L’ostéoporose touche principalement les femmes après la ménopause, c’est une maladie caractérisée par une détérioration de la minéralisation et de la micro-architecture de l’os. L’objectif du travail de thèse présenté ici est d’identifier une fraction protéique laitière ayant un effet stimulant sur la formation osseuse. Une telle fraction, ajoutée dans un produit ou un complément alimentaire, pourrait contribuer à réduire la perte osseuse. La première étape du projet consiste à produire les fractions laitières. Des protéines laitières (caséine ou protéines sériques) ont été digérées par des enzymes puis filtrées pour les fractionner selon leur poids moléculaire. Les fractions obtenues ont ensuite été testées sur des cultures primaires de cellules osseuses. Certaines fractions protéiques laitières ont augmenté la prolifération et la différenciation des ostéoblastes. Parmi ces fractions actives, la fraction correspondant au rétentat d’une filtration sur un filtre à 10kDa d’un hydrolysat de caséine par de la chymotrypsine a été sélectionnée pour être testée sur animaux. Cette fraction a été nommée fraction CR10. Pour étudier l’activité du CR10 in vivo sur le métabolisme osseux, un modèle de souris sous restriction protéique est mis au point. Nos études démontrent que, lorsque le régime est basé sur des protéines de soja, le passage d’un régime contenant 20% de protéines à un régime contenant 6% de protéines induit une réduction de la formation osseuse. Le traitement des souris sous restriction protéique avec du CR10 n’a eu aucun effet, ce qui signifie que le CR10 n’arrive pas à exercer son activité anabolique in vivo. En revanche, si de la caséine est donnée à la place du soja ou si de la PTH est injectée aux souris, la formation osseuse est augmentée. Ces résultats suggèrent que la fraction CR10 n’est pas un bon candidat comme fraction anabolique. En revanche, l’effet positif de la caséine par rapport au soja pourrait être exploité lors de futures études visant à mettre au point une fraction caséique ostéoanabolique. / Osteoporosis is a disease mainly affecting women after menopause, characterized by a reduced bone mineralization and a deterioration of bone micro-architecture. The aim of this thesis is to identify a milk protein fraction able to stimulate bone formation. When added to a food product, this fraction could reduce bone loss. The first task of this project was to produce the milk protein fractions. Milk proteins (casein or whey proteins) were digested by enzymes and fractionated by filtration according to their molecular weight. The fractions obtained were then tested on primary cultures of bone cells. Some of the milk protein fractions tested were able to increase proliferation and differentiation of osteoblasts. Among these active fractions, the one obtained by digestion of casein by chymotrypsin followed by filtration through a 10 kDa filter have been selected to be tested on animals. This fraction is named CR10. To study the activity of CR10 in vivo, a protein-restricted mouse model has been developed. Our studies showed that a reduction of protein in the diet from 20% to 6% impaired bone formation when the diet was based on soy protein. When these protein-restricted mice ingested the CR10 fraction, no improvement of the BMD was reported, which means that the CR10 cannot exert its anabolic activity in vivo. However, if casein is given instead of soy or if PTH is injected to the mice, bone formation is increased. These results suggest that the CR10 is not a good candidate as an anabolic fraction. However, the positive effect of casein compared to soy could be exploited in future studies aimed at finding an osteoanabolic casein fraction.

La neurofibromatose de type 1 (NF1) représente la maladie génétique autosomale dominante la plus fréquente en France, après la mucovisidose, avec une incidence de 1 individu sur 3500. Il s'agit d'une pathologie multi-systémique présentant un tableau clinique varié. Parmi la pléthore de symptôme, sont comptées des manifestations neurocutanées telles que les taches « café-au-lait » (zone d'hyperpigmentation localisée) et les neurofibromes (tumeurs bénignes de la gaine périphérique de la myéline) mais également des défauts osseux et des troubles cognitifs. La pénétrance de NF1 est complète mais la manifestation et la sévérité des symptômes peuvent varier d'un individu à l'autre. Le gène NF1 responsable de la maladie, localisé sur le chromosome 17, est un gène suppresseur de tumeur qui code pour la neurofibromine. Dans le but de développer un modèle cellulaire humain pertinent pour l'étude des défauts osseux associés à NF1, nous avons utilisé des cellules souches induites à la pluripotence porteuse de la mutation causale NF1 (hiPS-NF1). Dans ces travaux, nous avons montré qu'une perte d'expression de la neurofibromine dans les ostéoblastes dérivés de hiPS-NF1 reproduisait le phénotype d'ostéogénèse réduite et qu'il était possible d'améliorer la capacité des hiPS-NF1 à se différencier en ostéoblaste à l'aide de molécules pharmacologiques. Toujours dans le but de proposer un modèle cellulaire humain le plus relevant possible, nous avons développé des lignées isogéniques avec la technologie CRISPR/Cas 9 afin d'étudier l'impact d'une perte partielle ou totale de l'expression de la neurofibromine sur le phénotype osseux. En parallèle, afin de pouvoir étudier un autre phénotype associé à NF1, un protocole de différenciation de cellules de Schwann sous culture définie en utilisant des facteurs de croissance et des molécules de signalisation, a partir des hiPS a été développé. Des cellules de Schwann-like ont été obtenues en 30 jours en engagement la différenciation des cellules souches vers la crête neurale afin d'induire l'émergence de précurseurs de cellules de Schwann par l'action de molécules telles que le récepteur de type I du TGF-ß (SB431542), l'hereguline ß1, l'IGF1, le FGF2 et un activateur de WNT3a (CHIR99021). L'analyse par q-PCR montre une augmentation des marqueurs de différents stades de différenciation de la cellule de Schwann : crête neurale (SOX10, ERBB3), cellules de Schwann précurseurs (MPZ, CAD19) et cellules de Schwann immatures (S100) au bout de 30 jours de différenciation. Ces résultats ont été complétés par l'analyse protéique des cellules différenciées et par la mise en co-culture de ces cellules avec des motoneurones différenciés à partir d'hiPS. L'ensemble de ce travail a permis de valider la pertinence de l'utilisation des cellules souches pluripotentes porteuses de mutation dans la modélisation de pathologie génétique. Permettant à plus long terme la recherche de molécules actives par des approches de de criblage pharmacologique ou par des approches de thérapie cellulaire. / Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal genetic disease with an incidence of 1 in 3,500 individuals. This is a multi-systemic disorder with a plethora of various symptoms. Among with we find neurocutaneous manifestations such as "café-au-lait" spots (zone of localized hyperpigmentation) and neurofibromas (benign tumors of the peripheral sheath of myelin), but also bone defects and cognitive disorders. The penetrance of NF1 is complete but the manifestation and severity of symptoms may vary from one individual to another. The NF1 gene responsible for the disease, located on chromosome 17, is a tumor suppressor gene that encodes neurofibromin. In order to develop a relevant human cellular model for the study of bone defects associated with NF1, we used pluripotency-induced stem cells that carry the NF1 causal mutation (hiPS-NF1). In this work, we have shown that loss of neurofibromin expression in osteoblasts derived from hiPS-NF1 reproduces the reduced osteogenesis phenotype. We have also shown that pharmacological molecules can improve the ability of hiPS-NF1 to differentiate in osteoblast. In order to propose the most relevant human cell model, we have developed isogenic lines with CRISPR / Cas 9 technology to study the impact of a partial or total loss of neurofibromin on the bone phenotype. Simultaneously, a Schwann cells differentiation protocol from hiPS was developed under culture defined using growth factors and signaling molecules. Schwann-like cells were obtained in 30 days by the use of molecules such as the type I receptor TGF-β (SB431542), heregulin β1, IGF1, FGF2 and activator of WNT3a (CHIR99021). The q-PCR analysis shows an increase in Schwann cell markers: neural crest (SOX10, ERBB3), precursor Schwann cells (MPZ, CAD19) and immature Schwann cells (S100). These results were confirmed by protein analysis of the differentiated cells and by the co-culture analysis of these cells with differentiated motoneurons from hiPS. All of this work validated the relevance of pluripotent stem cells in the modeling of genetic pathology.

Les progrès dans la compréhension de la biologie osseuse ont permis d’identifier le rôle du système nerveux sensoriel dans la formation osseuse, le remodelage et la régénération tissulaire. Cependant, le rôle précis du système nerveux sensoriel sur la l’ostéogénèse reste encore méconnu. La première partie de ce travail a été d’analyser le rôle des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) sur la différenciation ostéoblastique des cellules souches mésenchymateuse (MSCs). Pour répondre à cette question, nous avons utilisé une plate-forme microfluidique, qui tente de mimer l’innervation sensorielle du tissu osseux. Dans la seconde partie de cette étude, nous avons cherché à mieux caractériser la sous-population de neurones DRG impliqués dans la régulation directe de la différenciation des MSCs vers le lignage ostéoblastique. En conclusion, l’ensemble des résultats permettent de montrer que: i) les neurones sensoriels ont un effet positif et direct sur la différenciation ostéoblastique des cellules ostéoprogénitrices, ii) la voie de signalisation Wnt/β-caténine est impliquée dans cette transduction du signal; iii) cet effet est principalement régulé par des neurones sensorimoteur, iv) qui peuvent induire la libération locale de facteurs neuroactifs. / Advances in the understanding of bone biology have identified the sensory nervous system as a critical regulator in the orchestration of bone formation, remodeling, and repair. However, the precise role of the sensory nervous system on bone tissue, particularly on osteoprogenitor cells, remains unknown. Firstly, we were interested in clarifying whether dorsal root ganglion (DRG) neurons would be able to induce the osteoblast differentiation by acting directly on mesenchymal stem cells (MSCs). Afterwards, we attempted to understand whether the canonical Wnt signaling pathway could be implicated in the DRG neurons-induced osteoblastogenesis. In the second part of this study, we aimed at better characterizing the subset of DRG neurons involved in the direct regulation of osteoblast differentiation from MSCs. In this work we provide several novel insights: i) we show that sensory neurons have a positive and direct effect on osteoblast differentiation of osteoprogenitor cells, ii) by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway; and iii) we suggest that this effect is mainly regulated by sensorimotor neurons, iv) which possibly mediate the local release of neuroactive factors.

Les études cliniques et in vitro suggèrent que la sclérose de l’os sous-chondral due aux ostéoblastes (Ob) anormaux est impliquée dans la progression de l’ostéoarthrose (OA). Les Ob OA humains isolés à partir d’os sous-chondral sclérosé montrent un phénotype altéré, un niveau réduit de signalisation Wnt/β-caténine canonique et une minéralisation in vitro réduite. Il existe également deux voies non-canoniques, Wnt/PKC et Wnt/PCP qui ont étés décrites dans la littérature. Cependant, il n’existe aucune étude qui traite de ces deux voies dans les Ob OA. Ces voies sont activées après qu’un ligand Wnt non-canonique tel que Wnt-5a se lie à un récepteur Wnt couplé à des corécepteurs de la voie non-canonique. Ceci enclenche, respectivement pour la voie Wnt/PKC-Ca2+ et Wnt/PCP, la phosphorylation de PKC (p-PKC) et la phosphorylation de JNK (p-JNK) et agit sur les cibles en aval. Nous avons voulu déterminer s’il était possible de constater des altérations dans les voies Wnt non-canoniques dans les Ob OA. Nous avons préparé des cultures primaires d’ostéoblastes sous-chondral humains à partir de plateaux tibiaux de patients OA subissant une arthroplastie totale du genou, ainsi qu’à partir de plateaux tibiaux recueillis à l’autopsie de patients « normaux ». L’expression des gènes impliqués dans les voies Wnt/PKC et Wnt/PCP a été évaluée par RT-qPCR et la production par Western Blot des protéines, ainsi que celle de p-PKC et p-JNK et que l’activité des facteurs NFAT et AP-1 utilisés par ces deux voies. L’activité phosphatase alcaline (ALPase) et la quantité d’ostéocalcine (OC) ont étés évaluées respectivement à l’aide d’hydrolyse de substrat et d’ELISA. Le niveau de minéralisation a été évalué par la coloration au rouge Alizarine. Nos résultats montrent que l’expression et la production de Wnt-5a étaient augmentées dans les Ob OA comparées aux Ob N et LGR5 était significativement plus élevée. De plus, l’expression de LGR5 est directement régulée via la stimulation ou la diminution de Wnt-5a, à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. Par ailleurs, Wnt-5a a stimulé la phosphorylation de JNK et de PKC ainsi que l’activité NFAT et AP-1. Les niveaux de minéralisation ainsi que d’activité ALPase et de sécrétion d’OC ont aussi été affectés par les changements du niveau de Wnt-5a. Ces résultats suggèrent que Wnt-5a, qui est augmentée dans les OA Ob, peut stimuler les voies Wnt non-canoniques et affecter le phénotype et la minéralisation des OA Ob humains. / Clinical and in vitro studies suggest that subchondral bone sclerosis due to abnormal osteoblasts (Ob) is involved in the progression and/or onset of osteoarthritis (OA). Human Ob isolated from sclerotic subchondral OA bone tissue show an altered phenotype, a decreased canonical Wnt/ß-catenin signaling pathway (cWnt), and a reduced mineralization in vitro. Besides the cWnt pathway, at least two non-canonical signaling pathways, the Wnt/PKC and Wnt/PCP pathway have been described. These pathways are activated when a non-canonical Wnt ligand like Wnt-5a binds to a Wnt receptor coupled with non-canonical co-receptors. This activates, respectively for Wnt/PKC-Ca2+ and Wnt/PCP, the phosphorylation of PKC (pPKC) and the phosphorylation of JNK (pJNK) and their effect on downstream targets. However, there are no reports of either pathway in OA Ob. Here, we studied if alterations of the non-canonical pathways could be observed in OA Ob. We prepared primary human subchondral Ob using the tibial plateaus of OA patients undergoing total knee arthroplasty, or from tibial plateaus of normal individuals at autopsy. The expression of genes involved in Wnt/PKC and Wnt/PCP was evaluated by RT-qPCR and their protein production by Western blot analysis, in addition to p-PKC and p-PCP and NFAT and AP-1 activity with luciferase. Alkaline phosphatase activity and osteocalcin levels were evaluated respectively by substrate hydrolysis and ELISA respectively, and mineralization levels were evaluated with Alizarin red staining. OA Ob showed an increased alkaline phosphatase activity and osteocalcin release. The expression of Wnt5a was increased in OA Ob compared to normal. The expression of LGR5 was significantly increased in these cells. Moreover, the expression and production of LGR5 is directly modulated via the stimulation or inhibition of Wnt5a. However, Wnt5a did not stimulate the expression of LGR4. Wnt5a increased the phosphorylation of PKC and JNK as well as NFAT and AP-1 activity. Mineralization levels as well as alkaline phosphatase activity and osteocalcin secretion levels were also linked with changes in Wnt-5a levels. These data indicate that Wnt5a, which is increased in OA Ob, can directly stimulate the Wnt/PKC and Wnt/PCP pathways and this can affect the phenotype and mineralization observed in human OA Ob.

Les protéoglycanes (PGs) sont des protéines présentes au niveau de la matrice extracellulaire et à la surface des cellules. Ils sont constitués d’une protéine sur laquelle sont attachées des chaînes de glycosaminoglycanes. Ils jouent un rôle essentiel dans plusieurs processus biologiques. Des mutations au niveau des gènes codant pour la protéine porteuse ou les enzymes impliquées dans la biosynthèse des GAGs sont associées à plusieurs syndromes et pathologies chez l’homme. L’initiation de la synthèse des GAGs est catalysée par la xylosyltransférase I (XT-I). La XT-I joue un rôle clé dans la régulation de la synthèse des PGs au niveau du cartilage et il a été montré récemment que les mutations hypomorphiques de la XT-I sont associées au syndrome du Desbuquois de type II (DBQD2) caractérisé par des anomalies squelettiques (ostéochondrodysplasie). Afin d’élucider le rôle de la XT-I dans le développement ostéoarticulaire, nous avons généré une souris transgénique conditionnelle Col2α1-CreERTM ;XylT1flox/flox permettant l’invalidation de la XT-I au niveau du cartilage. De façon intéressante, l’invalidation de la XT-I induit des anomalies du développement ostéoarticulaire caractérisées par un nanisme important et des défauts des éléments squelettiques. Des études histologiques et la microscopie SHG (génération de seconde harmonique) de la plaque de croissance ont permis de montrer l’importante de la XT-I dans la formation de la matrice extracellulaire (MEC), la fibrillation du collagène II, la maturation des chondrocytes et leur organisation en colonne dans la plaque de croissance. L’analyse des mécanismes moléculaires impliqués indique la perturbation de la voie de signalisation du TGF-β dans la plaque de croissance. D’autre part, des études histomorphométriques et histologiques des os ont révélé que la déficience en XT-I entraîne une accélération du processus d’ossification avec une stimulation de l’activité des ostéoclastes au niveau de l’os spongieux conduisant à une résorption osseuse importante et à une ossification accrue de l’os cortical. Ces travaux ont permis de révéler le rôle de la XT-I dans le développement ostéoarticulaire et dans le maintien de l’homéostasie du cartilage et du tissu osseux et ont mis en évidence le rôle de la voie du TGF-β dans les anomalies du développement. Ces travaux ouvrent également la voie pour le développement de thérapeutiques potentielles pour le traitement des patients atteints du syndrome de Desbuquois type II / Proteoglycans (PGs) are proteins present in the extracellular matrix and on the surface of cells. They consist of a protein to which chains of glycosaminoglycans (GAGs) are attached. PGs play an essential role in many biological processes and in the homeostasis of different tissues including cartilage, bone and skin. Mutations in the genes encoding PG core proteins or the enzymes involved in GAG biosynthesis are associated with several syndromes and pathologies in human. Initiation of GAG synthesis is catalyzed by xylosyltransferase I (XT-I). XT-I plays a key role in the regulation of the synthesis of PGs in cartilage and it has been shown recently that hypomorphic mutations of XT-I are associated with the Desbuquois syndrome type II (DBQD2), characterized by skeletal abnormalities (osteochondrodysplasia). To elucidate the role of XT-I in skeletal development, we generated a conditional transgenic mouse, Col2α1-CreERTM; XylT1flox/flox allowing the invalidation of XT-I gene in the cartilage. Interestingly, the invalidation of XT-I induces skeletal developmental abnormalities characterized by significant dwarfism, and defects in many skeletal elements. Histological studies and SHG microscopy (second harmonic generation) of the growth plate showed the importance of XT-I in extracellular matrix formation, fibrillation of collagen type II, maturation of chondrocytes and their organization in column in the growth plate. The analysis of the molecular mechanisms involved indicates the disruption of the TGF-β signaling pathway in the growth plate. On the other hand, histomorphometric and histological studies of the bones revealed that the XT-I deficiency causes an acceleration of the ossification process with a stimulation of the osteoclasts activity in spongy bone leading to bone resorption, and increased ossification of the cortical bone. This work revealed the role of XT-I in skeletal development and in the maintenance of cartilage and bone homeostasis and highlighted the role of the TGF-β pathway in developmental abnormalities. This work also paves the way for the development of potential therapeutics for the treatment of patients with Desbuquois syndrome type II

Les mécanismes par lesquels les charges mécaniques et électriques agissent sur le tissu osseux dans son ensemble, et sur les ostéoblastes, en particulier, sont encore mal compris. La réponse des ostéoblastes soumis à un seul type de stimulus physique a été comparée à celle obtenue par des combinaisons de plusieurs signaux mécaniques et/ou électriques. Dans la perspective d'améliorer l'ostéointégration des biomatériaux, nos études ont porté principalement sur les deux composants essentiels pour le succès de la greffe d'un biomatériau : la matrice extracellulaire (MEC) qui sert d'interface entre le biomatériau et l'hôte ainsi que les facteurs angiogéniques. Nous avons étudié les réponses des ostéoblastes à des contraintes mécaniques complexes basées sur des signaux de " basse amplitude haute fréquence " (BAHF) appliquées à un modèle de culture 3D (hydroxyapatite macroporeux). Nous montrons donc qu'une stimulation mécanique simple (3Hz) peut être potentialisée par des BAHF appropriées (25 Hz). Un dispositif a été développé pour appliquer des contraintes mécaniques très BAHF sur des modèles de culture 2D. La synthèse de la MEC est favorisée et ses propriétés ostéogéniques sont augmentées sous BAHF. Les BAHF n'ont pas d'effet sur le VEGF. Un autre dispositif a permis d'appliquer un champ électrique aux cultures cellulaires. Quelques paramètres nous indiquent que les cellules perçoivent le champ électrique, mais nous retenons que le VEGF n'est pas affecté. En revanche, la combinaison de ces stimulations physiques (contrainte mécanique très BAHF et champ électrique) augmente l'expression de plusieurs facteurs impliqués dans l'angiogénèse (VEGF, TGFβ1, FGF2...). Les sollicitations complexes définies dans cette thèse pourraient être un outil pour fonctionnaliser un substitut osseux cellularisé

Le syndrome d’Andersen est une maladie rare et associée à la perte de fonction du canal potassique Kir2.1. Afin d’étudier sa physiopathologie, nous avons généré et caractérisé des cellules souches pluripotentes induites (iPS) contrôle et Andersen. Nous avons ensuite différencié ces cellules iPS en cellules souches mésenchymateuse (MSC). Les cellules MSC de patients présentent une capacité de différenciation en ostéoblastes et en chondrocytes diminuée par rapport aux cellules contrôle. En effet, la production de matrice extracellulaire et l'expression des master gènes des différenciations osseuses et cartilagineuses, est réduite chez les patients. Ces travaux de thèse montrent que le canal Kir2.1 est essentiel au développement osseux. Les défauts de différentiation observés pourraient expliquer les dysmorphies associées avec le syndrome d’Andersen. / Andersen's syndrome is a rare disorder associated with a Kir2.1 potassium channel loss of fuction. To study the pathophysiology, we have generated and characterized induced Pluripotent Stem cells (iPS) from control and patient cells. We have then differentiated those iPS cells into mesenchymal stem cells (MSC). Patient's MSc have a lower osteoblastic and chondrogenic differnciation ability compared to control cells. Indeed, extracellular matrix production and master gene expression of osteoblastic and chondrogenic differenciation are reduced in patient’s cells. Alltogether, these results shown that Kir2.1 channel is required for bone developement. The differenciation defects saw in patient cells could explain the Andersen's syndrome associated dysmorphies.

La maladie osseuse est une complication sévère pour les patients atteints de mucoviscidose (Cystic Fibrosis, CF). Les fractures vertébrales et costales impactent les capacités pulmonaires et la clairance du mucus bronchique. La meilleure prise en charge des symptômes des patients CF a permis l’amélioration de leurs qualité et espérance de vie. Cependant malgré l’optimisation de facteurs impactant le métabolisme osseux aucune amélioration notable n’a été observée dans la fragilité osseuse. Plus de 80% des patients CF sont porteurs de la mutation F508del du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) sur au moins un allèle. L’implication directe de la mutation F508del dans la maladie osseuse a été montrée, bien que son rôle dans le dysfonctionnement du métabolisme osseux reste encore à élucider. Notre travail a permis de mettre en évidence que la mutation F508del portée par les ostéoblastes humains est responsable d’une dérégulation importante de la voie de signalisation RANK/RANKL/OPG aboutissant à un ratio RANKL/OPG élevé, potentiateur de l’ostéoclastogénèse et de la résorption osseuse. Nous avons également mis en évidence que le contexte inflammatoire chronique de la pathologie pourrait exacerber la perte osseuse, les cellules CF étant plus sensibles à ces stimulations. Par ailleurs, nous avons montré que l’utilisation de molécules pharmaceutiques comme des correcteurs et potentiateurs de CFTR, actuellement utilisés en essais cliniques, permettent une normalisation au moins partielle des dérégulations observées des ostéoblastes CF, et apparaissent comme des nouvelles stratégies thérapeutiques. / Bone disease is a serious complication for patients with Cystic Fibrosis (CF). Rib and vertebral fractures worsen lung function and mucus clearance. Better care of CF patient’s symptoms enable an improvement in life quality and expectancy. Despite optimization of factors impacting bone metabolism no improvement was observed in bone loss of patients with CF. More than 80% CF patients carried the F508del mutation on the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene on at least one allele. The role of the F508del mutation in the dysfunction of bone metabolism is yet unclear, but its involvement has been already shown in clinical studies and mouse models.Our work shown that F508del mutation on human osteoblasts causes a dysregulation in the RANK/RANK-L/OPG signalling leading to a high RANK-L to OPG ratio that may improve osteoclastogenesis, and thus the bone résorption. We also show that chronic inflammatory status of CF patients could exacerbate bone loss because of a high sensitivity of osteoblasts with the F508del-CFTR mutation. In addition, we demonstrate that the use of drugs as CFTR correctors and potentiators cause an improvement of the dysregulation observed and seems to be a promising therapeutic strategy.

L’exposition à l’uranium, qu’elle soit naturelle ou accidentelle, est un sujet de préoccupation de santé publique. Cet actinide est utilisé dans de nombreuses applications civiles ou de défenses. Il est également présent de façon naturelle dans l’eau de boisson et dans l’alimentation. Sa toxicité chimique cible en majorité le rein, organe de stockage à court terme, et les tissus squelettiques, où l’uranium est retenu pendant des années. L’uranium induisant une perte osseuse à long terme, il est susceptible d’affecter les cellules impliquées dans le processus de remodelage osseux : les ostéoclastes (OCs) qui résorbent la matrice osseuse, les ostéoblastes (OBs), qui la reconstitue via la minéralisation, et les ostéocytes (OSTs), les capteurs mécano-sensibles, orchestrant le cycle de remodelage. Par ailleurs, aucune thérapie de chélation (comme il en existe pour d’autres métaux lourds) n’est véritablement efficace pour diminuer l’exposition interne et éliminer cet actinide en cas de contamination à l’uranium. Dans l’optique de comprendre les mécanismes de toxicité mis en jeu sur les cellules osseuses, la première partie de cette thèse est ainsi consacrée à l’étude des effets moléculaires et fonctionnels d’une exposition aiguë et chronique à l’uranium sur une lignée ostéocytaire, les cellules MLO-A5. Nous avons d’abord montré que ces cellules présentent une IC50 plus élevée que les OCs et les OBs et qu'une exposition aiguë stimule le processus autophagique. Dans un second temps, nous avons analysé la réponse de ces cellules lors d’une exposition chronique à des concentrations sub-toxiques d’uranium, et observé une inhibition drastique de leur capacité de minéralisation, sans toutefois affecter leur viabilité.Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés aux effets d’un décorporant potentiel de l’uranium, le 3,4,3-LI(1,2-HOPO), sur les OBs et les OCs, dans le but de mettre au point une méthode de criblage de nouveaux décorporants. Les résultats ont montré que le 3,4,3-LI(1,2-HOPO) permet une restauration partielle des capacités de différenciation et de résorption des OCs exposés à l'uranium. Ces résultats permettront d’adapter cette méthode pour le criblage de futurs décorporants dans une démarche de valorisation. Ainsi, ces travaux ont permis d’accroître les connaissances de la toxicité chimique de l’uranium sur les cellules osseuses, et ont apporté de nouvelles données toxicologiques in vitro concernant les effets d’un agent décorporant, le 3,4,3-LI(1,2-HOPO), dans ces modèles cellulaires. / Natural or accidental uranium exposure is a health care concern. Uranium is a natural metal found in the environment and is both used for civil or military applications. It is also naturally present in food and water. It exhibits both a radiological and a chemical toxicity, the latter being considered largely predominant for natural uranium. Kidneys and bones are the main targeted organs of its toxicity. The skeleton is the storage organ of uranium and can be retained there for years, causing a long-term bone loss. Bone cells, osteoclasts cells in charge of bone resorption, osteoblasts involved in matrix production and mineralization, and osteocytes, considered the major orchestrators of bone remodeling, are therefore likely to exhibit impaired functions. Furthermore, current chelation therapy treatments failed to demonstrate a true decorporating efficiency after internal uranium contaminations.The first part of this study describes molecular and cellular effects of acute and chronic uranium exposure on a murine osteocytic cell line MLO-A5. Acute exposure enhanced their autophagic process and CI50 determination shows less toxicity on osteocytes than on osteoclasts and osteoblasts. Moreover, mineralization capacity of these cells was strongly inhibited after a chronic exposure without affecting cell viability. In a second part, we determined the in vitro effects of 3,4,3-LI(1,2-HOPO), a potential decorporating agent, on osteoclasts and osteoblasts with the intend to develop methods for decorporating agent screening. This molecule shows an ability to partly restore differentiation and resorption function of exposed osteoclasts to uranium. These results constitute a step forward in the development of screening methods to evaluate the potential of new decorporating agent.Taken together, these results enhanced our knowledge of uranium toxicity mechanisms on bone cells and brought new toxicological data regarding the use of 3,4,3-LI(1,2-HOPO) in our cellular models.

No description available.