Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Angiotensin II (AngII), progesterone (P4) and prostaglandins (PGs) are essential for ovulation of a fertile oocyte. This study sought to understand how these factors are linked together during the ovulatory process. To this end, first we characterized the pattern of expression of genes of interest to the renin-angiotensin system in follicular cells and AngII concentration in the fluid during the periovulatory period. Cows were ovariectomized at various times after GnRH injection to obtain pre (at the time of GnRH treatment) and periovulatory follicles (3, 6, 12, and 24 h after GnRH treatment). Theca and granulosa cells were separated and processed to real time RT-PCR Herein we demonstrated that the gonadotropin surge stimulates the follicular secretion of AngII and theca cells expression of mRNA for AGTR2 receptors. Next, we assessed whether AngII can modulate the secretion of steroids and PGs by follicular cells using in vitro culture of theca and granulosa cells of bovine ovaries from abattoir. In this study we found that AngII in synergism with LH stimulates the synthesis of PGE2 and PGF2α and P4 by granulosa cells. The role of AngII and PGs as mediators of nuclear maturation of oocytes in ruminants induced by gonadotropins had already been demonstrated. However, a similar action performed by P4 is still controversial in cattle. In this work, using in vitro and in vivo models, we evidenced that P4 not only participates in this process, but it is also an intermediate factor between AngII and PGs in the cascade of events. With the present work is possible to conclude that AngII, P4 and PGs are "linked" mediators of the preovulatory gonadotropin surge. These data allowed us to propose a unified model for both, ovulation and the resumption of nuclear maturation of oocytes. In this model the preovulatory gonadotropin surge up regulates the production of AngII and follicular expression of AGTR2 receptors, stimulating the secretion of P4 and the release of PGE2 and PGF2α, culminating with the ovulation of a fertile gamete. / A angiotensina II (AngII), progesterona (P4) e prostaglandinas (PGs) são fatores essenciais para que ocorra a ovulação de um oócito fértil. Este trabalho buscou entender se esses fatores interagem durante o processo de ovulação e maturação oocitária. Para tanto, primeiramente caracterizamos a expressão de genes de interesse para o sistema renina angiotensina em células foliculares e a concentração de AngII no fluido folicular durante o período periovulatório. Para tanto, folículos pré-ovulatórios de vacas foram coletados em diversos momentos após a administração intramuscular de GnRH. Após a coleta, o líquido folicular e as células da teca e granulosa foram separadas para realização da técnica de RT-PCR em tempo real. Neste estudo, foi observado que o pico de gonadotrofinas estimula a secreção folicular de AngII e a expressão de RNAm para receptores do tipo AGTR2 nas células da teca. Em seguida, avaliamos se a AngII é capaz de modular a secreção de esteróides e PGs pelas células foliculares. Células foliculares bovinas obtidas a partir de ovários de abatedouro foram cultivadas in vitro na presença de LH, AngII e/ou saralasina. Com este experimento, foi verificado que a AngII em sinergismo com LH estimula a síntese de P4, PGE2 e PGF2α pelas células da granulosa. O papel da AngII e PGs como mediadoras da maturação nuclear de oócitos em ruminantes induzida por gonadotrofinas já havia sido demonstrado. No entanto, uma ação similar realizada pela P4 ainda possuía caráter questionável em bovinos. No presente trabalho, utilizando modelos in vitro e in vivo, foi evidenciado que a P4 não só participa desse processo, mas também é um fator intermediário entre AngII e PGs na cascata de eventos. Ao final deste trabalho foi possível concluir que AngII, P4 e PGs são mediadores conectados da ação do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas. Esses dados nos permitem propor um modelo unificado de eventos tanto para a ocorrência da ovulação quanto para a retomada da maturação nuclear do oócito. Neste modelo, o pico pré-ovulatório de gonadotrofinas aumenta a secreção folicular de AngII e a expressão de receptores AGTR2, os quais estimulam a secreção de P4 e por consequência de PGE2 e PGF2α, culminando com a ovulação de um gameta fértil.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3118832 bytes, checksum: 81687fa6c0330c0e46d76f4e683d9673 (MD5) Previous issue date: 2002-08-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed at the evaluation of the effects from cryopreservation on the in vitro matured and immature oocytes, using the conventional method. The experiment was carried out in the Animal Reproduction Laboratory - DVT-UFV, by using oocytes from cows ovaries from slaughterhouse, which were distributed into six treatments. Treatment 1 (T1): non-frozen oocytes (fresh ones) provided with the cumulus oophorus cells (COC) which were immediately submitted to the processes MIV, FIV and CIV. Treatment 2 (T2): non-frozen oocytes (fresh ones), deprived unprovided of the cumulus oophorus cells (naked), which were immediately submitted to MIV, FIV and CIV. Treatment 3 (T3): immature oocytes provided with the cumulus oophorus cells, which were submitted to cryopreservation just after selection. Later, they were thawed and those considered as normal ones were submitted to MIV, FIV and CIV. Treatment 4 (T4): naked oocytes submitted to cryopreservation. Later, they were thawed and those considered as normal ones were submitted to MIV, FIV and CIV. Treatment 5 (T5): oocytes provided with the cumulus oophorus cells, matured in vitro, and then they were frozen. Later, they were thawed and those considered as normal ones were submitted to recultivation for 2 hours in a maturation medium, and then submitted to FIV and CIV. Treatment 6 (T6): naked, in vitro matured oocytes which were submitted to cryopreservation. After thawing, those oocytes which were considered as normal ones were submitted to recultivation for 2 hours, and then to FIV and CIV. Those oocytes of the treatments 3, 4, 5 and 6 were frozen in a solution containing 1.8 mol L-1 ethylene glycol (EG) in Talp-Hepes (base medium) added with 0.4% BSA-V by the conventional method. The oocytes were dehydrated by immersion into three solutions (phases) at increasing concentrations of the cryoproctetor, (0.6; 1.2 and 1.8 mol L-1 of EG) during a maximum permanence time of five minutes for each phase, at environmental temperature. Thawing was accomplished by immersion into water bath at 30oC for 20 seconds. Later, the oocytes were rehydrated at three stages, that is, 0.9 mol L-1 EG + 0.3 mol L -1 sucrose, 0.3 mol L-1 sucrose, and without both EG and sucrose for six minutes each one. After thawing, the oocytes recovery rates were 92.6, 97.5, 96.6 and 93,2% for the treatments 3, 4, 5 and 6, respectively. In relation to the recovered oocytes, the following were also found: a cytoplasm withdrawal rate of 3.3, 0.8, 0.3 and 6.2%, and a cellular content loss of 2.2, 13.1, 3.8 and 16.1%, also for treatments 3, 4, 5 and 6, respectively. The frozen immature oocytes presented a maturation rate of 9.2 and 5.8% (treatments 3 and 4, respectively); these results were much inferior to those obtained by the fresh oocytes, that is, 82.5 (T1) and 75.4% (T2). The fecundation rates were 56.2, 0.0, 38.7, 8.6, 63.6 and 16.7%, while the clivage rates were 36.3, 7.9, 0.4, 0.0, 0.0, and 0.0% for treatments 1, 2, 3, 4, 5 and 6, respectively. Only the unfrozen and no-naked oocytes (T1) exhibited development of morula and blastocyst (34.5%), after fecundation. These results point out that the adopted freezing protocols affected the viability of the oocytes. / Este estudo objetivou avaliar os efeitos da criopreservação pelo método convencional em ovócitos imaturos e maturados in vitro. O experimento foi conduzido no Laboratório de Reprodução Animal - DVT-UFV, utilizando-se ovócitos provenientes de ovários de vacas abatidas em matadouro e distribuídos aleatoriamente em seis tratamentos. Tratamento 1 (T1): ovócitos não congelados (frescos) providos de células do cumulus oophorus (COC), os quais foram imediatamente submetidos à MIV, FIV e CIV. Tratamento 2 (T2): ovócitos não congelados (frescos) e desprovidos de células do cumulus oophorus (desnudados), os quais foram imediatamente submetidos ao MIV, FIV e CIV. Tratamento 3 (T3): ovócitos imaturos, providos de células do cumulus oophorus, submetidos à criopreservação imediatamente após a seleção. Posteriormente, esses ovócitos foram descongelados e aqueles considerados normais foram submetidos à MIV, FIV e CIV. Tratamento 4 (T4): ovócitos desnudados e submetidos à criopreservação. Posteriormente, foram descongelados e aqueles considerados normais foram submetidos à MIV, FIV e CIV. Tratamento 5 (T5): ovócitos providos de células do cumulus oophorus, maturados in vitro e, em seguida, congelados. Posteriormente, foram descongelados e aqueles considerados normais foram submetidos ao recultivo em meio de maturação por duas horas e, então, submetidos à FIV e CIV. Tratamento 6 (T6): ovócitos desnudos, maturados in vitro e, posteriormente, submetidos a criopreservação. Após a descongelação, os considerados normais foram submetidos ao recultivo por duas horas seguido de FIV e CIV. A congelação dos ovócitos dos tratamentos 3, 4, 5 e 6 foi realizada em solução contendo 1,8 mol L-1 de etileno glicol (EG) em Talp-Hepes (meio base) acrescido de 0,4% de BSA-V, utilizando-se o método convencional. Os ovócitos foram desidratados por imersão em três soluções (etapas), contendo concentrações crescentes do crioprotetor, (0,6; 1,2 e 1,8 mol L-1 de EG) sendo o tempo de permanência máxima de cinco minutos em cada etapa, em temperatura ambiente. A descongelação foi realizada por imersão em banho-Maria a 30oC por 20 segundos. Posteriormente, os ovócitos foram reidratados em três etapas (0,9 mol L-1 de EG + 0,3 mol L 1 de sacarose; 0,3 mol L-1 de sacarose, e sem EG e sem sacarose), com duração de seis minutos cada uma. Após a descongelação foram recuperados 92,6, 97,5, 96,6 e 93,2%, dos ovócitos dos tratamentos 3, 4, 5 e 6, respectivamente. Em relação aos ovócitos recuperados, verificou-se uma taxa de citoplasma retraído de 3,3; 0,8; 0,3 e 6,2% e perda de conteúdo celular de 2,2; 13,1; 3,8 e 16,1%, também para os tratamentos 3, 4, 5 e 6, respectivamente. Os ovócitos congelados imaturos apresentaram taxa de maturação de 9,2 e 5,8% (tratamentos 3 e 4, respectivamente), resultados estes bem inferiores aos obtidos para os ovócitos frescos, sendo 82,5 (T1) e 75,4% (T2). Foram encontradas taxas de fecundação de 56,2; 0,0; 38,7; 8,6; 63,6 e 16,7% e de clivagem de 36,3; 7,9; 0,4; 0,0; 0,0 e 0,0%, para os tratamentos 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente. Somente os ovócitos não congelados e não desnudados (T1) apresentaram desenvolvimento para mórulas e blastocistos (34,5%), após a fecundação. Estes resultados indicam que o protocolo de congelação adotado comprometeu a viabilidade do ovócito.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-30Bitstream added on 2014-06-13T19:59:07Z : No. of bitstreams: 1 silva_rb_me_jabo.pdf: 1298125 bytes, checksum: 1ad82f6104f2a03b81c31c4de310d4d7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Foram investigados os efeitos da irradiação com diodos lasers operando em 780 nm (infravermelho) e 660 nm (visível) na maturação, fertilização e cultivo in vitro de embriões bovinos. Verificou-se que a irradiação de oócitos com ambos os lasers, durante 30, 60, 120 e 180 segundos (L30, L60, L120, L180) não afetou (p>0,05) as taxas de maturação nuclear (Infravermelho: L30 - 88,92% vs. C30 – 81,84%; L60 – 83,56% vs. C60 – 87,40%; L120 – 76,06% vs. C120 – 85,30%; L180 – 77,42% vs. C180 - 80,16%; e Visível: L30 – 65,81% vs. C30 – 71,59%; L60 – 62,75% vs. C60 – 69,62%; L120 – 70,38% vs. C120 – 64,04%; L180 – 56,72% vs. C180 – 67,41%), e de maturação citoplasmática, avaliada por meio da distribuição dos grânulos corticais (Infravermelho: L30 – 86,18% vs. C30 – 61,04%; L60 – 66,03% vs. C60 – 56,16%; L120 – 53,75% vs. C120 – 79,81%; L180 – 57,70% vs. C180 – 82,04% e Visível: L30 – 81,08% vs. C30 – 74,42%; L60 – 68,11% vs. C60 – 61,63%; L120 – 75,95% vs. C120 – 48,33%; L180 – 77,77% vs. C180 – 59,52%). As porcentagens de produção embrionária ao sétimo dia de cultivo in vitro não foram alteradas (p>0,05) após a irradiação de oócitos com laser infravermelho (L30 – 29,20% vs. C30 – 42,60%; L60 – 32,0% vs. C60 – 31,0%; L120 – 38,0% vs. C120 – 35,0%; L180 – 37,0% vs. C180 – 32,0%), mas foram reduzidas após a irradiação com laser visível durante 180 seg. (L180 – 36,0% vs. C180 – 56,0 %). A irradiação em espermatozóides com ambos os lasers não afetou (p>0,05) as taxas de clivagem ao terceiro dia de cultivo in vitro (Infravermelho: L30 – 90,0% vs. C30 – 95,83%; L60 – 85,56% vs. C60 – 98,33%; L120 – 90,83% vs. C120 – 90,83%; L180 – 89,72% vs. C180 – 97,50%; e Visível: L30 – 82,96% vs. C30 – 85,61%; L60 – 82,10% vs. C60 – 82,53%; L120 – 80,48% vs. C120 – 82,44%;... / The diodo lasers irradiation effects, operating in 780nm (infrared light) and 660 nm (visible light), were evaluated on in vitro maturation, fertilization and culture rates of bovine embryos. Both infrared and visible laser irradiation on oocytes, during 30, 60, 120 and 180 seconds (30, 60, 120, 180) did not change (p>0,05) the rates of nuclear maturation (Infrared: L30 – 88.92% vs. C30 – 81.84%; L60 – 83.56% vs. C60 – 87.40%; L120 – 76.06% vs. C120 – 85.30%; L180 – 77.42% vs. C180 – 80.16%; and Visible: L30 – 65.81% vs. C30 – 71.59%; L60 – 62.75% vs. C60 – 69.62%; L120 – 70.38% vs. C120 – 64.04%; L180 – 56.72% vs. C180 – 67.41%), and the cytoplasmic cortical granule distribution (Infrared: L30 – 86.18% vs. C30 – 61.04%; L60 – 66.03% vs. C60 – 56.16%; L120 – 53.75% vs. C120 – 79.81%; L180 – 57.70% vs. C180 – 82.04% and Visible: L30 – 81.08% vs. C30 – 74.42%; L60 – 68.11% vs. C60 – 61.63%; L120 – 75.95% vs. C120 – 48.33%; L180 – 77.77% vs. C180 – 59.52%). The in vitro embryo production rates measured on seventh day of culture were not changed (p.0,05) after the infrared laser irradiation (L30 – 29.20% vs. C30 – 42.60%; L60 – 32.0% vs. C60 – 31.0%; L120 – 38.0% vs. C120 – 35.0%; L180 – 37.0% vs. C180 – 32.0%), but they were reduced (p<0,05) after the visible laser irradiation during 180 seconds (L180 – 36.0% vs. C180 – 56.0 %). When spermatozoa were irradiated, both lasers did not change the rates of cleavage (p>0,05) on third day of in vitro culture (Infrared: L30 – 90.0% vs. C30 – 95.83%; L60 – 85.56% vs. C60 – 98.33%; L120 – 90.83% vs. C120 – 90.83%; L180 – 89.72% vs. C180 – 97.50%; and Visible: L30 – 82.96% vs. C30 – 85.61%; L60 – 82.10% vs. C60 – 82.53%; L120 – 80.48% vs. C120 – 82.44%; L180 – 83.53% vs. C180 – 87.15%), the embryo production percentages on seventh day ...(Complete abstract, click electronic access below)

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Cláudia Lima Verde Leal / Resumo: O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de... / Abstract: The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspases activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8- 5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM ... / Mestre

Resumo: Foram investigados os efeitos da irradiação com diodos lasers operando em 780 nm (infravermelho) e 660 nm (visível) na maturação, fertilização e cultivo in vitro de embriões bovinos. Verificou-se que a irradiação de oócitos com ambos os lasers, durante 30, 60, 120 e 180 segundos (L30, L60, L120, L180) não afetou (p>0,05) as taxas de maturação nuclear (Infravermelho: L30 - 88,92% vs. C30 - 81,84%; L60 - 83,56% vs. C60 - 87,40%; L120 - 76,06% vs. C120 - 85,30%; L180 - 77,42% vs. C180 - 80,16%; e Visível: L30 - 65,81% vs. C30 - 71,59%; L60 - 62,75% vs. C60 - 69,62%; L120 - 70,38% vs. C120 - 64,04%; L180 - 56,72% vs. C180 - 67,41%), e de maturação citoplasmática, avaliada por meio da distribuição dos grânulos corticais (Infravermelho: L30 - 86,18% vs. C30 - 61,04%; L60 - 66,03% vs. C60 - 56,16%; L120 - 53,75% vs. C120 - 79,81%; L180 - 57,70% vs. C180 - 82,04% e Visível: L30 - 81,08% vs. C30 - 74,42%; L60 - 68,11% vs. C60 - 61,63%; L120 - 75,95% vs. C120 - 48,33%; L180 - 77,77% vs. C180 - 59,52%). As porcentagens de produção embrionária ao sétimo dia de cultivo in vitro não foram alteradas (p>0,05) após a irradiação de oócitos com laser infravermelho (L30 - 29,20% vs. C30 - 42,60%; L60 - 32,0% vs. C60 - 31,0%; L120 - 38,0% vs. C120 - 35,0%; L180 - 37,0% vs. C180 - 32,0%), mas foram reduzidas após a irradiação com laser visível durante 180 seg. (L180 - 36,0% vs. C180 - 56,0 %). A irradiação em espermatozóides com ambos os lasers não afetou (p>0,05) as taxas de clivagem ao terceiro dia de cultivo in vitro (Infravermelho: L30 - 90,0% vs. C30 - 95,83%; L60 - 85,56% vs. C60 - 98,33%; L120 - 90,83% vs. C120 - 90,83%; L180 - 89,72% vs. C180 - 97,50%; e Visível: L30 - 82,96% vs. C30 - 85,61%; L60 - 82,10% vs. C60 - 82,53%; L120 - 80,48% vs. C120 - 82,44%; ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The diodo lasers irradiation effects, operating in 780nm (infrared light) and 660 nm (visible light), were evaluated on in vitro maturation, fertilization and culture rates of bovine embryos. Both infrared and visible laser irradiation on oocytes, during 30, 60, 120 and 180 seconds (30, 60, 120, 180) did not change (p>0,05) the rates of nuclear maturation (Infrared: L30 - 88.92% vs. C30 - 81.84%; L60 - 83.56% vs. C60 - 87.40%; L120 - 76.06% vs. C120 - 85.30%; L180 - 77.42% vs. C180 - 80.16%; and Visible: L30 - 65.81% vs. C30 - 71.59%; L60 - 62.75% vs. C60 - 69.62%; L120 - 70.38% vs. C120 - 64.04%; L180 - 56.72% vs. C180 - 67.41%), and the cytoplasmic cortical granule distribution (Infrared: L30 - 86.18% vs. C30 - 61.04%; L60 - 66.03% vs. C60 - 56.16%; L120 - 53.75% vs. C120 - 79.81%; L180 - 57.70% vs. C180 - 82.04% and Visible: L30 - 81.08% vs. C30 - 74.42%; L60 - 68.11% vs. C60 - 61.63%; L120 - 75.95% vs. C120 - 48.33%; L180 - 77.77% vs. C180 - 59.52%). The in vitro embryo production rates measured on seventh day of culture were not changed (p.0,05) after the infrared laser irradiation (L30 - 29.20% vs. C30 - 42.60%; L60 - 32.0% vs. C60 - 31.0%; L120 - 38.0% vs. C120 - 35.0%; L180 - 37.0% vs. C180 - 32.0%), but they were reduced (p<0,05) after the visible laser irradiation during 180 seconds (L180 - 36.0% vs. C180 - 56.0 %). When spermatozoa were irradiated, both lasers did not change the rates of cleavage (p>0,05) on third day of in vitro culture (Infrared: L30 - 90.0% vs. C30 - 95.83%; L60 - 85.56% vs. C60 - 98.33%; L120 - 90.83% vs. C120 - 90.83%; L180 - 89.72% vs. C180 - 97.50%; and Visible: L30 - 82.96% vs. C30 - 85.61%; L60 - 82.10% vs. C60 - 82.53%; L120 - 80.48% vs. C120 - 82.44%; L180 - 83.53% vs. C180 - 87.15%), the embryo production percentages on seventh day ...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: César Roberto Esper / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Nivaldo Antonio Parizotto / Mestre

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: Vários são os componentes que tem a capacidade de interferir no metabolismo e desenvolvimento do oócito no interior do folículos, dentre esses fatores estão As EVs. Sendo assim o objetivo deste estudo foi avaliar a modulação da maturação oocitária in vitro pelas EVs extraídos de vacas submetidas ao estresse térmico (ET) ou não. Para tanto 12 vacas da raça holandesa foram submetidas ao ET e 12 vacas foram mantidas em condições de termo-neutralidade, em seguida tiveram seus folículos aspirados em dois momentos do ciclo estral (pré-ovulação e desvio). Após a separação das EVs do fluido folicular, e visualizados pela microscopia eletrônica. Então As EVs foram colocados em meio de maturação para avaliação da ação destas vesículas durante a maturação oocitária. Após 22 horas de maturação, os oócitos e as células do cummulus foram recuperados para posterior análise de progressão da maturação e também para expressão de genes de interesse. Não foi observada diferença estatística entre os grupos na análise de progressão meiótica nem na integridade do DNA. Indicando que As EVs não interferiram na morfologia oocitária. A expressão gênica no entanto demonstrou que genes relacionados a expansão do cummulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), metabolismo energético (BMP15,CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 e 4) e apoptose (BCL2 e STAT3), apresentaram expressão diminuída no grupo termo-neutro. Os dados do nosso estudo indicam que o ambiente termo-neutro levou a uma sinalização intrafolicular das EVs com a fin... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There are several components that have the ability to interfere with the metabolism and development of the oocyte in side of follicles, among these factors are the EVs. Thus the aim of this study was to evaluate the modulation of oocyte maturation in vitro by EVs extracted from cows under heat stress or not. For that, 12 Holstein cows were subjected to heat stress and 12 cows were kept in a thermo-neutral conditions, then had their follicles aspirated in two stages of the estrous cycle (pre-ovulation and deviation). After separation of the EVs from follicular fluid, and visualized by electron microscopy. The EVs were placed in maturation medium for evaluation of the action of these vesicles during oocyte maturation. After 22 hours of maturation, oocytes and cummulus cells were recovered for further analysis of meiotic progression and for expression of genes of interest. There was no statistical difference between the groups in meiotic progression analysis or the DNA integrity. Indicating that the EVs not interfere in oocyte morphology. Gene expression however demonstrated that genes related to the expansion of the cumulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), energy metabolism (BMP15, CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 and 4) and apoptosis (BCL2 and STAT3) showed decreased expression the thermo-neutral group. The data from our study indicate that the thermo-neutral environment led to a intrafollicular signaling EVs in order to indicate a favorable situation for the oocyte. / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Eduardo Paulino da Costa / Banca: Álan Maia Borges / Resumo: O objetivo deste estudo foi quantificar a abundância de genes associados com a competência de desenvolvimento em oócitos (GDF-9, BMP15 e OOSP1) e nas células do cumulus (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 e ADAM17), a partir de oócitos imaturos (VG), maturados in vivo (MIVO) e cultivados em meio de MIV com diferentes macromoléculas (SFB, BSA ou PVA), diferentes concentrações de EGF ou pré-cultivados com butirolactona I (BLI) antes da MIV. O delineamento experimental consistiu de três experimentos de MIV de oócitos bovinos, a saber: experimento 1, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo 10% de SFB ou 1 mg/mL de PVA ou 4 mg/mL de BSA; experimento 2, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo EGF (nas concentrações de 0, 10 e 100 ng/mL); e experimento 3, complexos cumulus-oócito maturados in vitro na ausência (BL0) ou presença de pré-maturação com 10 μM de BLI ( BL12, 12 horas de pré-maturação e 12 horas de MIV; BL24, 24 horas de prématuração e 24 horas de MIV). A quantidade relativa de transcritos para o gene GREM1, PTGS2, PFKP e AREG foi maior do que (P<0,05) nas células do cumulus de oócitos MIVO, nos experimentos 1 e 2 e para o gene GREM1 no experimento 3. No experimento 1, o grupo SFB exibiu maior (P<0,05) abundância de transcritos de GREM1 e AREG entre os grupos MIV. No experimento 2, a adição de 10 ng/mL ao meio de MIV propiciou uma regulação positiva de EREG. No experimento 3, BL12 apresentou maior (P<0,05) abundância de AREG e o BL24 de EREG e PTX3. Entre os grupos de MIV, o gene GREM1 foi expresso em maior quantidade (P<0,05) no BL12. Não houve diferença estatística nos experimentos 1, 2 e 3 entre os grupos de oócitos MIV, MIVO e VG para os genes GDF9, BMP15 e OOSP1. Conclui-se que, a utilização de diferentes macromoléculas, diferentes concentrações de EGF e a realização de précultivo com BLI altera a transcrição nas células ... / Abstract: The aim of this study was to quantify the abundance of genes associated with the development of oocyte competence in oocytes (GDF-9, BMP15 and OOSP1) and in cumulus cells (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 and ADAM-17) of immature oocytes (GV), in vivo matured (IVMO) and cultured in IVM medium with different macromolecules (FCS, BSA or PVA), different EGF concentrations or pre-cultured with butyrolactone I (BLI) before IVM. The experimental design consisted of three IVM experiments of bovine oocytes, namely: experiment 1, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing 10% FCS or 1 mg/mL PVA or 4 mg/mL BSA; Experiment 2, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing EGF (at concentrations of 0, 10 and 100 ng/mL); and Experiment 3, cumulus-oocyte complex in vitro matured in the absence (BL0) or presence of pre-maturation with 10 μM de BLI (BL12, 12 hours of pre-maturation and 12 hours of IVM, BL24, 24 hours of pre-maturation and 24 hours of IVM). The relative amount of transcripts for GREM1, PTGS2, PFKP and AREG gene was larger than (P <0.05) in cumulus cells of IVMO oocytes in experiments 1 and 2 and for GREM1 gene in experiment 3. In experiment 1, the FCS group exhibited higher (P <0.05) abundance of transcripts of GREM1 and AREG among MIV groups. In experiment 2, the addition of 10 ng/ml to the IVM medium provided an upregulation of EREG. In experiment 3, BL12 showed higher (P <0.05) abundance of AREG and BL24 of EREG and PTX3. Among IVM groups, the GREM1 gene was expressed in larger quantities (P <0.05) in BL12. There was no statistical difference in experiments 1, 2 and 3 among groups of oocytes IVM, IVMO and GV for GDF9, BMP15 and OOSP1 genes. It was concluded that the use of different macromolecules, different EGF concentrations and the performance of pre-culture with BLI change the transcription in the cumulus cell of genes associated with oocyte competence / Doutor

Uma das maiores dificuldades das terapias de reprodução assistida é a seleção de células germinativas de boa qualidade para posterior fertilização e implantação. Atualmente, a seleção de oócitos se dá basicamente por avaliação morfológica, que não reflete satisfatoriamente a competência oocitária. Assim, a busca por bioindicadores da qualidade oocitária é necessária. O cumulus oophorus forma um conjunto de células somáticas que circundam o oócito no folículo antral,mantendo uma relação íntima com a célula germinativa, com comunicação direta via junções tipo GAP. As células do cumulus oophorus são descartadas após técnicas de fertilização in vitro, o que as torna um material de fácil acesso, livre de conflitos éticos. Uma série de metodologias de análise das células do cumulus foram propostas para identificação de anormalidades no oócito. Porém, nenhuma delas é rotineiramente utilizada na clínica. Os processos celulares das células do cumulus refletem as condições do microambiente folicular, e podem, assim, trazer evidências das condições oocitárias. Nosso grupo analisou as células do cumulus primeiramente por meio de abordagens de bioinformática, que revelaram processos celulares relacionados ao desenvolvimento de embriões até o estágio de blastocisto. Com base nestes resultados, análises de parâmetros bioquímicos e expressão gênica das células do cumulus foram realizadas e permitiram a identificação de possíveis biomarcadores da qualidade do oócito que levam em consideração as características clínicas das pacientes. Estas análises indicaram que expressão do gene PTGS2 e a atividade da enzima Glutationa-S-Transferase como indicadores da formação de blastocistos em pacientes com diferentes variáveis clínicas (backgrounds) analisados. Se confirmados, estes parâmetros poderão ser utilizados como biomarcadores no ambiente clínico, elevando as taxas de sucesso em técnicas de reprodução assistida. / One of the great challenges in assisted reproduction techniques is the selection of appropriate germ cells for fertilization and implantation. Nowadays, oocyte selection occurs basically through morphological evaluation, which does not reflect satisfactorily the oocyte competence. Therefore, the search for bioindicators of oocyte quality is necessary. The cumulus oophorus forms a set of somatic cells that surround the oocyte in the antral follicle, participating in the processes of oocyte maturation and folliculogenesis. These cells maintain an intimate relationship with the germ cell, with direct communication via GAP junctions. Cumulus oophorus cells are discarded in in vitro fertilization techniques, which makes them an easy-access material that can be collected in a free-of-ethicalissues way. A series of cumulus cell analysis methodologies were proposed to identify abnormalities in the oocyte. However, none of them is routinely used in clinical environment. The cellular processes of cumulus cells reflect the conditions of the follicular microenvironment, and may thus bring evidences of oocyte conditions. Our group analyzed cumulus cells in search of predictors of oocyte quality primarily through bioinformatics approaches, which revealed cellular processes related to the development of embryos up to the blastocyst stage. Based on these results, analyzes of biochemical parameters and gene expression of cumulus cells were performed and allowed the identification of possible biomarkers of oocyte quality that takes into consideration patients clinical variables. These analysis indicated PTGS2 expression and Glutathione-S-Transferase activity as indicators of blastocyst formation in all patient profiles (backgrounds) analyzed. If confirmed, these parameters may be used as biomarkers in clinical environment, improving assisted reproduction success rates.

O objetivo deste trabalho foi modificar os procedimentos da maturação in vitro (MIV) para induzir a competência de oócitos bovinos com intensa atividade da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH), determinada pelo emprego do corante vital Azul de Cresil Brilhante (BCB). Foram realizados dois experimentos; no primeiro trabalho foi realizada a MIV de oócitos após a identificação da atividade da G6PDH, empregando-se a seguinte proporção: competentes (sem atividade enzimática)/não competentes - 10:01, respectivamente. Os resultados revelaram um efeito negativo dos oócitos não competentes sobre a capacidade dos competentes em realizarem a MIV, a FIV e a CIV. Os resultados sugerem que para aumentar a produção de embriões deve-se realizar a MIV de oócitos competentes e não competentes, separadamente. O objetivo do segundo experimento foi verificar se a prolongação do tempo de MIV (30h) afetaria as taxas de MIV, FIV e CIV obtidas a partir de oócitos não competentes. Os oócitos não competentes não foram afetados, positiva ou negativamente, pelo prolongamento do tempo de MIV, no entanto, os oócitos competentes sofreram decréscimo na capacidade de serem fecundados e desenvolverem-se até o estágio de blastocistos. Podemos concluir que as modificações realizadas no procedimento da MIV não foram capazes de induzir competência em oócitos com intensa atividade da enzima G6PDH. / The present work aimed modify the in vitro maturation (IVM) procedure to induce competence of bovine oocytes with high glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) activity. Two experiments were carried out; the first non-competent oocytes (with high enzymatic activity) were matured with competent oocyte (lower G6PDH activity) on proportion of 1:10, respectively. The second experiment aimed observe the effect of prolonged IVM (from 24 to 30h) on the cleavage and development rates in oocytes with higher enzymatic activity. Our data showed that oocytes with lower enzymatic activity did not induce competence of higher G6PDH activity oocyte. However, we observed a negatively effect on the cleavage and development rates on oocytes competent, then, to increase the number of embryos in vitro produced we need to mature oocytes competent and non-competent separately. In the second experiment, the non-competent gametes submitted to prolonged IVM were not affected, however, competent oocytes were negatively affect by prolonged IVM. We can concluded that the IVM modifications did not able to induce the competence in the oocytes with high G6PDH activity.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / O boto cinza, Sotalia fluviatilis, à uma espÃcie de cetÃceo costeira ameaÃada pela pesca artesanal, sendo necessÃrio um estudo da biologia reprodutiva, para a administraÃÃo e conservaÃÃo das populaÃÃes que estÃo sujeitas à mortalidade por aÃÃo antrÃpica. O estudo de folÃculos prÃ-antrais in situ permite uma melhor compreensÃo da fase prÃ-antral da foliculogÃnese, pouco conhecida nos cetÃceos em geral, e totalmente desconhecida em S. fluviatilis. A anÃlise quantitativa de folÃculos prÃ-antrais foi realizada enm ovÃrios de S. fluviatilis recuperados na costa do Cearà entre 1997-1999. A idade dos exemplares em estudo variou de 0 a 23 anos, com idade de maturaÃÃo sexual acima de 6 anos. A populaÃÃo folicular prÃ-antral analisada, apresentou-se totalmente degenerada, possivelmente em decorrÃncia do tempo âpÃs-mortemâ. Ainda assim, foram observadas diferenÃas significativas entre os estÃgios de maturaÃÃo sexual, onde animais imaturos apresentaram uma mÃdia de 1.162.460 folÃculos, enquanto os exemplares maturos apresentaram em mÃdia 66.270 folÃculos. Em relaÃÃo a posiÃÃo anatÃmica do ovÃrio foi observado que, em mÃdia, o ovÃrio esquerdo apresentou um nÃmero mais elevado de folÃculos quando comparado ao lado direito. Essa diferenÃa foi significativa somente para animais imaturos. NÃo houve uma diferenÃa significativa com relaÃÃo ao peso do ovÃrio direito e esquerdo dos exemplares imaturos e maturos. O nÃmero de folÃculos apresentou uma relaÃÃo uma relaÃÃo negativa com a idade e peso do ovÃrio, embora o peso tenha apresentado uma relaÃÃo positiva com a idade. Tais resultados mostraram que a populaÃÃo folicular de S. fluviatillis pode ser afetada por diversos fatores, entre eles estÃgio reprodutivo, idade, peso ovariano e posiÃÃo anatÃmica do ovÃrio. Os dados quantitativos da foliculogÃnese descrito neste trabalho poderÃo servir como parÃmetro para futuros estudos in vivo ou in vitro da foliculogÃnese em S. fluviatilis. Desta forma, novas informaÃÃes acerca dos folÃculos prÃ-antrais de S. fluviatilis poderÃo ser obtidos, gerando oportunidade para a realizaÃÃo de novas pesquisas, visando a elucidaÃÃo da foliculogÃnese da fase prÃ-antral na espÃcie, o que contribuirà no futuro para um melhor aproveitamento do seu potencial oocitÃrio. / Tucuxi, Sotalia fluviatilis, a coastal cetacean species threatened by artisanal fishing, needs a reproductive biology study in order to manage and preserve the populations subject to mortality for antropic action. A in situ of the preantral follicles allows a better understanding of the preantral phase of the folliculogenesis, little known in cetaceans and totally unknown in S. fluviatilis. Quantitative analysis of the preantral follicle was made in ovarian of S. fluviatilis recovered on the Ceara coast between 1997-1999. The age of the studied sample varied from 0 to 23 years, being sexual maturation above 6 years. The population preantral follicular analysed, was completely degenerate, possibly because of âpos-mortenâ time. Even so, significant difference were observed among sexual maturation stage, whwere immature animals showed na averege of 1.162.460 follicles, while in matures animals the averege was 66.270 follicles. Due to anatomic position of the ovarian, it was observed that the left ovarian had a higher number of follicles when compared to the right one. This difference was significant only for immature animals. There wasnât a significant difference related to weight of right and left ovarian of mature and imature sample. Number of follicles showed a negative relation with age and weight of the ovarian, although weight had a positive relation with age. These results indicate that the population follicular fo S. fluviatilis may be affected by many factors such as: reproductive stage, age, ovarian weight and anatomical position of the ovary. Quantitative data of the foliculogenisis described can be used as a parameter for future studies in vitro or in vivo of the folliculogenisis of S. fluviatilis. From this, new information about preantral follicles of S. fluviatilis can be acquired, leading to new reserch to explain the folliculogenese of preantral follicles phase of the species, contributing to a better utilization of oociterio potencial.