12. There was no statistical difference in experiments 1, 2 and 3 among groups of oocytes IVM, IVMO and GV for GDF9, BMP15 and OOSP1 genes. It was concluded that the use of different macromolecules, different EGF concentrations and the performance of pre-culture with BLI change the transcription in the cumulus cell of genes associated with oocyte competence / FAPESP: 2011/20514-3

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-03. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:43Z : No. of bitstreams: 1 000836722_20170301.pdf: 180132 bytes, checksum: 753f2fc6bf6704d0d437a28d4b51d4f2 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-03T11:01:29Z: 000836722_20170301.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-03T11:02:39Z : No. of bitstreams: 1 000836722.pdf: 980013 bytes, checksum: 2c92fb3c55ff70c48ea0cac62876c366 (MD5) / O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de... / The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspases activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8- 5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM ...

O desenvolvimento de meios de cultivo eficazes para a maturação in vitro de oócitos caninos tem sido um desafio para os pesquisadores em reprodução animal. O estresse oxidativo desempenha papel fundamental na maturação oocitária, uma vez que altas concentrações de espécies reativas ao oxigênio levam ao dano celular e apoptose. O objetivo desta pesquisa foi determinar as taxas de maturação nuclear de oócitos caninos na presença de cisteína e α-tocoferol, substâncias conhecidas por suas propriedades antioxidantes. No experimento 1, avaliou-se a taxa de maturação nuclear de oócitos caninos mantidos em meio TCM-199 modificado (A) (controle) ou acrescido de 0,57mM de cisteína (B). No experimento 2, determinou-se as taxas de maturação nuclear na presença de diferentes concentrações de α-tocoferol em duas etapas independentes: experimento 1 (0, 10, 50μM) e experimento 2 (0, 100 e 500μM). Os dados foram analisados pelo teste do Qui-quadrado (P < 0,05). No experimento 1, não foi observada diferença estatística entre as taxas de Metáfase I/Anáfase I (MI/AI) e Metáfase II (MII) entre os oócitos do grupo controle (A) (7,5%, 16/213; 1,9%, 4/213) e os oócitos do grupo acrescido de cisteína (B) (6,3%, 14/223; 0,9%, 2/223). No experimento 2, não houve diferença significativa nas taxas de MI e MII dos oócitos entre os tratamentos da primeira etapa: controle (26,8%, 29/108), 10μM (22,6%, 26/115) e 50μM (29,1%, 30/103). Na segunda parte do experimento, a percentagem de oócitos que retomaram a meiose (VGBD à MII) foi de 31,9% (31/97), 34,9% (39/112) e 51,5% (54/105) para os grupos controle,100 e 500μM de α-tocoferol respectivamente (P < 0,05). Entretanto, nenhum aumento nas taxas de MII foi observado quando foram utilizadas as concentrações de 100μM (0,9%, 1/112) ou 500μM (1,0%, 1/105) de α- tocoferol no meio. Concluiu-se que, o TCM-199 modificado suplementado com cisteína não foi eficaz em elevar os índices de maturação in vitro de oócitos caninos. Ainda, a suplementação de α-tocoferol não afetou as taxas de MII de oócitos caninos. / The development of effective culture media for in vitro maturation of canine oocytes has been a challenge for researchers in animal reproduction. Oxidative stress plays a critical role in oocyte maturation since high concentrations of reactive oxygen species lead to cell damage and apoptosis. This research aimed to determine the rates of nuclear maturation of canine oocytes in the presence of cysteine and α-tocopherol, substances known for its antioxidant properties. In experiment 1, the rates of oocytes nuclear maturation exposed to modified TCM-199 (A) (control) or added with 0.57mM cysteine (B) were evaluated. In experiment 2, the rates of oocytes nuclear maturation in the presence of different concentrations of α-tocopherol were determined in two independent essays: experiment 1 (0, 10 and 50μM) and experiment 2 (0, 100 and 500μM). Data were analyzed by the Chi-square test (P < 0.05). The data obtained in experiment 1 allowed no difference among the oocytes in Metaphase I/Anaphase (MI/AI) (7.5%, 16/213; 1.9%, 4/213) and Metaphase II (MII) (6.3%, 14/223; 0.9%, 2/223) rates observed in the medium without or supplemented with cysteine respectively. In experiment 2, there was no significant difference in the rates of MI and MII oocytes among treatments designed for the first essay: control (26.8%, 29/108), 10μM (22.6%, 26/115) and 50μM (29.1%, 30/103). In the second part of the experiment, the percentage of oocytes that resumed meiosis (GVBD to MII) was 31.9% (31/97), 34.9% (39/112) and 51.5% (54/105) for control, 100 and 500μM groups respectively (P < 0.05). However, no improvement on rates of MII was observed when either 100 or 500μM α-tocopherol was added in medium. It was concluded that, modified TCM-199 supplemented with cysteine, was not effective in raising the rates of in vitro maturation of bitch oocytes. Moreover, α-tocopherol supplement did not affect the rates of MII in canine oocytes.