O objetivo desse estudo foi investigar a participação de integrina &alpha;1&beta;1 e microRNAs (miRs) no potencial osteogênico de superfícies de titânio (Ti) com nanotopografia. Discos de Ti previamente polidos foram tratados quimicamente com H2SO4/H2O2 para obtenção de nanotopografia, que foi observada por microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo da participação da integrina &alpha;1&beta;1, células-tronco mesenquimais (CTMs) de ratos foram cultivadas em condições osteogênicas e não osteogênicas sobre superfícies de Ti com nanotopografia e sem tratamento químico (controle). O resultados mostraram que a nanotopografia de Ti aumentou a proliferação celular, a atividade de fosfatase alcalina (Alp) e regulou positivamente a expressão gênica de marcadores da diferenciação osteoblástica em CTMs cultivadas tanto em condições osteogênicas quanto em condições não osteogênicas. Além disso, uma maior expressão gênica para as integrinas &alpha;1 e &beta;1 foi observada em culturas crescidas sobre nanotopografia em condições não osteogênicas em relação ao Ti controle. O uso de obtustatina, um inibidor de integrina &alpha;1&beta;1, reduziu os efeitos da nanotopografia sobre os marcadores osteoblásticos, indicando a participação da via de sinalização dessa integrina nos efeitos da nanotopografia sobre CTMs. Para investigar a participação de miRs no efeito osseoindutor da nanotopografia de Ti, foram utilizadas CTMs humanas e células préosteoblásticas de camundongos da linhagem MC3T3-E1. A análise em larga escala da expressão de miRs revelou que 60 miRs foram regulados positivamente (no mínimo, 2x maior), enquanto 58 miRs foram regulados negativamente (no mínimo, 2x menor) em CTMs crescidas sobre a nanotopografia. Três desses miRs, miR-4448, -4708 e -4773, cuja expressão foi significativamente reduzida pela nanotopografia de Ti (no mínimo, 5x menor), afetaram a diferenciação osteoblástica de CTMs. Esses miRs atuam diretamente sobre SMAD1 e SMAD4, proteínas transdutoras da sinalização da proteína óssea morfogenética 2 (Bmp-2), conhecida por sua capacidade osseoindutora. Além disso, verificou-se que a sobreexpressão de miR-4448, -4708 e -4773 em células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 inibiu a expressão gênica e proteica de SMAD1 e SMAD4 e, consequentemente, a expressão gênica de marcadores ósseos. Esses dados sugerem a influência do circuito miR-SMAD-Bmp-2 sobre o efeito osseoindutor da nanotopografia. Conjuntamente, os achados do presente estudo mostraram que o efeito da nanotopografia de Ti sobre a diferenciação osteoblástica resulta de um mecanismo regulatório complexo, do qual fazem parte as vias de sinalização da integrina &alpha;1&beta;1 e da Bmp-2, com a participação de miRs. Esses resultados podem representar um avanço para o desenvolvimento de novas modificações de superfície, com o objetivo de acelerar e/ou melhorar o processo de osseointegração. / The aim of this study was to investigate the role of the &alpha;1&beta;1 integrin and microRNAs (miRs) on the osteogenic potential of titanium (Ti) with nanotopography. Polished Ti discs were chemically treated with H2SO4/H2O2 to generate nanotopography, which was observed under scanning electron microscopy. For the study related to the &alpha;1&beta;1 integrin, rat mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions on Ti with nanotopography and non-treated Ti discs (control). Nanotopography increased cell proliferation and alkaline phosphatase (Alp) activity and upregulated the gene expression of bone markers in cells cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions. Furthermore, the gene expression of &alpha;1 and &beta;1 integrins was higher in cells cultured on nanotopography under non-osteogenic conditions compared with control. Obtustatin, an inhibitor of &alpha;1&beta;1 integrin, reduced the higher gene expression of the bone markers induced by nanotopography. These results indicate that &alpha;1&beta;1 integrin signaling pathway determines the osteoinductive effect of nanotopography on MSCs. The role of miRs in the osteogenic potential of Ti with nanotopography was evaluated using human MSCs and MC3T3-E1 mouse pre-osteoblastic cells. The miR sequencing analysis revealed that 60 miRs were upregulated (> 2 fold), while 58 miRs were downregulated (< 2 fold) in MSCs grown on nanotopography. Three miRs, miR-4448, -4708 and -4773, which were significantly downregulated (< 5 fold) by nanotopography, affected the osteoblast differentiation of MSCs. These miRs directly target SMAD1 and SMAD4, both key transducers of the bone morphogenetic protein 2 (Bmp-2) osteogenic signal, which were upregulated by nanotopography. Overexpression of miR-4448 - 4708 and 4773 in MC3T3-E1 cells noticeably inhibited gene and protein expression of SMAD1 and SMAD4 and by targeting them, these miRs repressed gene expression of key bone markers. These results suggest that a miR-SMAD-Bmp-2 circuit acts in the Ti nanotopography-mediated osteoblast differentiation. Taken together, our data showed that the osteoblast differentiation induced by Ti with nanotopography is governed by a complex regulatory network involving a crosstalk between &alpha;1&beta;1 integrin and Bmp-2 signaling pathways with participation of miRs.

Na ossificação endocondral, osteoclastos (Oc) reabsorvem os remanescentes de cartilagem, e osteoblastos (Ob) depositam matriz óssea. Bisfosfonatos (Bps) inibem a ação dos Oc. Foi avaliado o efeito dos Bps alendronato (Aln) e etidronato (Etn) em joelhos de ratos jovens (in vivo) e na cultura primária de Oc (in vitro). O material in vivo foi analisado por MEV, MET e ML (morfologia e histoquímica para TRAP). RNA foi extraído para análise por RT-PRC e proteínas para análise por WB, que também foram extraídos após o tratamento da cultura com Bps. O tratamento com Etn revelou lâmina epifiseal desorganizada com extensa área de cartilagem; a MEV mostrou pouco osso trabecular com lacunas de reabsorção, que não foram observadas com Aln. O Aln revelou numerosos Oc TRAP-positivos latentes, confirmados por MET. In vivo os Bps diminuem a expressão dos genes analisados; In vitro o Aln diminui somente a expressão de Runx2, menos expresso com Etn, assim como Spp1. A expressão proteica variou entre os grupos. Aln é o mais potente em inibir os Oc enquanto o Etn atua sobre os Ob. / In endochondral ossification, clastic cells (Oc) resorb the calcified cartilage, while osteoblasts (Ob) form new bone. Bisphosphonates (Bps) inhibit the action of Oc. The effect of the Bps alendronate (Aln) and etidronate (Etn) on the knees of young rats (in vivo) and in primary cultures of Oc (in vitro) was evaluated. The specimens were analyzed by SEM, TEM, and LM or TRAP histochemistry. RNA was extracted to analysis by RT-PRC and protein to analysis by WB. RNA and protein were also extracted after the treatment of cultures with Bps. Rats treated with Etn exhibited a disorganized epiphyseal plate containing large area of cartilage; SEM showed few bone trabeculae with resorption lacunae, which were not observed in Aln specimens. Aln showed numerous latent Oc by TRAP histochemistry and TEM. In vivo, the Bps decreased the expression of all analyzed genes; in vitro, Aln decreased only the expression of Runx2 as well as SPP1, which expression was less with Etn. Protein expression varied among the groups. Aln is more potent for inhibiting the Oc, while Etn acts on Ob.

Apesar do grande potencial de regeneração do tecido ósseo, em algumas situações a extensão da lesão impede que o tecido se repare completamente. Como uma alternativa em relação aos tratamentos convencionais, a terapia celular tem sido considerada como promissora para o reparo de defeitos ósseos. No entanto, poucos estudos investigaram a terapia celular utilizando osteoblastos, portanto, avaliamos o efeito da injeção direta de osteoblastos na regeneração do tecido ósseo. Como os osteoblastos têm origens embrionárias diferentes, foi comparado in vitro o potencial osteogênico de osteoblastos derivados da crista neural, do mesoderma e de ambas as origens embrionárias. Considerando a necessidade de grande número de células para a terapia, foi comparado o efeito de uma subcultura, como meio de aumentar a quantidade de células, no potencial osteogênico dos osteoblastos. Para avaliação da regeneração dos defeitos, osteoblastos foram injetados diretamente nesses defeitos. Osteoblastos foram obtidos da calvária de ratos recém-nascidos (Wistar), sendo que os derivados da crista neural foram isolados dos ossos frontais (OB-CN); os do mesoderma isolados dos ossos parietais (OB-MS); e de ambas as origens embrionárias isolados de toda a calvária (OB-Cal). O efeito da subcultura no potencial osteogênico foi avaliado em OB-Cal ou na primeira passagem dessa cultura (OB-Cal P1). Após até 14 dias em cultura, foram avaliadas a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz extracelular mineralizada e a expressão dos genes marcadores osteoblásticos: fator de transcrição runt-related 2 (RUNX2), ALP, osteocalcina (OC) e sialoproteína óssea (BSP). Para avaliar a regeneração do tecido ósseo, foram criados defeitos de 5 mm de diâmetro na calvária de ratos Wistar, que após 2 semanas foram tratados com 5 x 106 osteoblastos derivados de OB-Cal P1, por meio de injeção local. Ao final de 4 semanas, a formação óssea foi avaliada por microtomografia computadorizada e análise histológica. Os dados foram comparados por ANOVA, seguido do teste de Student-Newman-Keuls, ou teste t, quando apropriado, considerando o nível de significância de 5%. A comparação do potencial osteogênico em relação à origem embrionária mostrou que, os OB-MS apresentaram maior proliferação mas não houve diferença entre as culturas no evento final da diferenciação osteoblástica, que é a formação de matriz mineralizada. No entanto, como as culturas de OB-Cal apresentaram maior expressão gênica de marcadores iniciais, intermediários e finais dessa diferenciação; e considerando que, essas culturas são aquelas nas quais é possível obter o maior número de células, optamos por utilizar essas culturas na avaliação da formação óssea induzida pela terapia celular. Além disso, os resultados mostraram que os OB-Cal P1 tem seu potencial osteogênico reduzido, mas considerando que a subcultura permite a obtenção de maior número de células, são uma boa escolha para a terapia celular. Tanto que, ao avaliar in vivo a capacidade regenerativa das OBCal P1 no reparo dos defeitos ósseos, as análises microtomográficas e histológicas mostraram que que a terapia celular com injeção local de osteoblastos obtidos de fragmentos ósseos da calvária constitui uma estratégia adequada para estimular o reparo ósseo / Despite of the great potential of regeneration of the bone tissue, in some situations the extension of the lesion prevents the tissue from repairing completely. As an alternative to conventional treatments, cell therapy has been considered a promising strategy for the repair of bone defects. However, few studies investigated cell therapy using osteoblasts, therefore, we evaluated the effect of direct injection of osteoblasts on the regeneration of bone tissue. Since osteoblasts have different embryonic origins, the osteogenic potential of osteoblasts derived from neural crest, mesoderm and both embryonic origins was compared in vitro. Considering the need for a large number of cells for the therapy, the effect of a subculture, a common way to increase the amount of cells, on the osteogenic potential was also compared. Then, osteoblasts were injected directly into bone defects to evaluate the regeneration of bone tissue. Osteoblasts were obtained from the calvaria of newborn rats (Wistar), the neural crest derivatives were isolated from the frontal bones (OB-CN); those of the mesoderm isolated from the parietal bones (OB-MS); and from both embryonic origins isolated from the entire calvaria (OB-Cal). The effect of the subculture on the osteogenic potential was evaluated in OB-Cal and in its firstpassage (OB-Cal P1). After up to 14 days, all cultures were assayed for cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized extracellular matrix formation and the expression of the osteoblastic marker genes: runtrelated transcription factor 2 (RUNX2), ALP, osteocalcin (OC) and bone sialoprotein (BSP). To evaluate the effect of cell injection on bone regeneration, defects of 5 mm diameter were created in the calvaria of Wistar rats, that after 2 weeks were injected with 5 x 106 OB-Cal P1-derived osteoblasts. Vehicle injections were used as control. At the end of 4 weeks, the bone formation was evaluated by computerized microtomography and histological analysis. Data were compared by ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls test, or ttest, when appropriate, and the level of significance was set at 5%. The comparison of the osteogenic potential related to the embryonic origin showed that the OB-MS presented a greater proliferation but there was no difference between the cultures in the final event of the osteoblastic differentiation, that is the formation of mineralized matrix. However, as OB-Cal cultures showed greater gene expression of initial, intermediate and final markers of this differentiation; and considering that these cultures are those in which it is possible to obtain the largest number of cells, we selected these cultures for evaluating the bone formation induced by the cell therapy. In addition, the results showed that OB-Cal P1 still holds its osteogenic potential and despite being lower than that of OB-Cal as the subculture allows obtaining more cells, it has been considered as a good choice for cell therapy. In agreement with this, OB-Cal P1-derived osteoblasts injected into the bone defects were capable of inducing more bone formation than control, as revealed by microtomographic and histological analyzes. Therefore, it supports the idea that cell therapy with local injection of osteoblasts obtained from calvarial bone fragments is an adequate strategy to stimulate bone formation

A crescente demanda clínica para regeneração óssea tem dirigido esforços significativos para o desenvolvimento de novos biomateriais, incluindo aqueles aplicados em terapias baseadas em engenharia de tecidos. Neste contexto, os biovidros são considerados uma boa alternativa mas as suas propriedades mecânicas têm limitado a sua aplicação. Para melhorar tais propriedades sem afetar a biocompatibilidade, um novo material vitrocerâmico bioativo do sistema P2O5-Na2O-CaO-SiO2, chamado Biosilicato® com duas fases cristalinas (BioS-2P) foi desenvolvido. No entanto, os efeitos da adição das fases cristalinas sobre o comportamento biológico do BioS-2P ainda não foram estudados. Assim, os objetivos deste estudo foram investigar a capacidade do BioS-2P em induzir, in vitro, a diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (CTMs); a capacidade do BioS-2P em aumentar, in vitro, a atividade dos osteoblastos em fase inicial de diferenciação (OBs) e osteoblastos da linhagem UMR-106 (UMRs); e a capacidade do BioS-2P em conduzir e induzir a neoformação óssea, in vivo, associado ou não a células. Células derivadas da medula óssea obtidas de fêmures de ratos foram cultivadas em meio de crescimento para obtenção de CTMs ou em meio osteogênico para obtenção de OBs. Essas células e UMRs foram cultivadas sobre discos de BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) e plástico de cultura (Controle) e utilizadas nas avaliações in vitro. Para as avaliações in vivo, defeitos de 5 mm criados em calotas de ratos foram implantados somente com arcabouços de BioS-2P ou com arcabouços de BioS-2P associados às CTMs ou aos OBs. Os dados foram comparados por teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Student Newman-Keuls, e o nível de significância adotado foi de 5%. As CTMs foram caracterizadas por apresentarem alta porcentagem de células expressando os marcadores de superfície CD29 e CD90 e baixa porcentagem expressando CD31, CD34, CD45 e CD106. A diferenciação osteoblástica das CTMs foi confirmada pela expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcriptor factor-2 (RUNX2), sialoproteína óssea (BSP) e osteocalcina (OC). CTMs cultivadas sobre discos de BioS-2P em meio não-osteogênico apresentaram diminuição da proliferação e aumento da atividade de ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica ALP, RUNX2, osterix (OSX), proteína óssea morfogenética-4 (BMP-4), osteopontina (OPN) e OC, comprovando seu potencial osteoindutor similar ao 45S5. O BioS-2P foi capaz de aumentar a atividade de OBs e UMRs de maneira similar àqueles cultivados sobre o 45S5. OBs apresentaram diminuição na proliferação e aumento da atividade da ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica RUNX2, OSX, BMP-4, OPN e OC. A análise em larga escala da expressão de mais de 23.000 genes mostrou que o BioS-2P induziu a sobre-expressão de genes envolvidos no aumento da atividade osteoblástica e a repressão de genes envolvidos na diminuição dessa atividade, em comparação com o Controle. Ao menos em parte, esse aumento da atividade osteoblástica foi atribuído à modulação das vias de sinalização proteíno-quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e Wnt Canônica, e à modulação da expressão de microRNAs. UMRs crescidos sobre o BioS-2P corroboraram esses achados, pela capacidade em formar matriz mineralizada e por apresentarem aumento na expressão das proteínas ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) e OPN. Arcabouços de BioS-2P (5 mm de diâmetro e 2 mm de altura com porosidade de 76 ± 5% e com tamanhos de poros variando entre 100 e 800 &micro;m) implantados em defeitos na calota de ratos estimularam a formação de tecido ósseo, que ocorreu tanto na periferia como no interior dos defeitos e em íntimo contato com o material. A morfometria por microtomografia computadorizada não evidenciou qualquer diferença entre os parâmetros volume ósseo, volume ósseo/volume total, superfície óssea, superfície/volume ósseo, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, avaliados na 4a, 8a e 12a semanas de implantação. As CTMs e os OBs foram carreados para os arcabouços de BioS- 2P (com eficiência de 90% e 81%, respectivamente) e essas células permaneceram nos defeitos por 14 dias. A combinação de arcabouços de BioS-2P com CTMs ou OBs, implantados por 8 semanas, resultou no mesmo padrão de formação óssea daquele observado para o arcabouço sem células. No entanto, essa combinação não resultou em aumento na quantidade de osso formado. Os resultados evidenciaram a capacidade do BioS-2P em induzir a diferenciação osteoblástica de CTMs e estimular a atividade osteoblástica de OBs, o que resultaria na neoformação óssea observada in vivo. No entanto, a combinação de BioS-2P com CTMs e OBs não foi capaz de aumentar a formação óssea e induzir o reparo dos defeitos ósseos. / The increasing clinical demand for bone regeneration has driven significant efforts to develop new biomaterials including those for tissue engineeringbased therapies. In this context, bioglasses emerges as a good alternative, but their use has been limited mainly due their poor mechanical properties. To improve these mechanical properties without affecting biocompatibility, a novel bioactive glass-ceramic of the P2O5-Na2O-CaO-SiO2 system, named Biosilicate® with two cristallyne phases (BioS-2P) was developed. However, the effects of these two phases on BioS- 2P biological behavior have not yet been evaluated. Thus, the aims of this study were to investigate the BioS-2P capability of inducing in vitro mesenquimal stem cell differentiation (MSC) towards osteoblasts; the BioS-2P capability to increase in vitro activity of osteoblasts derived from rat bone marrow at early stages of differentiation (OBs) and osteoblasts from rat cell line UMR- 106 (UMRs); and the BioS-2P capability to drive and induce bone formation in vivo, associated or not with cells. Bone marrow cells harvested from rat femurs were cultured either in growth media to obtain MSCs or in osteogenic media to obtain OBs. MSCs, OBs and UMRs were cultured on discs of BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) and tissue culture polystyrene (Control). For in vivo evaluations, 5-mm rat calvarial surgical defects were filled with BioS-2P with or without MSCs or OBs. Data were compared by non-parametric Kruskal-Wallis test followed by Student Newman- Keuls test and the significance level was set at 5%. MSCs were characterized by presenting high percentage of CD29 and CD90 surface markers and low percentage of CD31, CD34, CD45 and CD106 surface markers. Osteoblastic differentiation of MSCs was detected by gene expression of bone markers alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcritption factor 2 (RUNX2), bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). MSCs cultured on Bios-2P discs under non-osteogenic conditions exhibited a decrease on cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers ALP, RUNX2, osterix (OSX), bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), osteopontin (OPN) and OC, confirming its osteoinductive potential similar to 45S5. Also, BioS-2P increased the OBs and UMRs activity, similar to 45S5. OBs cultured on Bios-2P discs presented a decrease in cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers RUNX2, OSX, BMP-4, OPN and OC. The large-scale analysis of over 23,000 genes showed that the BioS-2P induced overexpression of genes positively related to osteoblastic activity and repression of genes negatively related with its activity, compared with control. At least in part, the increase on OBs activity was associated to the modulation of two main signaling pathways, the mitogen activated protein kinases (MAPK) and the Canonical Wnt, and the modulation of microRNAs expression. These findings were corroborated by UMRs grown on BioS-2P, which produced mineralized matrix and exhibited increased expression of the ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) and OPN proteins, than on control. BioS-2P scaffolds (5 mm diameter and 2 mm heigh, presenting 76 ± 5% of total porosity, with poros size ranging from 100 to 800 &micro;m) implanted in calvarial defects promoted new bone formation in close contatc to BioS-2P, both on periphery and in the center of the defect. The computed microtomography morphometry showed no difference between the evaluated parameters bone volume, bone volume / total volume, bone surface, surface / bone volume, number of trabeculae, trabecular separation and trabecular thickness, measured at 4, 8 and 12 weeks. MSCs and OBs were seeded into the scaffold (with efficiency of incorporation 90% e 81%, respectively) and they remained on the defects for 14 days. After 8 weeks, the same pattern of bone formation was observed, however, the combination of BioS-2P with cells did not increase the amount of new bone. The results showed the BioS-2P ability to induce osteoblastic differentiation of MSCs and to stimulate osteoblastic activity, resulting in new bone formation in vivo. However, the combination of BioS-2P with MSCs and OBs was not able to increase bone formation and induce the repair of bone defects.

Orientador: Willian Fernando Zambuzzi / Resumo: Modelos in vitro têm facilitado a análise da fisiologia celular sob condições experimentais diversas; trata-se de modelo alternativo ao uso de animais de experimentação, que vem sendo difundido e aceito amplamente em pesquisa científica. Além disso, estes modelos têm levado à avanços significativos na compreensão das interações mútuas e adaptativas entre células e substratos. Neste trabalho, nosso objetivo foi analisar eventos moleculares responsáveis pela adaptação de preosteoblastos em substrato orgânico composto por componentes da Matriz Extracelular (MEC), sob condição de diferenciação celular. Metodologicamente, pré-osteoblastos (MC3T3-E1 50x103 células/ml) foram semeados sobre uma fina camada de Matrigel® gelificada e mantidos por 10 dias (37oC, 5% de CO2 em ambiente úmido) sob condição de diferenciação (meio de cultivo contendo 50 µg de ácido ascórbico e 10 mM de ß- glicerofosfato), com renovação do meio de cultivo a cada 3 dias. Alterações morfológicas foram monitoradas em microscópio invertido e mecanismos moleculares acompanhados pela análise global da atividade de quinases, através de arranjo de peptídeos (Pepchip). Curiosamente, nossos resultados mostraram mudanças morfológicas significantes durante adaptação celular as quais foram acompanhadas pela atuação de vias de sinalização celular distintas, responsáveis pela sobrevivência (Eixo PI3K-Akt) e proliferação (Eixo Retinoblastoma-ciclinas) celulares, além de proteínas envolvidas com metabolismo energético e comun... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In vitro models have been proposed to analyze cellular physiology under various experimental conditions. It is an alternative model instead using experimental animals that have been widespread and widely accepted in scientific research. Moreover, it has led to significant advances in the understanding of mutual and adaptive interactions between cells and substrates. In this work, our aim was to analyze adaptive events of osteoblasts cultured on an organic substrate composed by components of the extracellular matrix (ECM) in the first 10 days of cultivation on differentiation condition. Methodologically, pre-osteoblasts (MC3T3-E1 pre-osteoblasts, 50x103 cells / ml) were seeded on a thin gelified Matrigel® layer and maintained for 10 days under standard cell culture conditions (37 ° C, 5% CO2 in a humid environment) under differentiation conditions (culture media containing 50 ug of ascorbic acid and 10 mM beta-glycerophosphate). The culture medium was changed every 3 days. Morphological changes were monitored using an inverted microscope and molecular mechanisms followed by comprehensive analysis of kinase activity by peptides arrangement (Pepchip). Interestingly, our results showed significant morphological changes during cell adaptation which were accompanied by distinct signaling pathways involving proteins responsible for survival (PI3K-Akt axis) and cell proliferation (Retinoblastoma-cyclins axis), in addition of proteins involved in energy metabolism and cellular communi... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A crescente demanda clínica para regeneração óssea tem dirigido esforços significativos para o desenvolvimento de novos biomateriais, incluindo aqueles aplicados em terapias baseadas em engenharia de tecidos. Neste contexto, os biovidros são considerados uma boa alternativa mas as suas propriedades mecânicas têm limitado a sua aplicação. Para melhorar tais propriedades sem afetar a biocompatibilidade, um novo material vitrocerâmico bioativo do sistema P2O5-Na2O-CaO-SiO2, chamado Biosilicato® com duas fases cristalinas (BioS-2P) foi desenvolvido. No entanto, os efeitos da adição das fases cristalinas sobre o comportamento biológico do BioS-2P ainda não foram estudados. Assim, os objetivos deste estudo foram investigar a capacidade do BioS-2P em induzir, in vitro, a diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (CTMs); a capacidade do BioS-2P em aumentar, in vitro, a atividade dos osteoblastos em fase inicial de diferenciação (OBs) e osteoblastos da linhagem UMR-106 (UMRs); e a capacidade do BioS-2P em conduzir e induzir a neoformação óssea, in vivo, associado ou não a células. Células derivadas da medula óssea obtidas de fêmures de ratos foram cultivadas em meio de crescimento para obtenção de CTMs ou em meio osteogênico para obtenção de OBs. Essas células e UMRs foram cultivadas sobre discos de BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) e plástico de cultura (Controle) e utilizadas nas avaliações in vitro. Para as avaliações in vivo, defeitos de 5 mm criados em calotas de ratos foram implantados somente com arcabouços de BioS-2P ou com arcabouços de BioS-2P associados às CTMs ou aos OBs. Os dados foram comparados por teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Student Newman-Keuls, e o nível de significância adotado foi de 5%. As CTMs foram caracterizadas por apresentarem alta porcentagem de células expressando os marcadores de superfície CD29 e CD90 e baixa porcentagem expressando CD31, CD34, CD45 e CD106. A diferenciação osteoblástica das CTMs foi confirmada pela expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcriptor factor-2 (RUNX2), sialoproteína óssea (BSP) e osteocalcina (OC). CTMs cultivadas sobre discos de BioS-2P em meio não-osteogênico apresentaram diminuição da proliferação e aumento da atividade de ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica ALP, RUNX2, osterix (OSX), proteína óssea morfogenética-4 (BMP-4), osteopontina (OPN) e OC, comprovando seu potencial osteoindutor similar ao 45S5. O BioS-2P foi capaz de aumentar a atividade de OBs e UMRs de maneira similar àqueles cultivados sobre o 45S5. OBs apresentaram diminuição na proliferação e aumento da atividade da ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica RUNX2, OSX, BMP-4, OPN e OC. A análise em larga escala da expressão de mais de 23.000 genes mostrou que o BioS-2P induziu a sobre-expressão de genes envolvidos no aumento da atividade osteoblástica e a repressão de genes envolvidos na diminuição dessa atividade, em comparação com o Controle. Ao menos em parte, esse aumento da atividade osteoblástica foi atribuído à modulação das vias de sinalização proteíno-quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e Wnt Canônica, e à modulação da expressão de microRNAs. UMRs crescidos sobre o BioS-2P corroboraram esses achados, pela capacidade em formar matriz mineralizada e por apresentarem aumento na expressão das proteínas ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) e OPN. Arcabouços de BioS-2P (5 mm de diâmetro e 2 mm de altura com porosidade de 76 ± 5% e com tamanhos de poros variando entre 100 e 800 &micro;m) implantados em defeitos na calota de ratos estimularam a formação de tecido ósseo, que ocorreu tanto na periferia como no interior dos defeitos e em íntimo contato com o material. A morfometria por microtomografia computadorizada não evidenciou qualquer diferença entre os parâmetros volume ósseo, volume ósseo/volume total, superfície óssea, superfície/volume ósseo, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, avaliados na 4a, 8a e 12a semanas de implantação. As CTMs e os OBs foram carreados para os arcabouços de BioS- 2P (com eficiência de 90% e 81%, respectivamente) e essas células permaneceram nos defeitos por 14 dias. A combinação de arcabouços de BioS-2P com CTMs ou OBs, implantados por 8 semanas, resultou no mesmo padrão de formação óssea daquele observado para o arcabouço sem células. No entanto, essa combinação não resultou em aumento na quantidade de osso formado. Os resultados evidenciaram a capacidade do BioS-2P em induzir a diferenciação osteoblástica de CTMs e estimular a atividade osteoblástica de OBs, o que resultaria na neoformação óssea observada in vivo. No entanto, a combinação de BioS-2P com CTMs e OBs não foi capaz de aumentar a formação óssea e induzir o reparo dos defeitos ósseos. / The increasing clinical demand for bone regeneration has driven significant efforts to develop new biomaterials including those for tissue engineeringbased therapies. In this context, bioglasses emerges as a good alternative, but their use has been limited mainly due their poor mechanical properties. To improve these mechanical properties without affecting biocompatibility, a novel bioactive glass-ceramic of the P2O5-Na2O-CaO-SiO2 system, named Biosilicate® with two cristallyne phases (BioS-2P) was developed. However, the effects of these two phases on BioS- 2P biological behavior have not yet been evaluated. Thus, the aims of this study were to investigate the BioS-2P capability of inducing in vitro mesenquimal stem cell differentiation (MSC) towards osteoblasts; the BioS-2P capability to increase in vitro activity of osteoblasts derived from rat bone marrow at early stages of differentiation (OBs) and osteoblasts from rat cell line UMR- 106 (UMRs); and the BioS-2P capability to drive and induce bone formation in vivo, associated or not with cells. Bone marrow cells harvested from rat femurs were cultured either in growth media to obtain MSCs or in osteogenic media to obtain OBs. MSCs, OBs and UMRs were cultured on discs of BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) and tissue culture polystyrene (Control). For in vivo evaluations, 5-mm rat calvarial surgical defects were filled with BioS-2P with or without MSCs or OBs. Data were compared by non-parametric Kruskal-Wallis test followed by Student Newman- Keuls test and the significance level was set at 5%. MSCs were characterized by presenting high percentage of CD29 and CD90 surface markers and low percentage of CD31, CD34, CD45 and CD106 surface markers. Osteoblastic differentiation of MSCs was detected by gene expression of bone markers alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcritption factor 2 (RUNX2), bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). MSCs cultured on Bios-2P discs under non-osteogenic conditions exhibited a decrease on cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers ALP, RUNX2, osterix (OSX), bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), osteopontin (OPN) and OC, confirming its osteoinductive potential similar to 45S5. Also, BioS-2P increased the OBs and UMRs activity, similar to 45S5. OBs cultured on Bios-2P discs presented a decrease in cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers RUNX2, OSX, BMP-4, OPN and OC. The large-scale analysis of over 23,000 genes showed that the BioS-2P induced overexpression of genes positively related to osteoblastic activity and repression of genes negatively related with its activity, compared with control. At least in part, the increase on OBs activity was associated to the modulation of two main signaling pathways, the mitogen activated protein kinases (MAPK) and the Canonical Wnt, and the modulation of microRNAs expression. These findings were corroborated by UMRs grown on BioS-2P, which produced mineralized matrix and exhibited increased expression of the ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) and OPN proteins, than on control. BioS-2P scaffolds (5 mm diameter and 2 mm heigh, presenting 76 ± 5% of total porosity, with poros size ranging from 100 to 800 &micro;m) implanted in calvarial defects promoted new bone formation in close contatc to BioS-2P, both on periphery and in the center of the defect. The computed microtomography morphometry showed no difference between the evaluated parameters bone volume, bone volume / total volume, bone surface, surface / bone volume, number of trabeculae, trabecular separation and trabecular thickness, measured at 4, 8 and 12 weeks. MSCs and OBs were seeded into the scaffold (with efficiency of incorporation 90% e 81%, respectively) and they remained on the defects for 14 days. After 8 weeks, the same pattern of bone formation was observed, however, the combination of BioS-2P with cells did not increase the amount of new bone. The results showed the BioS-2P ability to induce osteoblastic differentiation of MSCs and to stimulate osteoblastic activity, resulting in new bone formation in vivo. However, the combination of BioS-2P with MSCs and OBs was not able to increase bone formation and induce the repair of bone defects.

Eventos como fosforilação e desfosforilação estão presentes nos processos de crescimento e diferenciação celular. As proteínas tirosina fosfatases estão envolvidas nestes processos. Estas enzimas são encontradas em animais, plantas e ocorrem em diversas formas, diferindo no peso molecular, substrato específico e sensibilidade a inibidores. As enzimas que possuem baixo peso molecular (entre 18-20 KDa), hidrolisam p-nitrofenilfosfato e são sensíveis ao p-hidroximercuribenzoato são chamadas como proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular relativo (PTP-BMr) ou fosfatases ácidas. Vários dados sugerem que tipos de células de osso, como osteoblastos, podem expressar esta enzima ativa. Aqui, culturas de osteoblastos derivadas da medula removida do fêmur de rato foram investigadas para padronizar a metodologia de obtenção da PTP-BMr. A expressão e atividade catalítica desta enzima em diferentes estágios de crescimento de osteoblastos também foram verificadas. Foi observado que são necessários de 16-19 dias de cultura para obter maiores níveis de atividade da PTP-BMr em extrato citoplasmático. O nível de expressão do gene da PTP-BMr foi determinado por PCR em tempo real e uma maior quantificação de RNAm foi obtida em 16 dias de crescimento de osteoblasto. A caracterização bioquímica parcial confirma uma banda de atividade em gel de poliacrilamida com peso molecular de 17,6 KDa, e pH ótimo de 5,5. A hidrólise do p-nitrofenilfosfato demonstra uma pequena cooperatividade relativa (n=1,2) com K0,5= 0,12 e Vmax= 3,5U/mg. Esta atividade foi fortemente inibida (60 a 75%) por molibdato de amônio (10mM); fosfato de sódio (10mM); ortovanadato de sódio (10mM) e p-hidroximercuribenzoato de sódio (10mM). Estas propriedades são típicas desta classe. A interação entre osteoblastos e diferentes superfícies pode ativar ou desativar genes. Este presente projeto investigou se a interação com superfície de titânio pode modificar o perfil de atividade da PTP-BMr. Quando em presença de uma superfície de titânio há um maior aumento na atividade catalítica do que nos níveis de RNAm da PTP-BMr o que sugere uma estimulação da enzima a qual pode estar auxiliando no processo de formação óssea. / Events as phosphorilation and desphosphorilation are experienced in cell growth and differentiation processes. Tyrosine phosphatases proteins are involved in these processes. These enzymes are found in animals, plants and occur in multiple forms, differing in relative molecular weight, substrate specificity and sensitivity to inhibitors. The enzymes that have low molecular weight (between 18-20KDa), hydrolize p-nitrophenilphosphate and are sensible to p-hidroximercuribenzoate are known as low molecular weight relative tyrosine phosphatase proteins (PTP-LMWr) or acid phosphatase. Several data suggest that bone cell types, such as osteoblasts, may express this enzyme activity. Here, osteosblast cultures derived from medulla removed from rat femur were investigated to standardize the methodology of PTP-LMW obtainment. The expression and the catalytic activity of this protein in different stages of osteoblast growth were checked as well. It was observed that 16-19 culture days are necessary to obtain greater levels of activity of PTP-LMW in the cytoplasmatic extracts. The gene expression level of PTP-LMW was determined by quantitative real-time PCR, and a greater quantity of mRNA was observed within sixteen days of osteoblast growth. The partial biochemistry characterization confirms a single active band in poliacrilamide gel with molecular weight of about 17.6KDa, and a pH-optimum around 5.5. p-nitrophenilphosphate hydrolysis shows a small cooperative behavior (n=1.2) with K0.5=0.12mM and Vmax=3.5U/mg. This activity was strongly inhibited (about 60-95%) by ammonium molybdate (10mM); sodium phosphate (10mM); sodium orthovanadate (10mM) and sodium p-hydroximercuribenzoate (10mM). These properties are typical for this enzyme class.

Eventos como fosforilação e desfosforilação estão presentes nos processos de crescimento e diferenciação celular. As proteínas tirosina fosfatases estão envolvidas nestes processos. Estas enzimas são encontradas em animais, plantas e ocorrem em diversas formas, diferindo no peso molecular, substrato específico e sensibilidade a inibidores. As enzimas que possuem baixo peso molecular (entre 18-20 KDa), hidrolisam p-nitrofenilfosfato e são sensíveis ao p-hidroximercuribenzoato são chamadas como proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular relativo (PTP-BMr) ou fosfatases ácidas. Vários dados sugerem que tipos de células de osso, como osteoblastos, podem expressar esta enzima ativa. Aqui, culturas de osteoblastos derivadas da medula removida do fêmur de rato foram investigadas para padronizar a metodologia de obtenção da PTP-BMr. A expressão e atividade catalítica desta enzima em diferentes estágios de crescimento de osteoblastos também foram verificadas. Foi observado que são necessários de 16-19 dias de cultura para obter maiores níveis de atividade da PTP-BMr em extrato citoplasmático. O nível de expressão do gene da PTP-BMr foi determinado por PCR em tempo real e uma maior quantificação de RNAm foi obtida em 16 dias de crescimento de osteoblasto. A caracterização bioquímica parcial confirma uma banda de atividade em gel de poliacrilamida com peso molecular de 17,6 KDa, e pH ótimo de 5,5. A hidrólise do p-nitrofenilfosfato demonstra uma pequena cooperatividade relativa (n=1,2) com K0,5= 0,12 e Vmax= 3,5U/mg. Esta atividade foi fortemente inibida (60 a 75%) por molibdato de amônio (10mM); fosfato de sódio (10mM); ortovanadato de sódio (10mM) e p-hidroximercuribenzoato de sódio (10mM). Estas propriedades são típicas desta classe. A interação entre osteoblastos e diferentes superfícies pode ativar ou desativar genes. Este presente projeto investigou se a interação com superfície de titânio pode modificar o perfil de atividade da PTP-BMr. Quando em presença de uma superfície de titânio há um maior aumento na atividade catalítica do que nos níveis de RNAm da PTP-BMr o que sugere uma estimulação da enzima a qual pode estar auxiliando no processo de formação óssea. / Events as phosphorilation and desphosphorilation are experienced in cell growth and differentiation processes. Tyrosine phosphatases proteins are involved in these processes. These enzymes are found in animals, plants and occur in multiple forms, differing in relative molecular weight, substrate specificity and sensitivity to inhibitors. The enzymes that have low molecular weight (between 18-20KDa), hydrolize p-nitrophenilphosphate and are sensible to p-hidroximercuribenzoate are known as low molecular weight relative tyrosine phosphatase proteins (PTP-LMWr) or acid phosphatase. Several data suggest that bone cell types, such as osteoblasts, may express this enzyme activity. Here, osteosblast cultures derived from medulla removed from rat femur were investigated to standardize the methodology of PTP-LMW obtainment. The expression and the catalytic activity of this protein in different stages of osteoblast growth were checked as well. It was observed that 16-19 culture days are necessary to obtain greater levels of activity of PTP-LMW in the cytoplasmatic extracts. The gene expression level of PTP-LMW was determined by quantitative real-time PCR, and a greater quantity of mRNA was observed within sixteen days of osteoblast growth. The partial biochemistry characterization confirms a single active band in poliacrilamide gel with molecular weight of about 17.6KDa, and a pH-optimum around 5.5. p-nitrophenilphosphate hydrolysis shows a small cooperative behavior (n=1.2) with K0.5=0.12mM and Vmax=3.5U/mg. This activity was strongly inhibited (about 60-95%) by ammonium molybdate (10mM); sodium phosphate (10mM); sodium orthovanadate (10mM) and sodium p-hydroximercuribenzoate (10mM). These properties are typical for this enzyme class.

Objetivos: O objetivo desse estudo foi avaliar comparativamente o potencial osteogênico in vitro de células obtidas do ramo mandibular (RM, área doadora) e do seio maxilar enxertado com uma mistura de RM e osso bovino inorgânico (OBI), previamente à instalação de implantes de titânio (SM, sítio do seio maxilar enxertado). Material e Métodos: As células foram obtidas de três pacientes submetidos a procedimentos de aumento do soalho do seio maxilar com a proporção de 1:1 de RM e OBI (GenOx Inorg®). No momento da realização dos enxertos no seio maxilar e após 08 meses, antes da inserção dos implantes de titânio, fragmentos ósseos foram colhidos do RM e do SM, respectivamente, e submetidos à digestão enzimática com tripsina e colagenase para obtenção de células primárias. As células foram subcultivadas e crescidas sob condições osteogênicas por até 21 dias, tendo sido avaliados os seguintes parâmetros: proliferação/viabilidade celular, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e conteúdo de cálcio, por extração do vermelho de Alizarina. Culturas primárias derivadas do RM foram expostas ao GenOx Inorg® por 7 dias, quando se avaliou a atividade de ALP. Os resultados foram comparados por ANOVA two-way, seguido do teste de Tukey, ou pelo teste de Mann-Whitney. Resultados: Culturas do SM exibiram uma redução significante do potencial osteogênico se comparado ao de culturas do RM, com um aumento progressivo na proliferação celular associado a uma redução da expressão dos marcadores osteoblásticos, da atividade de ALP e do conteúdo de cálcio. A exposição do GenOx Inorg® às células primárias derivadas do RM inibiram a atividade de ALP. Conclusão: Esses resultados sugerem que o uso do GenOx Inorg® em associação a fragmentos do RM para aumento do soalho do seio maxilar inibe a diferenciação de células osteoblásticas no sítio de inserção de implantes de titânio após 8 meses de enxertia. / Objectives: This study aimed to comparatively evaluate the in vitro osteogenic potential of cells obtained from the mandibular ramus (MR, autogenous bone donor site) and from the maxillary sinus bone grafted with a mixture of anorganic bovine bone (ABB) and MR prior to titanium implant placement (MS, grafted implant site). Material and methods: Cells were obtained from three patients subjected to maxillary sinus floor augmentation with a 1:1 mixture of ABB (GenOx Inorg®) and MR. At the time of the sinus lift procedure and after 8 months, prior to implant placement, bone fragments were taken from MR and MS, respectively, and subjected to trypsin-collagenase digestion for primary cell culturing. Subcultured cells were grown under osteogenic condition for up 21 days and assayed for proliferation/viability, osteoblast marker mRNA levels, alkaline phosphatase (ALP) activity and calcium content/Alizarin red staining. ALP activity was also determined in primary explant cultures exposed to GenOx Inorg® (1:1 with MR) for 7 days. Data were compared using the two-way ANOVA followed by the Tukey test; otherwise, the Mann-Whitney test was used. Results: MS cultures exhibited a significantly lower osteogenic potential compared with MR cultures, with a progressive increase in cell proliferation together with a downregulation of osteoblast markers, reduced ALP activity and calcium content. Exposure of MR-derived primary cultures to GenOx Inorg® inhibited ALP activity. Conclusion: These results suggest that the use of GenOx Inorg® in combination with MR fragments for maxillary sinus floor augmentation inhibits the osteoblast cell differentiation at the implant site in the longterm.

Objetivos: O objetivo desse estudo foi avaliar comparativamente o potencial osteogênico in vitro de células obtidas do ramo mandibular (RM, área doadora) e do seio maxilar enxertado com uma mistura de RM e osso bovino inorgânico (OBI), previamente à instalação de implantes de titânio (SM, sítio do seio maxilar enxertado). Material e Métodos: As células foram obtidas de três pacientes submetidos a procedimentos de aumento do soalho do seio maxilar com a proporção de 1:1 de RM e OBI (GenOx Inorg®). No momento da realização dos enxertos no seio maxilar e após 08 meses, antes da inserção dos implantes de titânio, fragmentos ósseos foram colhidos do RM e do SM, respectivamente, e submetidos à digestão enzimática com tripsina e colagenase para obtenção de células primárias. As células foram subcultivadas e crescidas sob condições osteogênicas por até 21 dias, tendo sido avaliados os seguintes parâmetros: proliferação/viabilidade celular, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e conteúdo de cálcio, por extração do vermelho de Alizarina. Culturas primárias derivadas do RM foram expostas ao GenOx Inorg® por 7 dias, quando se avaliou a atividade de ALP. Os resultados foram comparados por ANOVA two-way, seguido do teste de Tukey, ou pelo teste de Mann-Whitney. Resultados: Culturas do SM exibiram uma redução significante do potencial osteogênico se comparado ao de culturas do RM, com um aumento progressivo na proliferação celular associado a uma redução da expressão dos marcadores osteoblásticos, da atividade de ALP e do conteúdo de cálcio. A exposição do GenOx Inorg® às células primárias derivadas do RM inibiram a atividade de ALP. Conclusão: Esses resultados sugerem que o uso do GenOx Inorg® em associação a fragmentos do RM para aumento do soalho do seio maxilar inibe a diferenciação de células osteoblásticas no sítio de inserção de implantes de titânio após 8 meses de enxertia. / Objectives: This study aimed to comparatively evaluate the in vitro osteogenic potential of cells obtained from the mandibular ramus (MR, autogenous bone donor site) and from the maxillary sinus bone grafted with a mixture of anorganic bovine bone (ABB) and MR prior to titanium implant placement (MS, grafted implant site). Material and methods: Cells were obtained from three patients subjected to maxillary sinus floor augmentation with a 1:1 mixture of ABB (GenOx Inorg®) and MR. At the time of the sinus lift procedure and after 8 months, prior to implant placement, bone fragments were taken from MR and MS, respectively, and subjected to trypsin-collagenase digestion for primary cell culturing. Subcultured cells were grown under osteogenic condition for up 21 days and assayed for proliferation/viability, osteoblast marker mRNA levels, alkaline phosphatase (ALP) activity and calcium content/Alizarin red staining. ALP activity was also determined in primary explant cultures exposed to GenOx Inorg® (1:1 with MR) for 7 days. Data were compared using the two-way ANOVA followed by the Tukey test; otherwise, the Mann-Whitney test was used. Results: MS cultures exhibited a significantly lower osteogenic potential compared with MR cultures, with a progressive increase in cell proliferation together with a downregulation of osteoblast markers, reduced ALP activity and calcium content. Exposure of MR-derived primary cultures to GenOx Inorg® inhibited ALP activity. Conclusion: These results suggest that the use of GenOx Inorg® in combination with MR fragments for maxillary sinus floor augmentation inhibits the osteoblast cell differentiation at the implant site in the longterm.