Thèse d'exercice : Médecine. Médecine générale : Paris 12 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 105-111.

Le cancer ovarien est le cancer gynécologique le plus létal. L'antigène cancéreux 125 (CA125) est surexprimé dans 80% des cancers épithéliaux de l'ovaire et est le marqueur utilisé présentement pour le suivi des patientes. CA125 est exprimé par les cellules épithéliales cancéreuses de l'ovaire mais pas par les cellules épithéliales normales de l'ovaire. Il s'agit d'une glycoprotéine transmembranaire de type mucine. Les fonctions de ce marqueur demeurent inconnues jusqu'à ce jour. D'après les observations faites sur deux différents modèles d'étude de CA125 de notre laboratoire, nous proposons que le domaine extracellulaire de CA125 pourrait avoir des rôles dans la tumorigénicité et le potentiel métastatique des cellules cancéreuses de l'ovaire. L'objectif de ce projet est la détermination des fonctions du domaine extracellulaire de la mucine CA125 dans la tumorigénicité et le potentiel métastatique des cellules cancéreuses de l'ovaire. Deux modèles ont été utilisés: un modèle de perte de fonction (clones stables CA125 knockdown) et un modèle de gain de fonction (populations stables exprimant les domaines extracellulaires de CA125). Avec les clones stables CA125-knockdown, les interactions hétérotypiques des cellules cancéreuses de l'ovaire dans leur microenvironnement ont été observées. Des expériences de cytométrie de flux ont montré que le CA125 isolé de milieu de culture des cellules OVCAR-3 (cellules CA125-positives) et d'ascite de patiente lie les lymphocytes. De plus, nous avons déterminé par un essai de cytotoxicité que les cellules exprimant CA125 était protégées de la lyse par les cellules NK comparativement aux cellules CA125-knockdown. L'interaction CA125/mésothéline et cellules CA125-positives/cellules mésothéline-positives a également été montrée par différents essais de cytométrie de flux et immunobuvardage de type western.Le modèle de gain de fonction produit consiste en l'établissement de populations stables exprimant à la membrane cellulaire le domaine unique (MUC16-UTM) et le domaine unique ajouté d'une répétition de CA125 (MUC16-1RUTM) dans la lignée cellulaire SKOV3 par un système d'expression lentiviral. Ces populations stables ont servi à montrer que le domaine unique de CA125 était suffisant pour conférer des phénotypes tumorigéniques aux cellules comparativement aux cellules contrôles. En effet, les populations stables MUC16-UTM forment des agrégats très serrés et croissent bien en absence d'ancrage. Les cellules MUC16-1RUTM sont quant à elles plus tumorigéniques que les contrôles, mais moins que les cellules MUC16-UTM. Les deux populations stables ont le même temps de doublement et la même clonogénicité que les cellules contrôles, mais ont une diminution de l'inhibition de contact comme l'ont révélé les courbes de croissance et la formation de foyers post-confluence. Un essai de migration par blessure de la monocouche a révélé que les populations stables MUC16-UTM et MUC16-1RUTM ont également un potentiel migratoire plus important que les cellules contrôles. Ces cellules, en plus d'être plus tumorigéniques, ont aussi un potentiel métastatique plus élevé comparativement aux contrôles. Ces résultats concordent avec des données observées avec un autre modèle de gain de fonction du laboratoire (MUC16-CTD), qui ont aussi été déterminées comme plus tumorigéniques et ayant un potentiel métastatique plus élevé que les cellules contrôles. Ce projet vient donc affirmer que le domaine extracellulaire de CA125 (en particulier le domaine unique) a des fonctions dans la tumorigénicité et le potentiel métastatique des cellules cancéreuses de l'ovaire.

Les microARNs (miARNs), petits ARNs non codants, sont des fins régulateurs de l’expression des gènes. Les miARNs jouent des rôles essentiels dans les processus biologiques physiologiques mais aussi pathologiques. Cependant, leurs rôles durant l’ovogenèse chez les vertébrés demeurent peu documentés. D’une manière similaire aux gènes ovocytes-spécifiques, nous avons proposé l’hypothèse que les miARNs ovaire-prédominants joueraient des rôles essentiels durant l’ovogenèse et/ou le développement embryonnaire précoce. L’objectif de ma thèse était, dans un premier temps, d’identifier les miARNs ovaire-prédominants chez le médaka (Oryzias latipes). Ensuite, dans un deuxième temps, de caractériser le rôle de MiR202, un miARN gonades-prédominant chez les vertébrés. Par une analyse transcriptionnelle à grande échelle, nous avons identifié 66 miARNs ovaire-prédominants chez le médaka, qui, pour la plupart, n’ont jamais été identifiés ni chez le poisson ni dans l’ovaire. Neuf d’entre eux ont été validés par PCRq. Parmi ces derniers, 3 miARNs (MiR4785, MiR6352 et MiR729) présentent une expression ovarienne stricte. De plus, nous avons mis en évidence une isoforme de MiR202 qui est ovaire-prédominante. L’analyse de l’expression de MiR202 durant l’ovogenèse et le développement embryonnaire a montré une expression de ce dernier durant tous les stades de l’ovogenèse. Cependant, il n’est détecté que durant les premiers stades de développement embryonnaire, précédent l’activation du génome zygotique, en cohérence avec un potentiel effet maternel. Afin de caractériser la fonction de MiR202, nous avons réalisé une inactivation fonctionnelle de ce dernier chez le médaka par le système CRISPR/Cas9. La déplétion de mir202 a causé une baisse de fécondité et un arrêt du développement avant le stade une cellule. Une analyse transcriptionnelle globale des ovaires mir202-/-, nous a permis d’identifier plusieurs gènes modulés par MiR202. Parmi eux, six3, cible potentielle de MiR202, semble réguler plusieurs gènes essentiels durant l’ovogenèse ou le développement embryonnaire. Ces travaux nous ont permis d’identifier plusieurs miARNs ovaire-prédominants. Parmi eux, nous avons montré que MiR202 joue un rôle essentiel durant l’ovogenèse et sa contribution en tant que gène à effet maternel est indispensable au développement embryonnaire précoce chez le médaka. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-codant RNAs that emerged as key regulators of gene expression. MiRNAs play important roles in both normal physiological and pathological pathways in many organisms. The involvement of miRNAs in vertebrate oogenesis remains however poorly documented. Based on the assumption that ovarian-specific or ovarian-predominant genes usually play important roles in oogenesis or early development in vertebrates, we searched for ovarian-predominant miRNAs in the medaka (Oryzias latipes) ovary, in one hand. In another hand, we studied the function of MiR202, a gonadal predominant miRNA in vertebrates. Using genome-wide expression analysis, we identify 66 miRNAs predominantly expressed in the ovary, most of them have never been described neither in fish nor in ovaries. Nine were validated by QPCR. Among them, 3 miRNAs exhibit a strict ovarian expression (MiR4785, MiR6352 and MiR729). Further, we identify a novel miR202 isomiR that exhibits an ovarian predominant expression. MiR202 expression analyses during oogenesis and early embryonic development revealed an expression in all oogenesis stages. However, it was only detected in early developmental stages before onset of zygotic genome activation (ZGA), suggesting that this MiR202 is maternally inherited in medaka. To decipher MiR202 function, CRISPR/Cas9 system was used to functionally inactivate this miRNA in medaka. Mir202 depletion causes a reduced fecundity and an early embryonic developmental arrest. Global gene expression profiling of mir202-/- ovaries revealed that many genes are regulated by MiR202. Among them, six3, that could be a putative target of MiR202, seems to be involved in the regulation pathway of many genes that are essential in oogenesis and embryonic development. During my PhD, we identify many ovarian-predominant miRNAs. Among them, we showed that MiR202 plays an essential role during oogenesis and plays a key role during early embryonic development as a maternal effect gene.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les données bibliographiques décrivent un nombre croissant de modèles murins caractérisés sur le plan de la fertilité permettant une meilleure compréhension du phénomène de la croissance folliculaire. Certains de ces modèles animaux, invalidés pour des facteurs de transcription reproduisent un phénotype d’infertilité, telle que l’insuffisance ovarienne primaire (IOP). La compréhension des mécanismes moléculaires des facteurs de transcription essentiels à la fonction ovarienne n’est pas clairement établie. Les protéines contenant des domaines liant l’ADN, tels que les homéodomaines ou les domaines forkhead jouent un rôle-Clé dans le développement ovarien. NOBOX (Newborn Ovary Homeobox) est un facteur de transcription essentiel à la mise en place du stock folliculaire, et dont les mutations sont responsables d’IOP. La fonction exacte de NOBOX n’est pas connue, s’il est présent dans l’ovocyte, nous montrons pour la première fois une forte expression de cette protéine dans les cellules de la granulosa des follicules primordiaux jusqu’au stade secondaire. De plus, par différentes techniques moléculaires, nous mettons en évidence une interaction entre NOBOX et un autre acteur important de la folliculogenèse FOXL2 (Forkhead box l2), contribuant à la régulation de leurs gènes cibles respectifs. Cette étude permet de mettre en lumière le rôle de NOBOX dans les cellules de granulosa. L’IOP est une pathologie touchant 1 % des femmes âgées de moins de 40 ans. Sur le plan ovarien, il y a une déplétion du stock des follicules ou un blocage de la maturation folliculaire. De ce fait, la stérilité est le plus souvent définitive. Une origine génétique de cette maladie est parfois retrouvée avec des mutations des autosomes et/ou du chromosome X, mais dans plus de 80% des cas l’IOP est idiopathique. L’enjeu est donc d’identifier de nouveaux gènes candidats pour cette pathologie. Dans cette étude nous validons la prévalence des mutations du gène NOBOX faisant de ce facteur un des gènes clés de l’IOP. Puis, à l’aide d’une nouvelle technologie : le séquençage multiplex par puces PGMTM ION TORRENT, nous mettons en évidence dans 26% de la cohorte étudiée (100 femmes atteintes d’IOP sporadique primaire ou secondaire) un défaut génétique de 10 gènes, dont 4 nouveaux candidats à l’IOP. De façon intéressante, la présence d’au moins deux gènes mutés chez 9 patientes induit un phénotype plus précoce. Cette étude contribue à une meilleure compréhension de l’origine génétique de l’IOP et met pour la première fois en évidence le phénomène d’oligogénisme chez des patientes en IOP. / Single germline mutations found in women with primary ovarian insufficiency (POI), besides mouse models have provided substantial understanding into the factors involved in differentiation and ovarian development. POI is characterized by amenorrhea with elevated gonadotropin levels, and affects 1% of women before the age of 40 years.Several transcription factors involved in ovary development and folliculogenesis are mutated in reproductive disorders. We have shown a high prevalence of POI cases harboring mutations in the Newborn oogenesis homeobox (NOBOX) gene, which encodes a homeodomain-Containing transcription factor expressed preferentially in oocyte. NOBOX plays a critical role in early folliculogenesis and its absence leads to sterility. In addition to its oocyte localization, we show here that NOBOX is also expressed in granulosa cells (GCs), those surrounding the germ cell. Since NOBOX and FOXL2, a master regulator of GC development (belonging to forkhead family), are co-Expressed in GCs. Here, using several molecular approaches, we have demonstrated that NOBOX and FOXL2 indeed physically interact leading to a down-Regulation of their transactivation capacity. Altogether, these observations highlight a novel role for NOBOX in interaction with FOXL2, and suggest that they may be antagonistic transcription regulators. POI encompasses a heterogeneous spectrum of conditions, through two major mechanisms, follicle dysfunction and follicle depletion. Genetic component such as X chromosome abnormalities, deletions, FMR1 premutations, BMP15 variants, were identified as the first genetic causes of the pathophysiology. Today, the genetic origin of POI is supported by the existence of monogenic forms in humans and animal models but the relevance of several loci for POI pathogenesis should not be ruled out. By means of a next-Generation sequencing , a multiplex (PGM-Ion Torrent technology) sequencing of 19 genes was undertaken in a cohort of 100 nonsyndromic women with POI. In 26 patients, we reported 10 gene defects, among them, missense mutations in 4 new candidates were detected. Our aggregate data suggest that point mutations in these candidate genes are causative of the disease by prediction analysis assays. Two to three gene defects can synergize to produce a more severe phenotype in POI patients than either alone. This study identifies for the first time in a large proportion of POI patients specific sets of germline mutations that, together, may account for this disease. Thus, oligogenicity also has implications for genetic counseling regarding POI.

La culture de cortex ovarien se pose comme une alternative à l'autogreffe après autoconservation ovarienne. Pour améliorer la survie folliculaire après congélation, nous avons évalué chez la brebis l'influence de l'épaisseur de cortex ; 0,5 vs 1mm, du support de culture et du cryoprotecteur DMSO 2M vs PROH 1,5M+sucrose 0,3M. L'épaisseur de tissu de 1mm sur filtre millicell avec le protocole de congélation DMSO 2M a montré les meilleurs résultats avec 39% de survie folliculaire au 4e jour de culture. Sur tissu frais de brebis et humain, nous avons exploré un éventuel déficit d'expression en culture de Gdf9, de Bmp15 et de leur récepteurs qui expliquerait le blocage de croissance folliculaire in vitro. Dans les deux modèles la présence des ARNm et des protéines de Gdf9 et Bmp15 est maintenue et l'expression protéique de leurs récepteurs BmprIA, BmprIB, BmprII est conservée. Ce travail montre que la survie en culture après cryoconservation peut être optimisée, la cause du blocage de croissance reste à définir

Mon laboratoire d’accueil a participé à l’identification du gène R-spondin1, dont les mutations sont responsables d’anomalies cutanées telles que l’hyperkératose palmo-plantaire, les prédispositions aux cancers spinocellulaires et certains types d’inversions de sexe. La génération du modèle murin a permis de montrer que RSPO1, un activateur de la voie de signalisation Wnt/ßcatenin, est nécessaire à la différenciation ovarienne. R-spondin1 et Sox9 sont connus comme étant des facteurs clé de la détermination du sexe femelle et mâle respectivement. J’ai tout d’abord participé à l’étude de leur fonction dans les pathologies d’inversions de sexe afin de déterminer le rôle de chacune de ces voies dans ces processus. L’étude de 2 modèles murins, d’invalidation conditionnelle du gène Sox9, ainsi que de double invalidation des gènes Sox9 et R-spondin1, a permis de montrer que la détermination du sexe est une balance entre la voie de signalisation mâle activée par les Sox et la voie de signalisation femelle activée par R-spondin1. Dans la 2ème partie de ma thèse j’ai évalué le rôle de R-spondin1 dans la physiologie de l’ovaire post-natal en étudiant un modèle murin de gain-de-fonction de R-spondin1 dans l’ovaire, puisque celui-ci est normalement faiblement exprimé au stade adulte. Cette partie de l ‘étude a démontré que le maintien de l'expression de R-spondin1 empêche les cellules nourricières de l’ovaire, les cellules de la granulosa, de se différencier, empêche l'atrésie folliculaire et favorise l’apparition de kystes sanguins après ovulation. / Our lab has contributed to the identification of the R-spondin1 (Rspo1) gene. Disruption of this gene leads to different defects such as palmoplantar hyperkeratosis, predisposition to squamous cell carcinoma and sex reversals. Establishment of the mouse model led to the result that RSPO1, which activates the WNT/ßcatenin signaling pathway, is necessary for ovarian differentiation. Rspo1 and Sox9 are known to be key factors in female and male sex determination, respectively. I first participated to the study of their role in sex reversals, in order to determine the role of each pathway in these processes. The study of 2 different mouse models (conditional knockout of Sox9 and R-spondin1/Sox9 double knockout), led us to the conclusion that sex determination is a balance between the male pathway activated by Sox genes and the female pathway activated by R-spondin1. I then evaluated the role of R-spondin1 in the adult ovary using a mouse model over expressing R-spondin1 in the ovary, as it is usually downregulated in the adult. I was able to observe that maintenance of R-spondin1 expression in the adult keeps the granulosa cell lineage from differentiating properly, prevents atresia in the ovary and may contribute to the formation of blood filled cysts following ovulation. In conclusion, our study shows that sex determination and adult ovary homeostasis need to be highly regulated. Deregulation of key genes such as R-spondin1 can lead to different pathologies, such as sex reversal and tumor formation.

L’objectif de cette thèse était d’identifier une mutation nommée FecLL affectant le nombre d’ovulations et la prolificité des brebis de race Lacaune et d’en analyser les conséquences physiologiques. En associant des approches de génétique et de biologie fonctionnelle à haut débit telles que le séquençage Roche 454 et la spectrométrie de masse, j’ai mis en évidence que la mutation FecLL est un haplotype de 2 SNPs présents dans des régions non-codantes d’un locus de 194,6kb porté par le chromosome 11 ovin. Cette mutation induit la surexpression ovarienne et l’activité du gène B4GALNT2 (beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2) codant une enzyme de glycosylation capable de transférer un sucre N-acétyl-galactosamine sur des glycoprotéines cibles, dont l’inhibine A, une hormone importante pour la fonction ovarienne. Les conséquences de cette glycosylation atypique sont une altération de la production d’inhibine A chez les brebis Lacaune mutées, proposée comme mécanisme initiateur de leur hyper-prolificité. / The aim of this thesis was to identify a mutation called FecLL affecting ovulation rate and prolificacy of Lacaune sheep and to study its physiological consequences. By combining genetics and functional highthroughput biology approaches such as Roche 454 sequencing and mass spectrometry, I evidenced the FecLL mutation as a 2 SNP haplotype present in non-coding regions of a 194.6 kb locus on ovine chromosome 11. This mutation induces ectopic overexpression and ovarian activity of the B4GALNT2 (beta-1,4-N-acetylgalactosaminyl transferase 2) gene encoding a glycosylation enzyme capable of transferring a N-acetylgalactosamine sugar on target glycoproteins. Among those targets, I highlighted inhibin A, an important hormone in ovarian function. The consequences of this atypical glycosylation lead to impaired production of inhibin A in Lacaune mutated sheep proposed as an initiator mechanism of their hyper- prolificacy.

La compréhension de la régulation de l’AMH et de son récepteur spécifique, l’AMHR2, par les BMPs a amené un éclairage nouveau sur leur rôle dans le développement folliculaire et la régulation du taux d’ovulation. Nos résultats se basent sur l’étude de 4 modèles ovins porteurs de mutations Fec, mutations qui affectent des membres de la famille des BMPs, à savoir leur ligand BMP15 ou leur récepteur. Ces mutations se traduisent phénotypiquement par une baisse de l’expression de l’AMH ou de son récepteur dans les cellules folliculaires, et des ovulations multiples chez les brebis porteuses. D’un point de vue mécanistique, nos résultats ont mis en évidence une régulation de l’AMH et de l’AMHR2 par les BMPs in vivo et in vitro, passant par le récepteur BMPR1B, et s’exerçant sur l’activité transcriptionnelle du promoteur de l’AMH via SMAD1 et SF1. Cette régulation a également été en partie mise en évidence dans l’espèce porcine avec une observation supplémentaire dans ce modèle : un taux d’ovulation naturellement très élevé est associé à une faible production ovarienne d’AMH. Ces observations mettent en exergue le rôle possible de l’AMH dans la régulation du taux d’ovulation. / The understanding of the regulation of AMH and its specific receptor, AMHR2, by the BMPs, brought a new highlight on their role in the regulation of follicular development and the control of ovulation rate. Our results are based on the study of 4 sheep models carrying Fec mutations which affect different members of the BMPs family, namely their ligand BMP15 or their receptor, Mutations result phenotypically in a low expression of AMH or AMHR2 in the granulosa cells of ovarian follicles, and multiple ovulations in carrier ewes.. From a mechanistic point of view, the results demonstrated the in vivo and in vitro regulation of AMH and AMHR2 by BMPs, acting through the BMPR1B receptor and enhancing the transcriptional activity of the AMH promoter via SMAD1 and SF1. This regulation has also been partially demonstrated in swine with an additional observation in this model: a naturally high ovulation rate is associated with a low ovarian production of AMH. In conclusion, these observations show a possible role of the AMH in the regulation of ovulation rate.