Processos fermentativos que visam um salto tecnológico na produção de etanol, que potencialize o processo fermentativo, destaca-se a fermentação extrativa a vácuo. Assim buscou-se selecionar linhagens tolerantes à alta pressão osmótica para serem empregadas em processo de fermentação extrativa. Foram realizadas seleções a partir de 444 cepas de leveduras oriundas da biodiversidade das Usinas Brasileiras, que fazem parte do banco de leveduras do Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), tendo como base o meio formulado com melaço e vinhaça para simular a fermentação extrativa. A seleção se baseou em submeter as linhagens às fermentações em condições crescentes de estresse osmótico, buscando destacar linhagens com a tolerância desejada. Para tal, as linhagens em mistura foram submetidas à propagação durante 93 gerações em meios com crescentes quantidades de melaço e vinhaça. Em etapa seguinte, 90 cepas foram isoladas e avaliadas mediante o crescimento (μmax e biomassa) em condição de estresse osmótico e genotipadas. O método usado na genotipagem foi o PCR - microssatélite, o qual permitiu verificar se as cepas resultantes da seleção eram cepas industriais (BG-1, CAT-1, PE-2 e SA-1) ou cepas selvagens e/ou predominantes. Foram utilizados 5 pares de primers representando 5 diferentes loci. A genotipagem e a avaliação do crescimento em condições de estresse osmótico, baseado em características genéticas e fisiológicas, permitiu identificar 24 linhagens com potencial de tolerância a pressão osmótica. As cepas com desempenho superior foram submetidas à avaliação de crescimento em placa e as sete mais tolerantes à pressão osmótica foram selecionadas e utilizadas em reciclos fermentativos empregando-se mosto constituído de melaço e vinhaça. A linhagem com as melhores características para a fermentação com alta pressão osmótica foi avaliada em condições de fermentação extrativa à vácuo. A linhagem selecionada, denominada de F1-5, mostrou-se com grande potencial para a fermentação extrativa quando comparada com a referência CAT-1. / Fermentative processes that aim for technology innovations in the ethanol production, which improve the fermentative process, emphasizing the in vacuum extractive fermentation. So we have selected strains tolerant for high osmotic pressure to be in extractive fermentation process for ethanol production. We 444 yeast strains from Brazilian Mills biodiversity, which Sugarcane Technology Center\'s (CTC) yeast bank, based on a medium formulated with molasses and vinasse, to simulate the extractive fermentation. The selection was based on submiting strains to the fermentation in in high osmotic stress condition, trying to feature strains with desired tolerance, so, the mixed strains were submitted to propagation for 93 generations in medium with increasing amounts of molasses and vinasse. In the following step, 90 strains were isolated and evaluated by growth (μmax and biomass) in osmotic stress condition and genotyped. The method used in genotyping was the PCR - microsatellite, which enable to estimate if resulting selection strains were from industrial strains (BG-1, CAT-1, PE-2 and SA-1) or wild strains and / or prevalent. 5 pairs of primers were used representing 5 different loci. The genotyping and the growth evaluation in osmotic stress conditions allowed identify strains based on genetic and physiological characteristics, making possible to identify 24 strains with a potential tolerance to osmotic pressure. The strains with better performance were submitted to evaluation growth on boards and the 7 most tolerant to osmotic pressure were selected and used in fermentative recycles using medium containing molasses and vinasse. The strain with the best features in the fermentation in high osmotic pressure was evaluated in vacuum extractive fermentation conditions. The selected strain, named F1-5, proved to have a great potential for extractive fermentation when compared to the reference CAT-1.

O Brasil é o segundo maior produtor de etanol do mundo. A produção de etanol brasileira é quase que exclusivamente por via fermentativa. A fermentação alcoólica é uma etapa do processo industrial que consome grandes quantidades de água para diluir o xarope ou melaço para o preparo do mosto. Ademais, para cada litro de etanol produzido são gerados cerca de 10 a 14 litros de vinhaça. Este resíduo apresenta alto potencial poluente e pode atingir os recursos hídricos. Contudo, é composto por mais de 90% de água. Nesse sentido, uma estratégia para reduzir o potencial poluidor é realizar a produção de biogás através da biodigestão anaeróbia da vinhaça. Após esse processo, a água contida na vinhaça biodigerida pode ser tratada, com o auxílio de processos físico-químicos, e reutilizada em outros processo industriais. Por esses motivos, o objetivo do trabalho foi recuperar a água presente na vinhaça biodigerida e utilizá-la na diluição do xarope para fermentação alcoólica. Na primeira etapa da pesquisa, a vinhaça biodigerida foi submetida aos tratamentos físico-químicos, os quais consistiram em etapas de coagulação, sedimentação, centrifugação, filtragens sucessivas em filtro de areia, filtro de polipropileno (20 e 5 μm), filtro de carvão ativado e microfiltração (0,22 μm). A avaliação do resultado desses tratamentos foi realizada com base nos resultados de pH, condutividade, teor de sólidos totais (ST), sólidos totais voláteis (STV) e sólidos totais fixos (STF), demanda química de oxigênio(DQO), turbidez, teores de cátions e ânions. A segunda etapa, consistiu na realização de fermentação alcoólica com 4 ciclos fermentativos, utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram investigados dois tratamentos, a saber: 1) Tratamento 1 (T1) - Controle: o mosto foi preparado com diluição do xarope realizada com o uso de água destilada; e, Tratamento 2 (T2): o mosto foi preparado com a diluição do xarope utilizando água proveniente da vinhaça biodigerida após os tratamentos supracitados. Na 2ª etapa foram avaliados os seguintes parâmetros: açúcares redutores totais (ART), teor alcoólico, teores de cátions e ânions, glicerol, viabilidade celular, concentração de células de levedura, contaminação microbiana, rendimento e produtividade. As amostras de vinhaça biodigerida e amostras de água proveniente da vinhaça biodigerida apresentaram os seguintes resultados: pH 7,68 e a 7,99, respectivamente; turbidez de 2190 (±39,69) NTU e a 729,67(±10,07) NTU, respectivamente; e os teores totais de cátions de 24.984,67 mg L-1 e para 22.930,99 mg L-1, respectivamente. Também foram observadas diminuições nos teores dos seguintes componentes da água recuperada da vinhaça biodigerida: condutividade: diminuição de 39%; o teor de ST: redução de 28,2% e de STV diminuição de 42,5%. Já os teores totais de ânions nas amostras de água recuperada e tratada não apresentaram diferença significativa Na fermentação alcoólica, aquela conduzida sob as condições do T2 apresentou diferenças significativas no rendimento, em que no ciclo 3 a diferença entre os dois tratamentos foi de 12,6% (T1: 83,56% e T2: 70,99%) e no ciclo 4 essa diferença foi de 9,1 % (T1: 80,65% e T2: 71,56%). A produtividade no T2 também foi menor; no ciclo 2, a diferença entre T1 e T2 foi de 1,6 mL L-1 h-1 (T1: 8,83 ml L-1 h-1 e T2: 7,25 ml L-1 h-1); no ciclo 3 a diferença foi ainda maior atingindo 2,96 mL L-1 h-1 (T1: 10,0 mL L-1 h-1 e T2: 7,04 mL L-1 h-1). Esse comportamento também foi observado no ciclo 4, quando a produtividade de T1 foi 2,47 mL L-1 h-1 maior do que T2, ou melhor, T1: 10,25 mL L-1 h-1 e T2: 7,78 mL L-1 h-1. Essas diferenças nos resultados de T2 em relação aos do Tratamento Controle podem ser atribuídos altos teores de cátions no mosto, uma vez que as diferenças foram muito grandes, pois em T1 foram encontrados teores médios de 11206,86 ±123,99 mg L-1 e em T2, os resultados encontrados foram de 29.521,14 ±597,29 mg L-1. Isso pode ter induzido estresse osmótico às leveduras submetidas ao T2, de modo que, afetou negativamente a produtividade da fermentação. Portanto, conclui-se que é possível utilizar a água proveniente da vinhaça biodigerida no preparo do mosto para a fermentação alcoólica. Contudo, há necessidade de tratamento complementar aos realizados no presente estudo, visando reduzir a concentração de sais e por consequência o estresse osmótico às leveduras. / Brazil is the second largest producer of ethanol in the world. Brazilian ethanol production is almost exclusively via fermentation. Alcoholic fermentation is a stage of the industrial process that consumes large amounts of water to dilute the syrup or molasses for the preparation of the must. In addition, about 10 to 14 liters of vinasse are generated for each liter of ethanol produced. This residue presents high polluting potential and can reach water resources. However, it is composed of more than 90% water. In this sense, a strategy to reduce the polluting potential is to realize biogas production through anaerobic biodigestion of vinasse. After this process, the water contained in biodigested vinasse can be treated with the support of physico-chemical processes and reused in other industrial processes. For these reasons, the objective of the work was to recover the water present in the biodigested vinasse and to use it in the dilution of syrup for alcoholic fermentation. In the first phase of the research, biodigested vinasse was submitted to physical-chemical treatments, which consisted of coagulation, sedimentation, centrifugation, successive sand filtration, polypropylene filter (20 and 5 μm), activated carbon filter and microfiltration (0, 22 μm). The evaluation results of these treatments were carried out based on the results of pH, conductivity, total solids (TS), total volatile solids (STV), and fixed total solids (FTS), chemical oxygen demand (COD), turbidity, content of cations and anions. The second stage consisted of alcoholic fermentation with 4 fermentation cycles, using Saccharomyces cereviasiee yeasts. Two treatments were investigated: 1) Treatment 1 (T1) - Control: the wort was prepared with dilution of the syrup performed with the use of distilled water; and Treatment 2 (T2): the wort was prepared by diluting the syrup using water from the biodigested vinasse after the above treatments. In the second stage, the following parameters were evaluated: total reducing sugars (ART), alcohol content, cation and anion contents, glycerol, cell viability, yeast cell concentration, microbial contamination, yield and productivity. Samples of biodigested vinasse and samples of water from biodigested vinasse presented the following results: pH 7.68 and 7.99, respectively; turbidity of 2190 (± 39.69) NTU and 729.67 (± 10.07) NTU, respectively; and the total cation contents of 24,984.67 mg L-1 and 22930.99 mg L-1, respectively. Reductions of the following proportions were also observed in the water recovered from biodigested vinasse: conductivity: 39% decrease; the ST content: reduction of 28.2% and STV decrease of 42.5%. The total amount of anions in the samples of recovered and traded water did not present significant difference. In the alcoholic fermentation, the one conducted under T2 conditions presented significant differences in the yield; , in which in cycle 3 the difference between the two treatments was 12.6% (T1: 83.56% and T2: 70.99%) and in cycle 4 this difference was 9.1% (T1: 80, 65% and T2: 71.56%). Productivity in T2 was also lower; in cycle 2 the difference between T1 and T2 was 1.6 mL L-1 h-1 (T1: 8.83 mL L-1 h-1 and T2: 7.25 mL L-1 h-1); in cycle 3 the difference was even higher reaching 2.96 mL L-1 h-1 (T1: 10.0 mL L-1 h-1 and T2: 7.04 mL L-1 h-1). This behavior was also observed in cycle 4, when the productivity of T1 was 2.47 mL L-1 h-1 higher than T2, or better, T1: 10.25 mL L-1 h-1 and T2: 7.78 mL L-1 h-1. These differences in the results of T2 in relation to the Control Treatment can be attributed high levels of cations in the wort, since the differences were very large, because in T1 were found average contents of 11206.86 ± 123.99 mg L-1 and in T2, the results found were 29,521.14 ± 597.29 mg L-1. This may have induced osmotic stress to the yeasts submitted to T2, so that it negatively affected the fermentation productivity. Therefore, it is concluded that it is possible to use water from the biodigested vinasse in the preparation of the must for alcoholic fermentation. However, there is a need for complementary treatment to those carried out in the present study, in order to reduce the concentration of salts and consequently the osmotic stress to the yeasts.

O Brasil é o segundo maior produtor de etanol do mundo. A produção de etanol brasileira é quase que exclusivamente por via fermentativa. A fermentação alcoólica é uma etapa do processo industrial que consome grandes quantidades de água para diluir o xarope ou melaço para o preparo do mosto. Ademais, para cada litro de etanol produzido são gerados cerca de 10 a 14 litros de vinhaça. Este resíduo apresenta alto potencial poluente e pode atingir os recursos hídricos. Contudo, é composto por mais de 90% de água. Nesse sentido, uma estratégia para reduzir o potencial poluidor é realizar a produção de biogás através da biodigestão anaeróbia da vinhaça. Após esse processo, a água contida na vinhaça biodigerida pode ser tratada, com o auxílio de processos físico-químicos, e reutilizada em outros processo industriais. Por esses motivos, o objetivo do trabalho foi recuperar a água presente na vinhaça biodigerida e utilizá-la na diluição do xarope para fermentação alcoólica. Na primeira etapa da pesquisa, a vinhaça biodigerida foi submetida aos tratamentos físico-químicos, os quais consistiram em etapas de coagulação, sedimentação, centrifugação, filtragens sucessivas em filtro de areia, filtro de polipropileno (20 e 5 μm), filtro de carvão ativado e microfiltração (0,22 μm). A avaliação do resultado desses tratamentos foi realizada com base nos resultados de pH, condutividade, teor de sólidos totais (ST), sólidos totais voláteis (STV) e sólidos totais fixos (STF), demanda química de oxigênio(DQO), turbidez, teores de cátions e ânions. A segunda etapa, consistiu na realização de fermentação alcoólica com 4 ciclos fermentativos, utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram investigados dois tratamentos, a saber: 1) Tratamento 1 (T1) - Controle: o mosto foi preparado com diluição do xarope realizada com o uso de água destilada; e, Tratamento 2 (T2): o mosto foi preparado com a diluição do xarope utilizando água proveniente da vinhaça biodigerida após os tratamentos supracitados. Na 2ª etapa foram avaliados os seguintes parâmetros: açúcares redutores totais (ART), teor alcoólico, teores de cátions e ânions, glicerol, viabilidade celular, concentração de células de levedura, contaminação microbiana, rendimento e produtividade. As amostras de vinhaça biodigerida e amostras de água proveniente da vinhaça biodigerida apresentaram os seguintes resultados: pH 7,68 e a 7,99, respectivamente; turbidez de 2190 (±39,69) NTU e a 729,67(±10,07) NTU, respectivamente; e os teores totais de cátions de 24.984,67 mg L-1 e para 22.930,99 mg L-1, respectivamente. Também foram observadas diminuições nos teores dos seguintes componentes da água recuperada da vinhaça biodigerida: condutividade: diminuição de 39%; o teor de ST: redução de 28,2% e de STV diminuição de 42,5%. Já os teores totais de ânions nas amostras de água recuperada e tratada não apresentaram diferença significativa Na fermentação alcoólica, aquela conduzida sob as condições do T2 apresentou diferenças significativas no rendimento, em que no ciclo 3 a diferença entre os dois tratamentos foi de 12,6% (T1: 83,56% e T2: 70,99%) e no ciclo 4 essa diferença foi de 9,1 % (T1: 80,65% e T2: 71,56%). A produtividade no T2 também foi menor; no ciclo 2, a diferença entre T1 e T2 foi de 1,6 mL L-1 h-1 (T1: 8,83 ml L-1 h-1 e T2: 7,25 ml L-1 h-1); no ciclo 3 a diferença foi ainda maior atingindo 2,96 mL L-1 h-1 (T1: 10,0 mL L-1 h-1 e T2: 7,04 mL L-1 h-1). Esse comportamento também foi observado no ciclo 4, quando a produtividade de T1 foi 2,47 mL L-1 h-1 maior do que T2, ou melhor, T1: 10,25 mL L-1 h-1 e T2: 7,78 mL L-1 h-1. Essas diferenças nos resultados de T2 em relação aos do Tratamento Controle podem ser atribuídos altos teores de cátions no mosto, uma vez que as diferenças foram muito grandes, pois em T1 foram encontrados teores médios de 11206,86 ±123,99 mg L-1 e em T2, os resultados encontrados foram de 29.521,14 ±597,29 mg L-1. Isso pode ter induzido estresse osmótico às leveduras submetidas ao T2, de modo que, afetou negativamente a produtividade da fermentação. Portanto, conclui-se que é possível utilizar a água proveniente da vinhaça biodigerida no preparo do mosto para a fermentação alcoólica. Contudo, há necessidade de tratamento complementar aos realizados no presente estudo, visando reduzir a concentração de sais e por consequência o estresse osmótico às leveduras. / Brazil is the second largest producer of ethanol in the world. Brazilian ethanol production is almost exclusively via fermentation. Alcoholic fermentation is a stage of the industrial process that consumes large amounts of water to dilute the syrup or molasses for the preparation of the must. In addition, about 10 to 14 liters of vinasse are generated for each liter of ethanol produced. This residue presents high polluting potential and can reach water resources. However, it is composed of more than 90% water. In this sense, a strategy to reduce the polluting potential is to realize biogas production through anaerobic biodigestion of vinasse. After this process, the water contained in biodigested vinasse can be treated with the support of physico-chemical processes and reused in other industrial processes. For these reasons, the objective of the work was to recover the water present in the biodigested vinasse and to use it in the dilution of syrup for alcoholic fermentation. In the first phase of the research, biodigested vinasse was submitted to physical-chemical treatments, which consisted of coagulation, sedimentation, centrifugation, successive sand filtration, polypropylene filter (20 and 5 μm), activated carbon filter and microfiltration (0, 22 μm). The evaluation results of these treatments were carried out based on the results of pH, conductivity, total solids (TS), total volatile solids (STV), and fixed total solids (FTS), chemical oxygen demand (COD), turbidity, content of cations and anions. The second stage consisted of alcoholic fermentation with 4 fermentation cycles, using Saccharomyces cereviasiee yeasts. Two treatments were investigated: 1) Treatment 1 (T1) - Control: the wort was prepared with dilution of the syrup performed with the use of distilled water; and Treatment 2 (T2): the wort was prepared by diluting the syrup using water from the biodigested vinasse after the above treatments. In the second stage, the following parameters were evaluated: total reducing sugars (ART), alcohol content, cation and anion contents, glycerol, cell viability, yeast cell concentration, microbial contamination, yield and productivity. Samples of biodigested vinasse and samples of water from biodigested vinasse presented the following results: pH 7.68 and 7.99, respectively; turbidity of 2190 (± 39.69) NTU and 729.67 (± 10.07) NTU, respectively; and the total cation contents of 24,984.67 mg L-1 and 22930.99 mg L-1, respectively. Reductions of the following proportions were also observed in the water recovered from biodigested vinasse: conductivity: 39% decrease; the ST content: reduction of 28.2% and STV decrease of 42.5%. The total amount of anions in the samples of recovered and traded water did not present significant difference. In the alcoholic fermentation, the one conducted under T2 conditions presented significant differences in the yield; , in which in cycle 3 the difference between the two treatments was 12.6% (T1: 83.56% and T2: 70.99%) and in cycle 4 this difference was 9.1% (T1: 80, 65% and T2: 71.56%). Productivity in T2 was also lower; in cycle 2 the difference between T1 and T2 was 1.6 mL L-1 h-1 (T1: 8.83 mL L-1 h-1 and T2: 7.25 mL L-1 h-1); in cycle 3 the difference was even higher reaching 2.96 mL L-1 h-1 (T1: 10.0 mL L-1 h-1 and T2: 7.04 mL L-1 h-1). This behavior was also observed in cycle 4, when the productivity of T1 was 2.47 mL L-1 h-1 higher than T2, or better, T1: 10.25 mL L-1 h-1 and T2: 7.78 mL L-1 h-1. These differences in the results of T2 in relation to the Control Treatment can be attributed high levels of cations in the wort, since the differences were very large, because in T1 were found average contents of 11206.86 ± 123.99 mg L-1 and in T2, the results found were 29,521.14 ± 597.29 mg L-1. This may have induced osmotic stress to the yeasts submitted to T2, so that it negatively affected the fermentation productivity. Therefore, it is concluded that it is possible to use water from the biodigested vinasse in the preparation of the must for alcoholic fermentation. However, there is a need for complementary treatment to those carried out in the present study, in order to reduce the concentration of salts and consequently the osmotic stress to the yeasts.

Caulobacter crescentus está entre as bactérias cujos genomas codificam um grande número de fatores sigma ECF, os quais estão envolvidos na regulação transcricional de conjuntos limitados de genes em resposta a uma variedade de estímulos ambientais. No presente trabalho, dois fatores sigma ECF de C. crescentus, σR e σT , foram caracterizados funcionalmente. Os dados mostraram que σR e σT e são mantidos em níveis reduzidos de expressão sob condições fisiológicas de crescimento da bactéria, devido à ação das proteínas ChrR e CC3476, respectivamente. Contudo, durante a exposição de C. crescentus ao cádmio, hidroperóxido orgânico, oxigênio singlete ou à radiação UVA, a expressão de σR é induzida de maneira dependente do próprio fator sigma. Análises de transcriptoma mostraram que σR regula a expressão de genes envolvidos na proteção celular contra danos oxidativos. Central para essa resposta transcricional mediada por σR é a inativação de ChrR, sendo os resíduos C186 e C188 desta proteína necessários para a percepção de cádmio, mas não de hidroperóxido orgânico ou oxigênio singlete. Em adição, os dados mostraram que sigR e dois outros genes dependentes de σR (cfaS e CC2258) são essenciais para a sobrevivência de C. crescentus quando os danos oxidativos são gerados nas células por longos períodos. Similarmente, a expressão de σT aumenta em nível transcricional nesta bactéria sob condições de hiperosmolaridade induzidas por NaCl ou sacarose. Além de se auto-regular positivamente, σT controla a expressão de σU e σE , constituindo uma cascata de expressão de fatores sigma ECF em C. crescentus. σT, mas não σU e σE , desempenha um papel essencial na sobrevivência dessa bactéria durante a exposição ao NaCl e sacarose. Adicionalmente, a ausência de σT resulta numa sensibilidade aumentada dessa bactéria ao H2O2, apesar de não ser observada indução da expressão dos genes sigT, sigU e sigE durante essa condição de estresse. Diante do exposto, o presente trabalho contribuiu para a compreensão de dois mecanismos de adaptação da bactéria C. crescentus aos estresses oxidativo ou osmótico / Caulobacter crescentus is among the bacteria whose genomes encode a high number of ECF sigma factors, which are involved in the transcriptional regulation of a limited set of genes in response to several environmental signals. In the present work, two ECF sigma factors from C. crescentus, σR e σT, were functionally characterized. Data showed that σR e σT are maintained in reduced expression levels under physiological growth conditions, due to the action of ChrR and CC3476, respectively. However, during C. crescentus exposure to cadmium, organic hydroperoxide, singlet oxygen and UVA irradiation, σR expression is positively auto-regulated. Transcriptome analyses showed that σR regulates the expression of genes involved in protecting cells against oxidative damages. Central to this transcriptional response is the inactivation of ChrR, with residues C186 and C188 of this protein being necessary for sensing cadmium but not organic hydroperoxide or singlet oxygen. In addition, data revealed that sigR and two other σR-dependent genes (cfaS and CC2258) are essential for C. crescentus survival when oxidative damages are generated in the cells for long periods of time. Similarly, σT expression increases at a transcriptional level in this bacterium under hyperosmotic conditions induced by NaCl or sucrose. Besides being positively auto-regulated, σT independently controls the expression of σU and σE, forming an expression cascade of ECF sigma factors in C. crescentus. σT, but not σU or σE, displays an essential role in C. crescentus survival during NaCl or sucrose exposure. Additionally, the absence of σT leads to an increased sensitivity of this bacterium to H2O2, despite the absence of induction in sigT, sigU or sigE expression under the same stress condition. Therefore, the present work has contributed to the understanding of two mechanisms of C. crescentus adaptation to oxidative and osmotic stresses

Processos fermentativos que visam um salto tecnológico na produção de etanol, que potencialize o processo fermentativo, destaca-se a fermentação extrativa a vácuo. Assim buscou-se selecionar linhagens tolerantes à alta pressão osmótica para serem empregadas em processo de fermentação extrativa. Foram realizadas seleções a partir de 444 cepas de leveduras oriundas da biodiversidade das Usinas Brasileiras, que fazem parte do banco de leveduras do Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), tendo como base o meio formulado com melaço e vinhaça para simular a fermentação extrativa. A seleção se baseou em submeter as linhagens às fermentações em condições crescentes de estresse osmótico, buscando destacar linhagens com a tolerância desejada. Para tal, as linhagens em mistura foram submetidas à propagação durante 93 gerações em meios com crescentes quantidades de melaço e vinhaça. Em etapa seguinte, 90 cepas foram isoladas e avaliadas mediante o crescimento (μmax e biomassa) em condição de estresse osmótico e genotipadas. O método usado na genotipagem foi o PCR - microssatélite, o qual permitiu verificar se as cepas resultantes da seleção eram cepas industriais (BG-1, CAT-1, PE-2 e SA-1) ou cepas selvagens e/ou predominantes. Foram utilizados 5 pares de primers representando 5 diferentes loci. A genotipagem e a avaliação do crescimento em condições de estresse osmótico, baseado em características genéticas e fisiológicas, permitiu identificar 24 linhagens com potencial de tolerância a pressão osmótica. As cepas com desempenho superior foram submetidas à avaliação de crescimento em placa e as sete mais tolerantes à pressão osmótica foram selecionadas e utilizadas em reciclos fermentativos empregando-se mosto constituído de melaço e vinhaça. A linhagem com as melhores características para a fermentação com alta pressão osmótica foi avaliada em condições de fermentação extrativa à vácuo. A linhagem selecionada, denominada de F1-5, mostrou-se com grande potencial para a fermentação extrativa quando comparada com a referência CAT-1. / Fermentative processes that aim for technology innovations in the ethanol production, which improve the fermentative process, emphasizing the in vacuum extractive fermentation. So we have selected strains tolerant for high osmotic pressure to be in extractive fermentation process for ethanol production. We 444 yeast strains from Brazilian Mills biodiversity, which Sugarcane Technology Center\'s (CTC) yeast bank, based on a medium formulated with molasses and vinasse, to simulate the extractive fermentation. The selection was based on submiting strains to the fermentation in in high osmotic stress condition, trying to feature strains with desired tolerance, so, the mixed strains were submitted to propagation for 93 generations in medium with increasing amounts of molasses and vinasse. In the following step, 90 strains were isolated and evaluated by growth (μmax and biomass) in osmotic stress condition and genotyped. The method used in genotyping was the PCR - microsatellite, which enable to estimate if resulting selection strains were from industrial strains (BG-1, CAT-1, PE-2 and SA-1) or wild strains and / or prevalent. 5 pairs of primers were used representing 5 different loci. The genotyping and the growth evaluation in osmotic stress conditions allowed identify strains based on genetic and physiological characteristics, making possible to identify 24 strains with a potential tolerance to osmotic pressure. The strains with better performance were submitted to evaluation growth on boards and the 7 most tolerant to osmotic pressure were selected and used in fermentative recycles using medium containing molasses and vinasse. The strain with the best features in the fermentation in high osmotic pressure was evaluated in vacuum extractive fermentation conditions. The selected strain, named F1-5, proved to have a great potential for extractive fermentation when compared to the reference CAT-1.

Caulobacter crescentus está entre as bactérias cujos genomas codificam um grande número de fatores sigma ECF, os quais estão envolvidos na regulação transcricional de conjuntos limitados de genes em resposta a uma variedade de estímulos ambientais. No presente trabalho, dois fatores sigma ECF de C. crescentus, σR e σT , foram caracterizados funcionalmente. Os dados mostraram que σR e σT e são mantidos em níveis reduzidos de expressão sob condições fisiológicas de crescimento da bactéria, devido à ação das proteínas ChrR e CC3476, respectivamente. Contudo, durante a exposição de C. crescentus ao cádmio, hidroperóxido orgânico, oxigênio singlete ou à radiação UVA, a expressão de σR é induzida de maneira dependente do próprio fator sigma. Análises de transcriptoma mostraram que σR regula a expressão de genes envolvidos na proteção celular contra danos oxidativos. Central para essa resposta transcricional mediada por σR é a inativação de ChrR, sendo os resíduos C186 e C188 desta proteína necessários para a percepção de cádmio, mas não de hidroperóxido orgânico ou oxigênio singlete. Em adição, os dados mostraram que sigR e dois outros genes dependentes de σR (cfaS e CC2258) são essenciais para a sobrevivência de C. crescentus quando os danos oxidativos são gerados nas células por longos períodos. Similarmente, a expressão de σT aumenta em nível transcricional nesta bactéria sob condições de hiperosmolaridade induzidas por NaCl ou sacarose. Além de se auto-regular positivamente, σT controla a expressão de σU e σE , constituindo uma cascata de expressão de fatores sigma ECF em C. crescentus. σT, mas não σU e σE , desempenha um papel essencial na sobrevivência dessa bactéria durante a exposição ao NaCl e sacarose. Adicionalmente, a ausência de σT resulta numa sensibilidade aumentada dessa bactéria ao H2O2, apesar de não ser observada indução da expressão dos genes sigT, sigU e sigE durante essa condição de estresse. Diante do exposto, o presente trabalho contribuiu para a compreensão de dois mecanismos de adaptação da bactéria C. crescentus aos estresses oxidativo ou osmótico / Caulobacter crescentus is among the bacteria whose genomes encode a high number of ECF sigma factors, which are involved in the transcriptional regulation of a limited set of genes in response to several environmental signals. In the present work, two ECF sigma factors from C. crescentus, σR e σT, were functionally characterized. Data showed that σR e σT are maintained in reduced expression levels under physiological growth conditions, due to the action of ChrR and CC3476, respectively. However, during C. crescentus exposure to cadmium, organic hydroperoxide, singlet oxygen and UVA irradiation, σR expression is positively auto-regulated. Transcriptome analyses showed that σR regulates the expression of genes involved in protecting cells against oxidative damages. Central to this transcriptional response is the inactivation of ChrR, with residues C186 and C188 of this protein being necessary for sensing cadmium but not organic hydroperoxide or singlet oxygen. In addition, data revealed that sigR and two other σR-dependent genes (cfaS and CC2258) are essential for C. crescentus survival when oxidative damages are generated in the cells for long periods of time. Similarly, σT expression increases at a transcriptional level in this bacterium under hyperosmotic conditions induced by NaCl or sucrose. Besides being positively auto-regulated, σT independently controls the expression of σU and σE, forming an expression cascade of ECF sigma factors in C. crescentus. σT, but not σU or σE, displays an essential role in C. crescentus survival during NaCl or sucrose exposure. Additionally, the absence of σT leads to an increased sensitivity of this bacterium to H2O2, despite the absence of induction in sigT, sigU or sigE expression under the same stress condition. Therefore, the present work has contributed to the understanding of two mechanisms of C. crescentus adaptation to oxidative and osmotic stresses

The transcription factor NFAT5/TonEBP belongs to the Rel family, which also comprises NF ÛB and NFATc proteins. NFAT5 only shares structural and functional homology with other Rel family members at the level of the DNA binding domain, and differs from them considerably in other regions. NFAT5 enables mammalian cells to adapt to and withstand hypertonicity by orchestrating an osmoprotective gene expression program whose products include chaperones as well as ransporters and enzymes that increase the intracellular concentration of compatible osmolytes. NFAT5-null mice suffer severe embryonic and perinatal lethality, and surviving adults manifest growth defects, pronounced renal atrophy and lymphocyte dysfunction associated with ineffective responses to hypertonicity. To circumvent the lethality of these mice and study the function of NFAT5 in specific cell types without the possible side effects of generalized defects in the organism, we have produced conditional knockout mice that allow the deletion of NFAT5 in specific cell types. Here we have investigated the hypertonic stress response in wild-type and NFAT5-/- lymphocytes. Proliferating lymphocytes exposed to hypertonic conditions exhibited an early, NFAT5- independent, genotoxic stress-like response with induction of p53, p21 and GADD45, downregulation of cyclins E1, A2 and B1 mRNA, and arrest in S and G2/M. This was followed by an NFAT5-dependent adaptive phase in wild-type cells, which induced osmoprotective gene products, downregulated stress markers, and resumed cyclin expression and cell cycle progression. NFAT5-/- cells, however, failed to induce osmoprotective genes and though they downregulated genotoxic stress markers, they displayed defective cell cycle progression associated with reduced expression of cyclins E1, A2, B1, and aurora B kinase. Finally, T cell receptor-induced expression of cyclins, aurora B kinase, and cell cycle progression were inhibited in NFAT5-/- lymphocytes exposed to hypertonicity levels in the range reported in plasma in patients and animal models of osmoregulatory disorders. Our results support the conclusion that the activation of an osmoprotective gene expression program by NFAT5 enables cells to proliferate under hypertonic stress conditions by maintaining the expression of S and G2/M cyclins and cell cycle progression.

Chez les plantes supérieures, la distribution des sucres entre organes sources et puits requiert l'activité de transporteurs membranaires de sucre. Les flux de sucre variant au cours du développement de la plante et en réponse à des stress, il est logique de penser que les transporteurs de sucres sont impliqués dans ces changements. Le but du travail était de suivre la répartition des sucres et l'expression des transporteurs correspondants dans les racines de la plante modèle Arabidopsis thaliana, en réponse à un stress osmotique. Afin de pouvoir récolter des racines, un système de culture en hydroponie a été mis en place. Après avoir vérifié l'homogénéité des plantes cultivées dans ce système, une étude de l'expression des gènes de transporteurs de sucre a été effectuée au cours du développement des plantes et de d'une journée (24h), en utilisant la technique de macroarray. Cette étude a révélé l'expression dans les racines de 3 transporteurs de saccharose (AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5), 2 transporteurs de polyols (AtPLT5 et AtPLT6) et 2 transporteurs d'hexoses (AtSTP7 et AtSTP13). Le suivi de la teneur en sucres solubles et en amidon ainsi que du transport à longue distance de [U-14C]-saccharose a permis d'émettre des hypothèses quant au rôle des transporteurs de sucres exprimés dans la racine. Afin de mimer un stress hydrique en hydroponie, un protocole d'application progressif d'un agent osmotique (polyéthylène glycol 6000) dans le milieu de culture a été élaboré. Ce système a permis de mettre en évidence que 5 des gènes de transporteurs de sucre identifiés dans la racine ont une expression qui varie dans ces conditions. Trois d'entre eux sont fortement réprimés : AtSUC1 / In plants, sugar allocation between source and sink organs is based on the activity of membrane transporters for sugars. As sugar fluxes are changing during development and in response to stress, sugar transporters are supposed to be involved in those changes. The aim of this work was to study sugar allocation and the corresponding transporters gene expression in the roots of the model plant Arabidopsis thaliana during an osmotic stress. In order to have access to the roots, an hydroponic culture system was developped. The homogeneity of the plants obtained with this system was checked and the expression of sugar tranporter genes was followed during development and during a 24h period was studied by a macro-array technique. The expression in the roots of the following genes was found: 3 sucrose transporters (AtSUC1, AtSUC2 and AtSUC5), 2 polyol transporters (AtPLT5 and AtPLT6) and 2 hexose transporters (AtSTP7 and AtSTP13). The sugar and starch content and the long distance of 14C-sucrose were measured and used to build some hypothesis on the role of sugar transporters in the roots. To mimick a water stress, an osmotic stress due to the progressive addition of Polyethylene-glycol was applied. This system demonstrated that 5 of the identified transporter genes display a change in expression: 3 are repressed (AtSUC1, AtSUC5 and AtPLT6) and 2 are over expressed (AtSUC2 and AtSTP13). Moreover, soluble sugar and starch accumulate in the leaves and 14C-sucrose transport to the roots is decreased in plants subjected to an osmotic stress. The respective role of transporters is discussed. The gene expression data were also confirmed with plants grown in rhizoboxes.

Les plantes sont de plus en plus confrontées à une diminution de la disponibilité en eau du sol, constituant une contrainte hydrique et osmotique impactant leur survie. La tolérance des plantes face à cette contrainte sera conditionnée par la perception de celle-ci. Un des mécanismes de signalisation de cette contrainte est appelé MultiStep Phosphorelay (MSP) et est composé de 3 partenaires : un récepteur Histidine-aspartate Kinase (HK), des protéines Histidine Phosphotransfert (HPt) et des Régulateurs de Réponse (RR), dont les facteurs de transcription RR-B. Chez Arabidopsis, un MSP constitué d’AHK1, AHP2 et ARR18 a été identifié dans le cadre de la contrainte osmotique. Pour le peuplier, HK1a et b, gènes paralogues et homologues à AHK1, ainsi que 10 et 9 gènes codant respectivement des HPt et des RR-B ont été isolés. La fonction d’osmosenseur d’HK1a a été avancée, et une voie de signalisation de la contrainte osmotique chez le peuplier constituée de ce récepteur, 3 HPt et 6 RR-B a été proposée. L’objectif de la thèse visait à déterminer et caractériser des facteurs de transcription RR-B liés à la contrainte osmotique de façon spécifique. Les résultats phares de cette thèse sont la mise en évidence de la fonction de facteur de transcription de deux RR-B, RR13 et RR19, via l’étude de leur capacité à dimériser et à transactiver ou non des gènes de réponses à la contrainte osmotique. Le RR13 semblerait spécifique de la voie cytokinines et le RR19 de la voie osmosensing. Ce travail étaye fortement l’implication du RR19 dans le MSP dédié à cette contrainte. De nombreuses études ont par ailleurs été initiées durant ce travail de thèse et pourront faciliter la caractérisation du MSP étudié. / Plants are increasingly faced with a decrease in soil’s water availability, leading to a hydric and osmotic stress and impacting on their survival. Plant tolerance to this stress will be dependent on its perception. One of the signaling mechanisms related to this stress is called MultiStep Phosphorelay (MSP) and is composed by 3 partners: a histidine-aspartate receptor kinase (HK), histidine phosphotransfer proteins (HPt) and response regulators (RR), including the B-type RR transcription factors. In Arabidopsis, an MSP with AHK1, AHP2 and ARR18 has been identified for osmotic stress signaling. For poplar, HK1a and b, paralogous genes and homologous with AHK1, 10 HPt and 9 B-type RR genes have been isolated respectively. The osmosensor function of HK1a was proposed, and an osmosensing signaling pathway composed by HK1a, 3 HPt proteins, and 6 B-type RR has been suggested. The purpose of this work was focused on the identification and characterization of B-type RR transcription factors specifically linked to osmotic stress in poplar. The main results of this work are the highlight of the transcription factor function of two B-type RR, RR13 and RR19, through the study of their ability to dimerize and transactivate or not osmotic stress-responsive genes. The RR13 seems to be specific for cytokinins signaling pathway, whereas the RR19 seems to be specific for the osmosensing one. This work strongly supports the involvement of RR19 in the osmosensing MSP. Many studies have also been initiated during this work and will facilitate the characterization of the studied MSP.

Current agriculture is facing a serious challenge of decreasing precipitation and irregular occurrence of drought periods including their unfavorable distribution during the vegetation season. This leads to growing interest in planting highly drought-resistant crops like sorghum. In comparison with other crops, sorghum excels in low water demand, though exhibits high susceptibility to low temperatures, which hampers its spread to new regions. Surprisingly, there is not enough information about the nature of sorghum's reaction to cold exposure. The aim of this diploma thesis was to describe reactions of young sorghum plants exposed to cold stress, low water availability and their combination and to verify the possibility of plant hardening through previous low-stress load. The special focus was paid to changes in carbohydrate metabolism, which plays generally very important role in plant defense reactions. The other analyzed physiological traits were leaf tissue osmotic potential, proline content and basic morphometric characteristics. Experimental design consisted of pot experiments conducted in growth chambers and the experiments performed under controlled conditions in vitro, using two sorghum genotypes "Ruzrok" and "01Z1800012". Both genotypes exhibited similar response to stress treatment....