Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’objectif de cette thèse est la fabrication d’un microdispositif magnétique pour la détection et la manipulation d’éléments biologiques à base de nanoparticules magnétiques en conditions microfluidiques. Il a pour but d’intégrer des fonctions de base de contrôle et détection magnétique, pour atteindre des mesures spécifiques, stables, rapides et reproductibles. En effet, la technique d’immunodosage couplée à des nanoparticules magnétiques, bien connue dans la littérature, nécessite un contrôle du déplacement de ces dernières pour les fonctionnaliser efficacement et créer un complexe biologique encapsulant une molécule cible (biomarqueur). Dans notre cas une molécule modèle pour le domaine de la biodéfense a été utilisée : l’ovalbumine. Pour contrôler le champ magnétique nécessaire pour la capture des complexes magnétiques, nous avons opté pour l’utilisation de microbobines intégrées aux dispositifs fluidiques et comparé cette technique originale avec d’autres plus conventionnelles. Pour détecter un complexe biologique, la fluorescence est largement utilisée en biologie, mais cette technique ne permet pas une intégration complète pour un dispositif autonome. Dans cette optique, nous proposons la détection des complexes à base de nanoparticules magnétiques en relevant la variation de l’inductance d’un microcircuit magnétique refermant une chambre microfluidique contenant ces complexes immunologiques. Le dimensionnement des microbobines de contrôle par simulation a permis de déterminer les paramètres permettant d’obtenir le champ magnétique le plus adapté au contrôle des complexes biologiques. Dans le cas des microbobines utilisées pour la détection, des branches magnétiques micrométriques ont été insérées autour des microbobines pour créer un circuit de détection magnétique encore plus sensible. La réalisation de ces dispositifs a impliqué l’intégration de matériaux et de structures de nature fortement hétérogène, et leur assemblage a nécessité de résoudre de nombreux verrous technologiques. L’enjeu a été de déterminer l’ensemble des étapes successives et nécessaires pour un procédé de microfabrication fiable et reproductible. Pour montrer l’intérêt des dispositifs de capture des nanoparticules magnétiques, des tests immunologiques ont été réalisés tout d’abord en microtubes pour les comparer à ceux réalisés dans un circuit fluidique à l’aide d’aimant externe puis de microbobines intégrées. Dans ce dernier cas, une optimisation considérable a été validée en termes de réduction de temps d’incubation, de reproductibilité des mesures et de limites de détection équivalentes à l’état de l’art pour l’ovalbumine. Pour le dispositif de détection magnétique, des premières expériences de caractérisation électrique ainsi que des études en concentration de nanoparticules magnétiques ont été réalisées et comparées aux résultats obtenus par simulation. Pour la preuve de concept, un démonstrateur de détection de complexes magnétiques a été également finalisé validant la possibilité d’intégration du microcircuit magnétique dans un dispositif fluidique. Il a validé également l’obtention d’une gamme de sensibilité remarquable corrélée à la présence des complexes magnétiques. Ses caractéristiques ont été confrontées à celles obtenues par les simulations et discutées en tenant compte de toutes les étapes critiques du procédé de microfabrication. / RésuméThe objective of this thesis is the fabrication of a magnetic microdevice for the detection and manipulation of biological elements based on magnetic nanoparticles under microfluidic conditions. It aims to integrate basic functions of control and magnetic detection, to achieve specific, stable, fast and reproducible measurements. Indeed, the immunoassay technique coupled to magnetic nanoparticles, well known in the literature, requires a control of the displacement of magnetic nanoparticles to effectively functionalize them and create a biological complex to encapsulate a target molecule (biomarker). In our case, a model molecule for the field of biodefense was used: ovalbumin. To control the magnetic field which is necessary for the capture of magnetic complexes, we opted for the use of microcoils integrated in the fluidic devices and compared this original technique with other more conventional ones. To detect a biological complex, fluorescence is widely used in biology, but this technique does not allow a complete integration for an autonomous device. In this context, we propose the detection of complexes based on magnetic nanoparticles by observing the variation of the inductance of a magnetic microcircuit closing a microfluidic chamber containing these immunological complexes. The design of the control microcoils by simulation made it possible to determine the parameters allowing to obtain the most adapted magnetic field to the control of the biological complexes. In the case of microcoils used for detection, micrometric magnetic branches were inserted around the microcoils to create an even more sensitive magnetic sensing circuit. The realization of these devices involved the integration of materials and structures of highly heterogeneous nature, and their assembly has required to solve many technological locks. The challenge was to determine all the successive and necessary steps for a reliable and reproducible microfabrication process. To show the interest of magnetic nanoparticle capture devices, immunoassays were first performed in microtubes to compare with those made in a fluid circuit using external magnet and integrated microcoils. In the latter case, considerable optimization has been validated in terms of reduction of incubation time, reproducibility of measurements and detection limits equivalent to the state of the art for ovalbumin. For the magnetic detection device, first experiments of electrical characterization as well as concentration studies of magnetic nanoparticles were carried out and compared to the results obtained by simulation. For the proof of concept, a demonstrator of detection of magnetic complexes was also finalized validating the possibility of integration of the magnetic microcircuit in a fluidic device. It has also validated obtaining a remarkable range of sensitivity correlated with the presence of magnetic complexes. Its characteristics were compared to those obtained by the simulations and discussed taking into account all the critical steps of the microfabrication process.

Une des principales limites de la chimiothérapie du cancer est le manque de sélectivité des agents cytotoxiques vis-à-vis des cellules tumorales, entrainant de nombreux effets secondaires. L’intérêt de la vectorisation est d’administrer l’agent cytotoxique sélectivement aux cellules cancéreuses et ainsi d’éviter de faire subir l’action du médicament aux cellules saines. Cette thèse a pour but de synthétiser des prodrogues multivalentes qui utilisent la sous unité B de la toxine de Shiga (STxB) comme agent de vectorisation, ciblant préférentiellement les cellules cancéreuses Gb3-positives. Les deux agents cytotoxiques choisis, un dérivé de la camptothécine et de l’auristatine, ont été liés de façon covalente auvecteur via un espaceur bifonctionnel clivable par le glutathion. L’espaceur a également été remplacé par un répartiteur multivalent susceptible de délivrer une quantité plus importante d’agent cytotoxique à l’intérieur des cellules tumorales.Parallèlement à ce projet de vectorisation d’un agent thérapeutique, des sondes IRM capables de marquer in vivo les tumeurs possédant à leur surface le récepteur Gb3 ont été synthétisées. L’IRM a une très bonne définition spatiale, mais souffre d’un manque de sensibilité. Pour augmenter le contraste, nous avons utilisé une stratégie reposant sur lamultivalence des espaceurs liés à des molécules de DOTA-Gd, un agent de contraste classiquement utilisé en IRM. Ces dernières ont été fixées à STxB via un répartiteur multivalent (des nano-bâtonnets d’or). Le signal IRM est plus intense et donc plus facile à détecter. Enfin, nous avons développé une nouvelle méthode chimique basée sur la ligationoxime pour optimiser la création de conjugués entre STxB et des antigènes comme outils de vaccination. Le conjugué STxB-ovalbumine a permis une meilleure présentation de l’antigène par les cellules dendritiques, conduisant chez la souris à une induction efficace de lymphocytes T. / Pas de résumé en anglais

Pas de résumé / Recently targeted therapies appeared as attractive alternatives to classical antitumoral treatments. The approach, developed on the concept of targeting drug to cancer cells, aims to spear normal tissues and decrease the side effects. This doctoral dissertation focuses on developing new anticancer targeted treatments in the field of chemotherapy and cancer immunotherapy by exploiting an original targeting moiety, the B subunit of Shiga toxin (STxB). Its specific properties, such as, recognition with its receptor Gb3 overexpressed in cancer cells or in antigen-presenting cells, its unconventional intracellular trafficking, guided the choice of this protein as targeting carrier. This project is based in the use of copper-free Huisgen [3+2] cycloaddition as a coupling method, which led to successful preparation of various conjugates for their respective applications. The concept was first validated by STxB-biotin conjugate. The high yield of the reaction and the compatibility between the targeting carrier and the chemical ligation promoted the design of conjugates for chemotherapy and immunotherapy. Two therapeutical optimizations of previously developed strategy in STxB drug targeting delivery were investigated: synthesis of multivalent drug-conjugates and synthesis of conjugates containing a highly potent anticancer agent. Both approaches exploited three anticancer agents: SN38, Doxorubicin and Monomethyl auristatin F. The disulfide spacer, combined with various self-immolative systems, insured drug release. Two cytotoxic conjugates STxB–doxorubicin (STxB-Doxo) and STxB-monomethyl auristatin F (STxB-MMAF) were obtained in very high yield and demonstrated strong tumor inhibition activity in the nanomolar range on Gb3-positive cells. Based on the results the STxB-MMAF conjugate was investigated on a mouse model. The project aimed also to develop STxB bioconjugates for vaccine applications. Previous studies used B subunit as a targeting carrier coupled to an antigenic protein in order to induce a more potent immune response against cancer. The conjugates were prepared using a commercial linker, requiring modifying the antigen at first place, or by oxime ligation, where slightly acidic conditions promoted the coupling. Thus, the work presented herein proposed an alternative ligation via copper-free click chemistry especially for more sensitive antigenic proteins. Various types of conjugates were synthesised and investigated for their immune stimulation properties. The STxB targeting strategy was also applied to the development of a new vaccine based on coupling the targeting carrier to alpha-GalCer, one of the most potent immune stimulating agents known. The work focused on the synthesis of functionalised alpha-Galcer with an azide handle.

Les phases concentrées de protéines sont au centre de nombreuses études visant à identifier et caractériser les interactions et transitions de phases mises en jeu, en utilisant le large corpus de connaissances acquis sur les phases concentrées de colloïdes. Ces phases concentrées de protéines possèdent en outre une grande importance dans des domaines aussi variés que l’industrie agroalimentaire, l’industrie pharmaceutique et la médecine. L’établissement d’équations d’état présentant la pression osmotique (Π) en fonction de la fraction volumique (Φ) est une méthode efficace de caractérisation des interactions entre les composants d’un système. Nous l’avons appliquée à des solutions de deux protéines globulaires, le lysozyme et l’ovalbumine, en balayant une gamme de fractions volumiques allant d’une phase diluée (Φ < 0,01) à une phase concentrée, solide (Φ > 0,62). Les équations d’état obtenues, couplées à d’autres techniques (SAXS, simulations numériques), ont permis de mettre en évidence un comportement très différent des deux protéines lors de la concentration et ont montré leur complexité en comparaison avec des colloïdes modèles. La mise en relation des équations d’état et du comportement interfacial de ces deux protéines a montré des points de convergence et permis de formuler une nouvelle hypothèse expliquant certaines observations portant sur l’adsorption des protéines à l’interface air-eau. / Concentrated phases of proteins are the subject of numerous studies aiming at identifying and characterizing the interactions and phase transitions at play, using the large corpus of knowledge in the field of concentrated colloids. Those concentrated phases of proteins have, in addition, a great importance in various fields, such as food industry, pharmaceutical industry and medicine. The establishment of equations of state relating osmotic pressure (Ð) and volume fraction (Φ) is an efficient way of characterization of the interactions between the components of a system. We applied this method to solutions of two globular proteins, lysozyme and ovalbumin, spanning volume fractions ranging from a dilute phase ( Φ < 0,01) to a concentrated, solid phase ( Φ > 0,62). The equations of state, coupled to other methods (SAXS, numerical simulations), enabled us to show that the two proteins carry a very different behavior when submitted to concentration and that their complexity is beyond that of colloids. Relating equations of state and interfacial behavior of these two proteins also showed points of convergence and enabled us to formulate a new hypothesis which explains some of the results obtained in the study of adsorption of proteins at the air-water interface.