Orientador: Cesar Costapinto Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-28T16:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arruda_EduardoJosede_D.pdf: 7856367 bytes, checksum: 1d7f36a448598074798e438355197bc7 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A B-amilase (E.C 3.2.1.2) é uma enzima que hidrolisa terminais não reduzidos de amido e maltooligosacarídeos produzindo unidades de maltose. A principal aplicação desta enzima é a produção de xaropes concentrados de maltose. As fontes tradicionais de B-amilase são plantas e microorganismos. Desde que seu principal uso é na indústria de alimentos, o custo de produção da enzima precisa ser baixo. Deste modo, utilizou-se as técnicas de Recuperação e Purificação de Bioprodutos (RPB), conhecidas por" Dowstream Processing", que para este caso tem um importante papel econômico. O objetivo deste trabalho foi a síntese do adsorvente de pseudo-afmidade para recuperar e purificar B-amilase a partir de extrato de soja. O ligante de pseudo-afinidade e a matriz foram fenilboronato e quito sana reticulada referidos como PBC. As matrizes porosas e reticuladas foram obtidas por coagulação alcalina, a partir da solução de quitosana seguida por tratamento com glutaraldeído. Este tratamento teve dois objetivos: reticular o gel de quito sana e prover grupos aldeídos para o acoplamento do ligante a pH 8. A matriz foi caracterizada por sua densidade de ligante, distribuição do tamanho de partícula, distribuição do tamanho de poros, termo estabilidade, morfologia e área específica superficial. A densidade de ligante obtida foi comparada a densidade do gel comercial PBA 30 (de até 100 mmoles.mL-1). A análise dos poros mostrou que a matriz possui macroporos que podem ser controlados na coagulação alcalina. Os estudos da recuperação e purificação da B-amilase de extratos de soja com quito sana- fenilboronato foram realizados por isotermas de adsorção e curvas de ruptura e determinações de perfis cromatográficos. As isotermas de adsorção e as curvas de ruptura indicaram que a capacidade de adsorção foi similar ao gel PBA 30. As colunas cromatográficas produziram picos com 45% de atividade recuperada e fator de purificação de 4x. A interação da _-amilase e impurezas no gel PBC foram mais intensas e a eluição requereu concentração 5x maiores em NaCl. Sugerindo as interações eletrostáticas como o principal mecanismo para a interação. As similares características químicas e fisicas e o comportamento cromatográfico do PBC 100 comparado ao PBA 30 indicam o potencial do PBC como uma matriz adsorvente para aplicação em larga escala / Abstract: B-amylase (E.C 3.2.1.2) is an enzyme that hydrolyses non-reduced ends of starch and maltooligossacarides producing units of maltose. The main industrial application of this enzyme is the production of high maltose syrup. The traditional sources of B-amylase are plants and microorganism. Since its main use is found in food processing, the production cost of the enzyme must be low. Therefore, the downstream processing for this case has an important role in process economics. The objetive of this work was the synthesis of a pseudo-affinity adsorbent to recovery and purify B-amylase from soybean extract. The used pseudo-affinity ligand was phenylboronate and the performance of agarose and crosslinked chitosan as matrix were compared in this work. Glutaraldehyde crosslinked matrixes were obtained by aIkaline coagulation of chitosan solution followed by treatment with glutaraldehyde. This treatment had two goals: to crosslink the chitosan gel and to provide aldehyde groups for ligand coupling at pH 8. The matrix was characterized for its ligand density, particle size distribution, pore size distribution, thermostability, morphology and specific surface area. The achieved density of the ligand in the support produced in this work (PBC) was compared to the ligand density of PBA-30 a commercial support (up to 100 mmoles.mL-1). Pore size distribution analysis indicated that matrix had macroporous that can be controlled by the alkaline coagulation conditions. Studies of f3-amylase recovery and purification from soybean extracts with chitosan-phenylboronate matrix were carried out by adsorption isotherm, breakthrough curves, and chromatographic profile determinations. Adsorption isotherms and breakthrough curves indicated that the produced matrix had similar capacities compared to PBA 30. Assays in a chromatographic column lead to 45% activity recovery and 4-fold purification factor. The binding of f3-amylase and impurities onto PBC was much stronger than onto PBA 30: elution from PBC required solutions with 5-fold higher NaCI concentration, what suggests that electrostatic interactions is the main mechanism for binding. The similar chemical and physical characteristics and chromatographic behavior of PBC 100 compared to PBA 30 indicated the potencial of the PBC matrix as an adsorbent for large-scale application / Doutorado / Engenharia de Processos / Mestre em Engenharia Química

Neste trabalho, foi avaliada a resolução cinética de ésteres carboxílicos β-borilados, catalisada por lipases, através de hidrólise e transesterificação. Foram sintentizados ésteres contendo diferentes cadeias carbônicas. A hidrólise enantiosseletiva catalisada por CAL-B forneceu o correspondente ácido carboxílico β-borilado com excesso enantiomérico moderado (e.e. 62%), enquanto os ésteres β-borilados metílico e etílico foram recuperados com excelente pureza enantiomérica (e.e.>99%). A reação de transesterificação enantiosseletiva entre ésteres carboxílicos β-borilados e álcoois, catalisada por CAL-B, demonstrou uma alta seletividade somente quando etanol e (β-pinacolilboronato)-butanoato de metila foram usados como substratos, levando a formação de (β-pinacolilboronato)-butanoato de etila enantioenriquecido (e.e.>99%). Entretanto, ésteres contendo longas cadeias carbônicas ligadas à carboxila não sofreram as reações desejadas, mesmo em temperaturas mais elevadas. Adicionalmente, foi investigada a reação de aminação redutiva assimétrica, catalisada por ω-transaminases, de cetonas pró-quirais contendo grupos borônicos (ácido, éster ou trifluoroborato de potássio). Após as sínteses de cetonas aromáticas e alifáticas, os melhores resultados para a biotransformação foram obtidos com ω-transaminases (R)-seletivas de Arthrobacter sp. e Aspergillus terreus e (S)-seletiva de Chromobacterium violaceum. Sob as condições otimizadas, foram obtidas altas conversões (94%) com perfeitas enantiosseletividades (e.e.>99%), proporcionando assim uma nova via de acesso a aminas (R) ou (S) contendo boro em condições reacionais suaves. / In this work, the kinetic resolution of β-borylated carboxylic esters via lipase-catalyzed hydrolysis and transesterification reactions was evaluated. Esteres with different carbon chains were synthesized. The enantioselective hydrolysis catalyzed by CAL-B furnished the corresponding β-borylated carboxylic acid with reasonable enantiomeric excess (ee 62%), while both methyl and ethyl β-borylated carboxylic esters were recovered with excellent enantiomeric purity (ee>99%). The enantioselective transesterification reaction of β-borylated carboxylic esters and several alcohols, catalyzed by CAL-B, only indicated a high selectivity when ethanol and methyl-(β-pinacolylboronate)-butanoate were used as substrates, which gave the enantioenriched ethyl-(β-pinacolylboronate)-butanoate (ee >99%). However, esters with longer carbon chains or steric hindrance at the carboxyl group did not undergo the desired reactions, even at high temperatures. Additionally, the asymmetric reductive amination ω-transaminase catalyzed of boron-containing (acid, ester or potassium trifluoroborate) prochiral ketones was investigated. After the syntheses of aromatic and aliphatic ketones, the best results of biotransformation were obtained with (R)-selective ω-transaminases from Arthrobacter sp. and Aspergillus terreus and (S)-selective one from Chromobacterium violaceum. Under the optimized conditions, high conversions (94%) with perfect enantioselectivities (ee >99%) were found, providing a new access to (R) or (S) boron-containing amines under mild reaction conditions.

Neste trabalho, foi avaliada a resolução cinética de ésteres carboxílicos β-borilados, catalisada por lipases, através de hidrólise e transesterificação. Foram sintentizados ésteres contendo diferentes cadeias carbônicas. A hidrólise enantiosseletiva catalisada por CAL-B forneceu o correspondente ácido carboxílico β-borilado com excesso enantiomérico moderado (e.e. 62%), enquanto os ésteres β-borilados metílico e etílico foram recuperados com excelente pureza enantiomérica (e.e.>99%). A reação de transesterificação enantiosseletiva entre ésteres carboxílicos β-borilados e álcoois, catalisada por CAL-B, demonstrou uma alta seletividade somente quando etanol e (β-pinacolilboronato)-butanoato de metila foram usados como substratos, levando a formação de (β-pinacolilboronato)-butanoato de etila enantioenriquecido (e.e.>99%). Entretanto, ésteres contendo longas cadeias carbônicas ligadas à carboxila não sofreram as reações desejadas, mesmo em temperaturas mais elevadas. Adicionalmente, foi investigada a reação de aminação redutiva assimétrica, catalisada por ω-transaminases, de cetonas pró-quirais contendo grupos borônicos (ácido, éster ou trifluoroborato de potássio). Após as sínteses de cetonas aromáticas e alifáticas, os melhores resultados para a biotransformação foram obtidos com ω-transaminases (R)-seletivas de Arthrobacter sp. e Aspergillus terreus e (S)-seletiva de Chromobacterium violaceum. Sob as condições otimizadas, foram obtidas altas conversões (94%) com perfeitas enantiosseletividades (e.e.>99%), proporcionando assim uma nova via de acesso a aminas (R) ou (S) contendo boro em condições reacionais suaves. / In this work, the kinetic resolution of β-borylated carboxylic esters via lipase-catalyzed hydrolysis and transesterification reactions was evaluated. Esteres with different carbon chains were synthesized. The enantioselective hydrolysis catalyzed by CAL-B furnished the corresponding β-borylated carboxylic acid with reasonable enantiomeric excess (ee 62%), while both methyl and ethyl β-borylated carboxylic esters were recovered with excellent enantiomeric purity (ee>99%). The enantioselective transesterification reaction of β-borylated carboxylic esters and several alcohols, catalyzed by CAL-B, only indicated a high selectivity when ethanol and methyl-(β-pinacolylboronate)-butanoate were used as substrates, which gave the enantioenriched ethyl-(β-pinacolylboronate)-butanoate (ee >99%). However, esters with longer carbon chains or steric hindrance at the carboxyl group did not undergo the desired reactions, even at high temperatures. Additionally, the asymmetric reductive amination ω-transaminase catalyzed of boron-containing (acid, ester or potassium trifluoroborate) prochiral ketones was investigated. After the syntheses of aromatic and aliphatic ketones, the best results of biotransformation were obtained with (R)-selective ω-transaminases from Arthrobacter sp. and Aspergillus terreus and (S)-selective one from Chromobacterium violaceum. Under the optimized conditions, high conversions (94%) with perfect enantioselectivities (ee >99%) were found, providing a new access to (R) or (S) boron-containing amines under mild reaction conditions.

A utilização de sondas fluorescentes para marcação ou detecção de biomoléculas de interesse em processos biológicos distintos, vem recebendo grande atenção em pesquisas biomédicas, de análises clínicas e biologia celular. Em geral, estas sondas fluorescentes são constituídas por moléculas orgânicas pequenas, as quais apresentam características fluorescentes e capacidade de conjugar-se com estas biomoléculas. Desta forma, esta dissertação descreve inicialmente a síntese de compostos 2-aril ou 2,5- diarilfuranos e tiofenos (3, 5, 7 e 9a-i), a partir de espécies orgânicas de telúrio (1, 4, 6 e 8) e sais de ariltrifluoroboratos de potássio (2a-i), via reação de acoplamento cruzado tipo Suzuki-Miyaura, sob catálise de paládio [ver a figura no arquivo original]. Em seguida, descreve a síntese de um derivado 2,5-diarilfurano assimétrico, o 2-(3-aminofenil)-5-(4-metoxifenil)furano 11, o qual apresenta propriedades químicas e luminescentes adequadas para atuar como uma nova e promissora sonda fluorescente em processos de marcação ou detecção biológica. A síntese desta nova sonda, também chamada de 3-AFA (3-AnililFuranoAnisol), foi realizada a partir da reação de acoplamento cruzado tipo Suzuki-Miyaura, sob catálise de paládio, entre o ácido (3-aminofenil) borônico 5e e o 2- (butiltelanil)-5-(4-metoxifenil)furano 10 em 65 % de rendimento. Esta nova sonda 3-AFA 11 foi conjugada com uma série de L-aminoácidos 12a-l, a partir de uma reação de acoplamento peptídico para formação dos respectivos produtos 13a-l em rendimentos satisfatórios. Estes produtos conjugados 13a-l, apresentam potencial para marcação fluorescente de enzimas proteolíticas de interesse [ver a figura no arquivo original]. Adicionalmente, foram caracterizadas propriedades fotofísicas importantes desta nova sonda 3-AFA 11, entre as quais seus espectros eletrônicos de absorção e emissão de fluorescência, que obtiveram valores de λex a 320 nm e λem a 400 nm, respectivamente. Por fim, foi testado o potencial de acúmulo intracelular da sonda 3-AFA 11 em sistemas celulares tais como: eritrócitos infectados com Plasmodium chabaudi e amastigotas de Leishmania L. amazonensis, sendo possível observar em todos os casos a marcação fluorescente dos respectivos parasitas. / The use of fluorescent probes for labeling or detection of biomolecules of interest in different biological processes, has received much attention in biomedical, clinical testing and cell biology research. In general, these fluorescent probes are composed of small organic molecules, which have fluorescent features and ability to combine with these biomolecules. Thus, this work initially describes the synthesis of 2-aryl or 2,5-diarylfurans and thiophenes (3, 5, 7 and 9a-i) from organic species of tellurium (1, 4, 6 and 8) and potassium organotrifluoroborate salts (2a-i) by palladium catalyzed Suzuki-Miyaura crosscoupling reaction [see the figure in the original file]. After describe the synthesis of a unsymmetrical 2,5-diarylfuran derivative, the 2-(3-aminophenyl)-5-(4-methoxyphenyl)furan 11, which presents chemical and luminescent properties appropriate to act as a promising new fluorescent probes in processes of marking or biological detection. The synthesis of this new probe, also called 3-AFA (3-AnilylFuranAnisole), was performed from palladium catalyzed Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction, between (3- aminophenyl) boronic acid 5e and 2-(butyltellanyl)-5-(4-metoxyphenyl)furan 10 in 65 % yields. This new probe 3-AFA 11 was combined with a series of Lamino acids 12a-l from a peptidic coupling reaction to obtain their products 13a-l in satisfactory yield. These combined products 13a-l show a potential for fluorescent marking of proteolitic enzymes [see the figure in the original file]. Additionally, important photo physical properties of this new probe 3-AFA 11 were characterized. These include their electronic spectra of absorption and fluorescence emission, who obtained values of λex to 320 nm and λem to 400 nm, respectively. Finally, we tested the potential of probe 3-AFA 11 for intracellular accumulation in cellular systems such as: erythrocytes infected with Plasmodium chabaudi and amastigotes of Leishmania L. amazonensis, in all cases the fluorescent uptake cellular of their parasites can be observed.

A utilização de sondas fluorescentes para marcação ou detecção de biomoléculas de interesse em processos biológicos distintos, vem recebendo grande atenção em pesquisas biomédicas, de análises clínicas e biologia celular. Em geral, estas sondas fluorescentes são constituídas por moléculas orgânicas pequenas, as quais apresentam características fluorescentes e capacidade de conjugar-se com estas biomoléculas. Desta forma, esta dissertação descreve inicialmente a síntese de compostos 2-aril ou 2,5- diarilfuranos e tiofenos (3, 5, 7 e 9a-i), a partir de espécies orgânicas de telúrio (1, 4, 6 e 8) e sais de ariltrifluoroboratos de potássio (2a-i), via reação de acoplamento cruzado tipo Suzuki-Miyaura, sob catálise de paládio [ver a figura no arquivo original]. Em seguida, descreve a síntese de um derivado 2,5-diarilfurano assimétrico, o 2-(3-aminofenil)-5-(4-metoxifenil)furano 11, o qual apresenta propriedades químicas e luminescentes adequadas para atuar como uma nova e promissora sonda fluorescente em processos de marcação ou detecção biológica. A síntese desta nova sonda, também chamada de 3-AFA (3-AnililFuranoAnisol), foi realizada a partir da reação de acoplamento cruzado tipo Suzuki-Miyaura, sob catálise de paládio, entre o ácido (3-aminofenil) borônico 5e e o 2- (butiltelanil)-5-(4-metoxifenil)furano 10 em 65 % de rendimento. Esta nova sonda 3-AFA 11 foi conjugada com uma série de L-aminoácidos 12a-l, a partir de uma reação de acoplamento peptídico para formação dos respectivos produtos 13a-l em rendimentos satisfatórios. Estes produtos conjugados 13a-l, apresentam potencial para marcação fluorescente de enzimas proteolíticas de interesse [ver a figura no arquivo original]. Adicionalmente, foram caracterizadas propriedades fotofísicas importantes desta nova sonda 3-AFA 11, entre as quais seus espectros eletrônicos de absorção e emissão de fluorescência, que obtiveram valores de λex a 320 nm e λem a 400 nm, respectivamente. Por fim, foi testado o potencial de acúmulo intracelular da sonda 3-AFA 11 em sistemas celulares tais como: eritrócitos infectados com Plasmodium chabaudi e amastigotas de Leishmania L. amazonensis, sendo possível observar em todos os casos a marcação fluorescente dos respectivos parasitas. / The use of fluorescent probes for labeling or detection of biomolecules of interest in different biological processes, has received much attention in biomedical, clinical testing and cell biology research. In general, these fluorescent probes are composed of small organic molecules, which have fluorescent features and ability to combine with these biomolecules. Thus, this work initially describes the synthesis of 2-aryl or 2,5-diarylfurans and thiophenes (3, 5, 7 and 9a-i) from organic species of tellurium (1, 4, 6 and 8) and potassium organotrifluoroborate salts (2a-i) by palladium catalyzed Suzuki-Miyaura crosscoupling reaction [see the figure in the original file]. After describe the synthesis of a unsymmetrical 2,5-diarylfuran derivative, the 2-(3-aminophenyl)-5-(4-methoxyphenyl)furan 11, which presents chemical and luminescent properties appropriate to act as a promising new fluorescent probes in processes of marking or biological detection. The synthesis of this new probe, also called 3-AFA (3-AnilylFuranAnisole), was performed from palladium catalyzed Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction, between (3- aminophenyl) boronic acid 5e and 2-(butyltellanyl)-5-(4-metoxyphenyl)furan 10 in 65 % yields. This new probe 3-AFA 11 was combined with a series of Lamino acids 12a-l from a peptidic coupling reaction to obtain their products 13a-l in satisfactory yield. These combined products 13a-l show a potential for fluorescent marking of proteolitic enzymes [see the figure in the original file]. Additionally, important photo physical properties of this new probe 3-AFA 11 were characterized. These include their electronic spectra of absorption and fluorescence emission, who obtained values of λex to 320 nm and λem to 400 nm, respectively. Finally, we tested the potential of probe 3-AFA 11 for intracellular accumulation in cellular systems such as: erythrocytes infected with Plasmodium chabaudi and amastigotes of Leishmania L. amazonensis, in all cases the fluorescent uptake cellular of their parasites can be observed.