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Des charges cycliques élevées induisent la formation de microfissures dans l'os, déclenchant un processus de remodelage ciblé, mené par les ostéoclastes et suivi par les ostéoblastes, visant à réparer et à prévenir l'accumulation des dommages. L'os de cheval de course est un modèle idéal pour étudier les effets d'une charge de haute intensité, car il est sujet à une accumulation focale de microfissures et à la résorption qui s'ensuit dans les articulations. Les ostéoclastes équins ont rarement été étudiés in vitro. Le volume de résorption des ostéoclastes est considéré comme un paramètre direct de l'activité des ostéoclastes, mais des méthodes indirectes de quantification en 2D de la résorption osseuse sont plus souvent utilisées. L'objectif de cette étude était de développer une méthode précise, à haut débit et assistée par l'apprentissage profond pour quantifier le volume de résorption des ostéoclastes équins dans les images micro tomodensitométrie (µCT) 3D. Des ostéoclastes équins ont été cultivés sur des tranches d'os équins, imagés par μCT avant et après la culture. Le volume, le ratio de forme et la profondeur maximale de chaque événement de résorption ont été mesurés dans les images volumétriques de trois tranches d'os. Un convolution neural network (CNN) a ensuite été entraîné à identifier les événements de résorption sur les images μCT post-culture, puis le modèle a été appliqué à des tranches d'os d'archives (n=21), pour lesquelles l’aire de résorption en 2D, et la concentration du biomarqueur de résorption CTX-I étaient connues. Cela a permis d'obtenir des informations 3D sur la résorption des tranches d’os pour lesquels aucune imagerie n'avait été réalisée avant la mise en culture. La valeur modale du volume, la profondeur maximale et le ratio de forme des événements de résorption discrète étaient respectivement de 2,7*103µm3, 12 µm et 0,18. Le volume de résorption moyen par tranche d'os archivés était de 34155,34*103µm3. Le volume de résorption mesuré par le CNN était en forte corrélation avec les mesures de CTX-I (p <0,001) et d’aire (p <0,001). Cette technique de segmentation des images µCT des coupes osseuses assistée par apprentissage profond pour quantifier le volume de résorption osseuse des ostéoclastes équins permettra des recherches futures plus précises et plus approfondies sur l'activité des ostéoclastes. Par exemple, les effets antirésorptifs de médicaments tels que les corticostéroïdes et les bisphosphonates pourront être étudiés à l'avenir. / High cyclic loads induce the formation of microcracks in bone, initiating a process of targeted remodeling, led by osteoclasts, and followed by osteoblasts, aimed at repairing and preventing accumulation of damage. Racehorse bone is an ideal model for studying the effects of high-intensity loading, as it is subject to focal accumulation of microcracks and subsequent resorption within joints. Equine osteoclasts have rarely been investigated in vitro. The volume of osteoclast resorption is considered a direct parameter of osteoclast activity, but indirect 2D quantification methods are used more often. The objective of this study was to develop an accurate, high-throughput, deep learning-aided method to quantify equine osteoclast resorption volume in µCT 3D images. Equine osteoclasts were cultured on equine bone slices, imaged with μCT pre- and post-culture. Volume, aspect ratio (shape factor) and maximum depth of each resorption event were measured in volumetric images of three bone slices. A convolutional neural network (U-Net-like) was then trained to identify resorption events on post-culture μCT images and then the network was applied to archival bone slices (n=21), for which the area of resorption in 2D, and the concentration of a resorption biomarker CTX-I were known. This unlocked the 3D information on resorption for bone slices where no pre-culture imaging was done. The modal volume, maximum depth, and aspect ratio of discrete resorption events were 2.7*103µm3, 12 µm and 0.18 respectively. The mean resorption volume per bone slice on achieved bone samples was 34155.34*103µm3. The CNN-labeled resorption volume correlated strongly with both CTX-I (p <0.001) and area measurements (p <0.001). This technique of deep learning-aided feature segmentation of µCT images of bone slices for quantifying equine osteoclast bone resorption volume allows for more accurate and extensive future investigations on osteoclast activity. For example, the antiresorptive effects of medications like corticosteroids and bisphosphonates can be investigated in the future.

Vor zehn Jahren wurde der (Pro)Renin-Rezeptor [(P)RR] entdeckt und als neuer Bestandteil des Renin-Angiotensin-Systems beschrieben. Neuere Studien ergaben, dass der (P)RR mit der vakuolären H+-ATPase (V-ATPase) assoziiert sein kann, weshalb er auch V-ATPase associated protein 2 (ATP6ap2) genannt wird. In Osteoklasten befinden sich V-ATPase hauptsächlich an der zur Knochenoberfläche gerichteten Plasmamembran und transportieren Protonen in den extrazellulären Raum. Mäuse mit genetischer Deletion verschiedener V-ATPase-Untereinheiten charakterisiert durch einen Anstieg von Knochenmasse (Osteopetrose). In der vorliegenden Arbeit fanden wir heraus, dass (P)RR stark in reifen Osteoklasten in vitro und in vivo exprimiert wird. Mäuse mit genetischer Deletion des (P)RR in Osteoklasten wurden durch einen komplexen Knochen-Phänotyp mit reduzierter Knochendichte charakterisiert. (P)RR-defiziten Osteoklasten wiesen vermehrte Differenzierung und/oder Aktivität in vitro und in vivo auf. Wir postulieren deshalb, dass der (P)RR die in der Plasmamembran lokalisierten V-ATPase nicht direkt reguliert, sondern mit der physiologischen Aktivität der Osteoklasten durch andere Mechanismen interferiert. Macrophagen sind speziell auf die Immunabwehr ausgerichtete Fresszellen (Phagozyten). Phagozytose ist ein wesentlicher Zellprozess der die V-ATPase in Lysosomen braucht um die eingeschlossenen Pathogen zu zerstören. Wir generierten transgene Ratten mit konditionellen knockdown von (P)RR unter Nutzung eines Doxyzyclin-induzierten shRNA-Expressionssystems. Eine effiziente (P)RR-Depletion in Makrophagen wurde durch Behandlung mit Doxyzyclin in vivo im Trinkwasser und in vitro im Kulturmedium erreicht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Verschiebung des vesikulären pHs erst ziemlich spät nach (P)RR-Depletion auftritt. Wir fanden heraus, dass (P)RR-Depletion weder Phagozytose noch Endozytose beeinträchtigte, sondern für das Recycling des Transferrin-Rezeptors zur Plasmamembran wichtig ist. / A decade ago, the (pro)renin receptor [(P)RR] was discovered and depicted as a new component of the renin-angiotensin system. However, recent studies have put in evidence that the (P)RR associate with and regulate the vacuolar H+-ATPase (V-ATPase), hence its other name vacuolar H+-ATPase associated protein 2 (ATP6ap2). In osteoclasts, V-ATPases are mainly located at the plasma membrane facing the bone surface and extrude protons into the extracellular space. Mice with genetic deletion of various V-ATPase subunits are characterized by an increase of bone mass (osteopetrosis). In this work, we found that the (P)RR is highly expressed in mature osteoclasts in vitro and in vivo. Mice with genetic deletion of the (P)RR in osteoclasts developed a complex bone phenotype characterized by a reduced bone density. Osteoclasts lacking (P)RR displayed increased differentiation and/or activity in vitro and in vivo. We therefore suggest that the (P)RR does not directly regulate V-ATPases located at the plasma membrane but rather interferes with osteoclast physiology through other mechanisms. Macrophages are professionalized phagocytes crucial for immune response. Phagocytosis is an essential cellular process, which requires lysosomal V-ATPases for degradation of engulfed pathogens. We generated transgenic rats with a conditional depletion of the (P)RR with the use of a doxycycline-induced shRNA expression system. Efficient (P)RR depletion in macrophages was accomplished by doxycycline treatment in vivo in drinking water and in vitro in culture medium. In this work, we found that the impairment of vesicular pH occurs lately after (P)RR deletion. Also, we found that (P)RR deletion did not impair neither phagocytosis nor endocytosis but rather perturbed the recycling of the transferrin receptor to the plasma membrane.

Les ostéoclastes, les seules cellules capables de résorber l’os, sont soupçonnés d’être associés au développement et à la progression des radiotransparences sous-chondrales (SR). Ils n’ont par contre jamais été étudiés in situ. Les objectifs de cette étude cadavérique ex vivo étaient de mesurer et de comparer la densité ostéoclastique et le pourcentage de chondroclastes se trouvant à différentes profondeurs de l’os sous-chondral à partir de la surface articulaire dans le condyle fémoral médial (CFM) de chevaux Pur-sang juvéniles sains et atteints de SR hâtives spontanées. Les spécimens provenaient d’une banque de tissus et faisaient partie d’une étude précédente sur les caractéristiques structurelles des SR. La tomodensitométrie identifiait les CFM atteints de SR (n=6) et guidait les coupes ostéochondrales. Les contrôles de l’étude étaient composés d’un site histologiquement normal et caudal à la lésion (n=6) et du site controlatéral à la lésion dans le CFM sain (n=5). Après la décalcification et la fixation dans la paraffine, les spécimens étaient colorés à l’immunohistochimie afin de mettre en évidence les ostéoclastes présents dans l’os en périphérie des SR. Les spécimens étaient ensuite séparés en régions d’intérêt (ROI) à différentes profondeurs de l’os sous-chondral: ROI1 (0-1mm), ROI2 (1-3mm) et ROI3 (3-6mm). Les ostéoclastes ont été comptés dans chaque ROI pour calculer leur densité ostéoclastique respective. Les lames ont été contre-colorées avec la Safranine afin d’identifier le cartilage et mesurer le pourcentage de chondroclastes. La densité ostéoclastique était statistiquement plus élevée dans la ROI1 comparativement à la ROI3 dans tous les groupes. Cependant, aucune différence significative n’a été détectée en comparant les ROI entre les groupes, même si la densité ostéoclastique était supérieure dans la ROI1 des SR. Malgré une proportion de chondroclastes dans la ROI1 des SR inférieure à celle des contrôles, aucune différence significative n’a été détectée. La limite principale de cette étude se révéla être la taille de l’échantillon. Nos résultats démontrent cependant que la pathophysiologie des SR n’est pas uniquement expliquée par l’augmentation du nombre d’ostéoclastes dans l’os sous-chondral en périphérie des lésions. / There is a knowledge gap concerning how and when equine medial femoral condyle (MFC) subchondral radiolucencies (SR) arise and evolve. Osteoclasts, the only cells capable of bone resorption, are believed to have a role, but have not been studied in situ. The objectives of this ex vivo cadaveric study were to measure and compare the osteoclast density and the percentage of chondroclasts in juvenile (<1 year) Thoroughbred MFCs at varying depths from the weightbearing articular surface in both healthy and early spontaneous MFC SR specimens. The MFCs were available in a tissue bank and were part of a prior study of the structural characteristics of SRs. Computed tomography permitted identification of MFC SR (n=6) and guided osteochondral slab sections. Controls included a histologically normal site caudal to the lesions (n=6) and the healthy contralateral MFC lesion site (n=5). Following decalcification, paraffin embedding sections were cut and stained immunohistochemically with Cathepsin K to permit osteoclast identification and counting. The sections were divided into regions of interest (ROI) at different depths in the subchondral bone from the osteochondral junction: ROI1 (0-1mm), ROI2 (1-3mm) and ROI3 (3-6mm). Osteoclasts were counted in each ROI in order to calculate an osteoclast density. A Safranin-O counterstain was performed to identify the cartilage and measure the chondroclasts percentage. Osteoclast density was significantly higher in ROI1 when compared with ROI3 in all groups. When ROIs were compared between the three groups, no statistically significant differences were detected, even if a visible pattern difference and higher osteoclast density values were recorded in ROI1 in SRs. However, although the proportion of chondroclasts in ROI1 was lower in the SR sections when compared with controls, no significant difference was detected. The main limitation was the limited sample size. Osteoclasts are important actors in MFC subchondral bone development, digesting both growth cartilage (chondroclasts) and bone, but the pathophysiology of early MFC SRs cannot be explained solely by an increased osteoclast presence in the peripheral subchondral bone.

Chaque année, des chevaux de course décèdent de fractures complètes lors d’entrainement ou de course. A l’exercice, les charges supra-physiologiques cycliques entrainent des microfissures indiscernables par les techniques d’imagerie in vivo actuelles. Les ostéoclastes recrutés aux sites lésés induisent localement une lyse osseuse et une ostéopénie par résorption excessive, créant une concentration de contrainte à l’origine de fracture complète. Cependant, le rôle biologique des ostéoclastes dans les fractures de stress n’est à ce jour pas clairement identifié. Les objectifs de cette étude ont été d’établir des cultures in vitro d’ostéoclastes équins, corréler le nombre d’ostéoclastes avec l’isoforme 5b de l’enzyme phosphatase acide tartrate-résistante (TRACP 5b), corréler la résorption osseuse avec la TRACP-5b et le télopeptide C-terminal du collagène de type I (CTX-I) et étudier les effets de facteurs d’inflammation sur l’activité ostéoclastique. Après aspiration de moelle osseuse sternale, les cellules souches hématopoïétiques ont été isolées, conservées dans une banque cellulaire, décongelées, différenciées en ostéoclastes, avec ou sans os équin, et stimulées par des facteurs inflammatoires (IL-1β ou LPS). CTX-I et TRACP-5b ont été dosés par ELISA. Le nombre d’ostéoclastes colorés à la phosphatase acide tartrate-résistante et les aires de résorption osseuse colorées au bleu de toluidine ont été évalués. Dans les cultures d’ostéoclastes, la TRACP-5b augmentait (p < 0,0001) avec le temps et était corrélée (r = 0,63, p < 0.001) avec le nombre d’ostéoclastes. Dans les cultures d’ostéoclastes sur os, le CTX-I (p = 0,0018) et la TRACP-5b (p = 0,02) augmentaient avec le temps, étaient corrélés ensemble (r = 0,64, p < 0,002) et étaient tous deux corrélés avec la résorption osseuse (respectivement, r = 0,85, p < 0,001 et r = 0,82, p < 0,001). La stimulation inflammatoire n’a eu aucun effet significatif. Ostéoclastes équins et résorption osseuse ont été obtenus avec succès sur os équin à partir d’aspiration de moelle osseuse sternale. Pour la première fois, CTX-I et TRACP-5b ont été mesurés dans des cultures d’ostéoclastes équins. In vitro, CTX-I est un biomarqueur de résorption osseuse équine et TRACP-5b un biomarqueur du nombre d’ostéoclastes et de résorption osseuse équins. Des recherches ultérieures sont nécessaires afin d’évaluer si la TRACP 5b sérique permet la détection de toute résorption osseuse excessive chez les chevaux de course. / Every year racehorses die from complete catastrophic fractures in training and racing. Supra-physiological cyclic loads during exercise cause bone microcracks not discernible with current imaging in vivo. Osteoclasts recruited to the sites of the damage induce focal bone lysis and osteopenia by excessive resorption, creating a stress riser area susceptible to complete fracture. However, the biological impact of osteoclasts in stress fractures is not entirely understood. Our objectives were to establish in vitro cultures of equine osteoclasts, to correlate osteoclast numbers with the tartrate-resistant acid phosphatase 5b isoform (TRACP-5b), to correlate bone resorption with the TRACP-5b and the C-terminal telopeptide of type I collagen (CTX-I), as well as to investigate the effects of inflammatory factors on osteoclast activity. Following equine sternal bone marrow aspirations, hematopoietic stem cells were isolated, stored in a cell bank, thawed, differentiated into osteoclasts, with or without equine bone slices, and they finally underwent inflammatory stimulation (IL-1β or LPS). CTX-I and TRACP 5b were assayed by ELISAs. Osteoclasts stained with tartrate resistant acid phosphatase were counted and bone resorption areas stained with toluidine blue were measured. In the osteoclast cultures, the TRACP 5b increased (p < 0.0001) with time and correlated (r = 0.63, p < 0.001) with osteoclast number. In the osteoclast-bone cultures, both CTX-I (p = 0.0018) and TRACP-5b (p = 0.02) increased with time, correlated with each other (r = 0.64, p < 0.002) and both correlated with bone resorption (r = 0.85, p < 0.001 and r = 0.82, p < 0.001, respectively). The inflammatory stimuli had no significant effects. Equine osteoclasts and bone resorption were successfully induced on equine bone from sternal bone marrow aspiration. For the first time CTX-I and TRACP-5b were measured in equine osteoclast cultures. In vitro, CTX-I is a biomarker of equine bone resorption and TRACP-5b a biomarker of equine osteoclast number and bone resorption. Further investigations are required to measure the serum TRACP-5b capacity to detect excessive skeletal resorption in racehorses.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Bone is a dynamic organ that responds to its external environment. Cell signaling cascades are initiated within bone cells when changes in mechanical loading occur. To describe these molecular signaling networks that sense a mechanical signal and convert it into a transcriptional response, we proposed the mechanosome model. “GO” and “STOP” mechansomes contain an adhesion-associated protein and a nucleocytoplasmic shuttling transcription factor. “GO” mechanosomes functions to promote the anabolic response of bone to mechanical loading, while “STOP” mechanosomes function to suppress the anabolic response of bone to mechanical loading. While much work has been done to describe the molecular mechanisms that enhance the anabolic response of bone to loading, less is known about the signaling mechanisms that suppress bone’s response to loading. We studied two adhesion-associated proteins, Src and Pyk2, which may function as “STOP” mechanosomes. Src kinase is involved in a number of signaling pathways that respond to changes in external loads on bone. An inhibition of Src causes an increase in the expression of the anabolic bone gene osteocalcin. Additionally, mechanical stimulation of osteoblasts and osteocytes by fluid shear stress further enhanced expression of osteocalcin when Src activity was inhibited. Importantly, fluid shear stress stimulated an increase in nuclear Src activation and activity. The mechanism by which Src participates in attenuating anabolic gene transcription remains unknown. The studies described here suggest Src and Pyk2 increase their association in response to fluid shear stress. Pyk2, a protein-tyrosine kinase, exhibits nucleocytoplasmic shuttling, increased association with methyl-CpG-binding protein 2 (MBD2), and suppression of osteopontin expression in response to fluid shear stress. MBD2, known to be involved in DNA methylation and interpretation of DNA methylation patterns, may aid in fluid shear stress-induced suppression of anabolic bone genes. We conclude that both Src and Pyk2 play a role in regulating bone mass, possibly through a complex with MBD2, and function to limit the anabolic response of bone cells to fluid shear stress through the suppression of anabolic bone gene expression. Taken together, these data support the hypothesis that “STOP” mechanosomes exist and their activity is simulated in response to fluid shear stress.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) is known to be related to bone metabolism. Mutation of STAT3 causes a rare disorder in which serum levels of IgE are elevated. This causes various skeletal problems similar to osteoporosis. To examine the effect of STAT3 in the osteoclast, we obtained two osteoclast specific STAT3 knockout mouse models: one using the CTSK promoter to drive Cre recombinase and another using a TRAP promoter. Examination of these mice at 8 weeks of age revealed a decreased trabecular bone volume in CTSK specific STAT3 knockout mice along with a slight decrease in osteoclast number in both CTSK and TRAP specific STAT3 knockout females. We also noticed changes in bone mineral density and bone mechanical strength in females. These data suggest that STAT3 plays a part in the function of the osteoclast.