Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 126-136. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Mise en contexte: Pour augmenter le taux de succès du transfert d'embryons chez la vache l'administration de FSH (follicle stimulating hormone) comme un facteur de la superovulation a été étudiée depuis des années. Cependant, dans des récents articles publiés on note que l'utilisation de la superovulation chez la vache peut mettre en péril de la qualité de l'ovocyte au moment de l'ovulation et que la superovulation pourrait causer des anomalies de la stéroïdogénèse folliculaire et une mauvaise préparation de l'ovocyte. De plus elle peut causer de la méthylation aberrante. L'objectif de ce travail est donc d'analyser le rôle potentiel de la FSH sur le transcriptome ovocytaire. Méthode: Les ovocytes bovin sont obtenus soit d'un cycle naturel et ou un cycle superovulé · (299 UI de FSH deux fois par jours en diminuant pendant quatre jours, prostaglandines [22.5 · mg] administrées avec la première dose de FSH pour induire un nouveau cycle oestral) et les ovocytes sont récupérés 2 h pre LH, 6 h post LH et 22 .h post LH. Les ovocytes provenant d'ovocytes superovulés et non superovulés à différents stades de maturation sont extraits et leur ARN transcrit en ADN pour ensuite êtrè hybridés sur une micropuce d'ADNc bovine. Deux profils d'hybridation ont été établis, le premier volet contient trois hybridations avec les ovocytes superovulés, collectés in vivo à 2 h, 6 h et 22 h avec ceux de la nonsuperovulation, le deuxième volet contient quatre hybridations avec les ovocytes superovulés, collectés in vivo à 2 h pre LH, 6 h- et 2'2 h post LH et les ovocytes nonsuperovulés, collectés à la même heure. À partir des hybridations, 13 gènes candidats ont été sélectionnés en lien possible avec la compétence de l'ovocyte. Le RT-PCR en temps réel a été utilisé pour mesurer le niveau ARNm dans différences conditions: ovocytes superovulés et collectés à 2 h pre LH, 6 h post LH, 22 h post LH; ovocytes nonsuperovulés et collectés à 2 h preLH, 6 h post LH, 22 h . post LH. Résultat: Les gènes BTG4, PTTGI, LEOI et .PAPOLA présentent une différence significative au niveau de ARNm dans les ovocytes superovulés quelque soit le temps de maturation. Le GDF9 présente un taux d'ARNm le plus élevé dans les ovocytes collectés à 2 h pre LH et 6 h post LH comparativement à 22 h post LH quel que soit le traitement. La différence dans le niveau d'expression d'ARNm a amélioré nos connaissances de l'expression de gène chez les ovocytes superovulés par FSH et nous fournit un aperçu des voies moléculaires qui sont affectées par la stimulation ovarienne

La membrane est aujourd'hui perçue comme une mosaïque de micro-domaines membranaires, ou « lipid rafts ». Ces domaines sont moins fluides que le reste de la membrane, car ils sont enrichis en cholestérol et en sphingolipides à longues chaînes saturées. Ils comportent peu de protéines, mais plusieurs de celles-ci sont impliquées dans la signalisation cellulaire. C'est pour cette raison que les « rafts » sont considérés comme des plates-formes de signalisation cellulaire. Les investigations réalisées sur les « rafts » au niveau des gamètes femelles ont essentiellement été pratiquées sur les œufs de Xenopus, mais chez les mammifères presque rien n'a encore été démontré quant à la présence et surtout à la fonctionnalité des « rafts » dans les ovocytes et autres cellules du follicule ovarien. Ce mémoire présente une étude des « lipid rafts » des ovocytes, des cellules de la granulosa et des complexes ovocyte-cumulus porcins. / Nowadays, plasma membrane is perceived as a mosaic of micro-domains called lipid rafts. Because of their enrichment in cholesterol and sphingolipids, these domains are less fluid than the bulk membrane. Only a few proteins partition into lipid rafts, but most of these are implicated in cell signalling. For this reason, lipid rafts are considered as platforms for cell signalling. Most of the investigations performed on female gametes were realised on Xenopus eggs, but not much as been done yet to assess the presence and especially the functionality of lipid rafts of the oocytes and other cell types of the mammalian ovarian follicle. The present study investigates the presence and the functionality of lipid rafts in porcine oocytes, granulosa cells and cumulus-oocyte complex.

Les ovocytes bovins incubés in vitro reprennent la méiose alors que ceux incubés en présence de mono-couches de cellules de la thèque demeurent au stade de vésicule germinale (GV). Les présentes expériences ont été menées sur des ovocytes bovins afin de mieux comprendre les facteurs impliqués dans le contrôle de la maturation des ovocytes. Les objectives étaient 1) de déterminer si la morphologie du complexe ovocyte-cumulus (COCs) est corrélée avec les cinétiques de la reprise méiotique suivant une période d’arrêt méiotique induite. 2) Étudier la fonction des inhibiteurs de phosphodiesterase (PDE) spécifiques seuls ou en présence de une monocouche des cellules de la thèque sur l’arrêt méiotique des ovocytes bovins. 3) Étudier le rôle de la voie de signalisation de la protéine kinase A et de la protéine kinase C dans la modulation de la reprise méiotique des ovocytes bovins. 4) Faire une caractérisation plus poussée du facteur d’inhibition sécrété par les cellules de la thèque. Ces études démontrent que les COCs bovins reprennent la méiose plus rapidement après une courte période d’arrêt méiotique que les COCs non traités. Les ovocytes atrésiques ou dénudés sont donc moins nombreux au stage de GV au début de la maturation que les COCs sains ou légèrement atrésiques. Les inhibiteurs de phosphodiesterase (PDE) de type 3 ont maintenu les ovocytes bovins en arrêt méiotique alors que les inhibiteurs de type 4 n’ont eu aucun effet. De plus, la combinaison des inhibiteurs PDE et des cellules de la thèque montre un effet additif. Les COCs incubés avec des cellules de la thèque sont restés en arrêt méiotique alors que ceux incubés en présence de cellules de granulosa ont repris la méiose. Les cellules de la granulosa non traitées ont annulé l’effet inhibiteur des cellules de la thèque sur la maturation des COCs bovins. Par ailleurs, les COCs sont restés en arrêt méiotique lorsque des analogues d’AMPc ont été utilisés en conjonction avec des cellules de granulosa et de la thèque. Finalement, le facteur inhibiteur sécrété par les cellules de la thèque dans le milieu conditionné est (a) insensible à la chaleur, aux enzymes protéolytiques et à un traitement au charbon, (b) sensible à un traitement au chloroforme, (c) concentré dans la fraction plus petite que 1000 daltons du milieu conditionné et (d) les patrons de pics chromatographiques sont différents entre le milieu conditionné et le milieu frais. D’autres études seront nécessaires pour l’isolation complète du facteur(s) inhibiteur(s) sécrété(s) par les cellules de la thèque responsable du maintien de l’arrêt méiotique des ovocytes bovins. / Bovine oocytes incubated in vitro resume meiosis, whereas most of those incubated with theca cell monolayers remain at the germinal vesicle (GV) stage. Experiments were carried out using bovine oocytes to understand the factors involved in the control of oocyte maturation. The objectives were 1) to determine whether or not the morphology of cumulus oocyte complexes (COC) is correlated with the kinetics of meiotic resumption following a period of induced meiotic arrest. 2) To investigate the role of type-specific phosphodiesterase (PDE) inhibitors alone or in conjunction with theca cell monolayers on meiotic arrest of bovine oocytes. 3) To study the role of the protein kinase A and protein kinase C signaling pathways in the control of meiotic resumption of bovine oocytes incubated with granulosa cells, theca cell monolayers or both cell types. 4) To further characterize the inhibitory factor secreted by the theca cell monolayers. These studies show that bovine COCs resume meiosis faster following a short period of induced meiotic arrest than untreated COCs. Atretic or denuded oocytes have fewer oocytes at the GV stage at the onset of maturation compared to healthy or slightly atretic COCs. Type 3 phosphodiesterase (PDE) inhibitors maintained bovine oocytes in meiotic arrest, whereas type 4 PDE inhibitors did not have an effect. Furthermore, PDE inhibitors and the theca cell monolayers show an additive effect. COCs incubated with the theca cell monolayer remained in meiotic arrest, whereas those incubated with granulosa cells resumed meiosis. Untreated granulosa cell abrogate the inhibitory effect of the theca cell monolayers on the maturation of COCs. However, COCs remain in meiotic arrest when cAMP analogs are used in conjunction with both granulosa and theca cells. The inhibitory factor(s) secreted by the theca cell monolayers is (a) not sensitive to heat, proteolytic enzymes and charcoal treatment, (b) sensitive to chloroform treatment, (c) has a Mr less than 1000 daltons and (d) the patterns of chromatographic peaks are different in conditioned medium and fresh medium. Further work is needed to fully isolate and identify the factor produced by the theca cells responsible for maintaining bovine oocytes in meiotic arrest.

Durant la croissance, les ovocytes emmagasinent des quantités importantes d’ARNm maternel dans leur cytoplasme. Ces ARNm pourront plus tard être traduit en protéines afin de soutenir la maturation ovocytaire et le développement précoce et ce, jusqu’à l’activation du génome de l’embryon qui est une étape cruciale du développement. Trois catégories d’ARNm peuvent être distinguées durant cette période : les ARNm emmagasinés, les ARNm en voie de traduction (ARNm polyribosomaux) et les ARNm voués à la dégradation. De ces trois catégories, seuls les ARNm polyribosomaux ont un impact direct sur la physiologie cellulaire sous-jacente. Dans cet ouvrage, j’ai développé une méthode permettant d’isoler les ARN polyribosomaux afin de faciliter l’étude de la physiologie de l’ovocyte et de l’embryon précoce. Cette méthodologie a permis de découvrir plusieurs faits très intéressants portant sur le métabolisme énergétique et la synthèse protéique durant la maturation ovocytaire. Les cinq complexes mitochondriaux ainsi que la production énergétique sont fortement diminués durant la maturation ovocytaire. L’impact direct d’une telle inhibition se traduit par une réduction de la production d’ATP par la mitochondrie et l’initiation d’une quiescence dans l’ovocyte entraînant une diminution importante des capacités traductionnelles. Ces découvertes m’ont amenés à m’enquérir de la présence de mécanismes alternatifs dans l’ovocyte permettant de soutenir les besoins énergétiques durant la maturation. Le transfert de molécules telles que l’AMP et l’AMPc provenant des cellules du cumulus ainsi que la récupération des AMP libérés au moment de la dégradation de la queue poly(A) des ARNm maternels semblent être deux mécanismes d’importance permettant de soutenir les besoins énergétiques de l’ovocyte. Il semble donc que la maturation ovocytaire représente une période de préparation à la fécondation caractérisée par une maturation nucléaire, cytoplasmique et moléculaire mais également une période d’entrée en quiescence et de ralentissement métabolique afin de survivre aux nombreuses heures d’attentes précédent la fécondation et avant l’activation du génome embryonnaire. / During growth, oocytes store large quantities of maternal mRNAs within their cytoplasm. These mRNAs can then be translated into proteins at different times to sustain oocyte maturation and early development, up until a crucial step in development: the embryonic genome activation. Three categories of mRNAs can be identified during this period: stored mRNAs, mRNAs in the process of being translated (polyribosomal mRNAs) and mRNAs fated for decay. Of these three categories, only polyribosomal mRNAs have an impact on the underlying cell physiology. Within this text, we have developed a method to isolate polyribosomal mRNAs to facilitate the study of oocyte and early embryo physiology. This methodology allowed us to investigate the energetic metabolism of mitochondria and protein synthesis during oocyte maturation. All five mitochondrial complexes as well as energy production are strongly incapacitated during oocyte maturation. The direct impact of such an incapacitation is a limitation of ATP production by mitochondria and the initiation of quiescence within the oocyte which results in an important diminution of translational potential. These discoveries caused us to start inquiring about the presence of alternative mechanisms which could sustain the energetic needs of the oocyte during maturation. The transfer of molecules such as AMP and AMPc from the cumulus and the salvage of AMPs freed during the degradation of the poly(A) tail of maternal mRNAs appear to be two important mechanisms which could sustain the energetic needs of the oocyte. Thus, it seems that oocyte maturation represents not only a period of preparation for fertilization through a nuclear, cytoplasmic and molecular maturation but also a period of entry into quiescence and metabolic slow down in order to survive the long wait before fertilization and subsequent embryonic genome activation.

Le développement des follicules, des ovocytes et des embryons sont des processus biologiques qui contrôlent la possibilité de devenir un organisme vivant. La maturation des ovocytes est un événement tout à fait unique avec deux divisions asymétriques, la méiose, mais également caractérisée par l'arrêt de la transcription et le stockage des transcrits et des protéines nécessaires au développement embryonnaire précoce. Comme nous le savons, le liquide folliculaire forme partie du micro environnement autour de l'ovocyte et influence la compétence de l'ovocyte. Cependant, la composition du liquide folliculaire peut changer sous divers statuts nutritionnels, tels que l'obésité chez l'homme et un bilan énergétique négatif chez les vaches et les truies. Ces modifications moléculaires du liquide folliculaire induites par les conditions métaboliques maternelles peuvent affecter la qualité des ovocytes, le développement embryonnaire et peuvent par la suite provoquer des troubles métaboliques et autres maladies chez les prochaines générations. Ces dernières années, de nouvelles études se sont concentrées sur les effets de contextes nutritionnels anormaux, p.ex., niveaux élevés d'acides gras non estérifiés (AGNE), sur les cellules de la granulosa, les cellules du cumulus, les ovocytes et le développement précoce de l'embryon chez diverses espèces, notamment chez l'homme, la souris et le bétail. Dans cette thèse, le porc a été utilisé comme modèle expérimental. Le porc est un excellent modèle pour étudier l'impact de la nutrition sur la fonction ovarienne chez l'homme, puisqu'il existe de nombreuses similitudes entre les porcs et l'homme telles que la physiologie digestive et la durée approximative de la maturation in vitro (IVM). En outre, les niveaux élevés d'AGNE induits par la nutrition existent également pendant la lactation chez les porcs. Enfin, les embryons de porc peuvent être générés in vitro et leur étude n'est pas soumise aux mêmes limitations éthiques que les humains. Pour mieux comprendre les effets de niveaux élevés d'AGNE au cours de la maturation des ovocytes chez le porc, des ovocytes porcins ont été exposés au milieu de maturation in vitro contenant une combinaison de niveaux élevés d'AGNE. Des puces à ADN ont été utilisées pour obtenir des informations globales sur les schémas transcriptomiques et de méthylation de l'ADN des blastocystes provenant des ovocytes exposés aux AGNE. Afin de mieux mimer un environnement folliculaire fonctionnel lors de la maturation, des ovocytes exposés aux AGNE ont été co-cultivés ou non avec des cellules de la granulosa porcine issues de follicules de taille moyenne (diamètre entre 3 et 5 mm). Pour capturer la réponse des cellules de la granulosa aux AGNE, les informations transcriptomiques des cellules de la granulosa co-cultivées ont également été étudiées. Le travail réalisé dans cette thèse nous a permis de mettre en évidence et d'expliquer les impacts de niveaux élevés d'AGNE folliculaires sur les blastocystes issus d'ovocytes exposés aux AGNE et les cellules de la granulosa co-cultivées. Les ovocytes exposés aux AGNE ont moins de potentiel de se développer en blastocystes, et les blastocystes dérivés ont montré une inflammation, plus d'apoptose, et des changements métaboliques des schémas transcriptomiques et de méthylation de l'ADN. La méthylation différente de l'ADN ouvre la possibilité de transmettre les impacts induits par les AGNE aux générations suivantes. Lorsque les voies affectées des blastocystes provenant d'ovocytes avec coculture de cellules de la granulosa ont été comparées à celles sans coculture, davantage de voies anti-inflammatoires ont été observées dans des conditions de coculture, suggérant le rôle protecteur des cellules de la granulosa dans la diminution des effets néfastes des AGNE sur les ovocytes. En examinant le transcriptome des cellules de la granulosa avec ou sans AGNE, nous avons observé que les cellules de la granulosa étaient capables d'atténuer les effets néfastes des AGNE sur les ovocytes par la régulation du métabolisme, des facteurs anti-inflammatoires et l'inhibition de la transition épithéliale-mésenchymateuse. Le dernier chapitre résume le métabolisme des acides gras dans les ovocytes, les cellules folliculaires et les embryons, et traite également des effets néfastes de l'exposition aux AGNE pendant la maturation in vitro sur les ovocytes, les cellules folliculaires et les embryons. Les informations dérivées des résultats mettent en évidence les effets néfastes des niveaux élevés d'AGNE dans le liquide folliculaire induits par l'état nutritionnel maternelle avec un aperçu global des schémas transcriptomiques et de méthylation de l'ADN chez les porcs. Ensuite, le rôle des cellules de la granulosa dans la protection des ovocytes envers l'environnement défavorable des acides gras en excès est proposé. Les connaissances acquises donnent une idée du métabolisme du niveau élevé d'acides gras dans les follicules et suggèrent l'importance d'une concentration appropriée d'acide gras pendant la folliculogenèse et la maturation des ovocytes. / The development of follicles, oocytes, and embryos are the biological processes that control the possibility to become a living organism. The oocyte maturation is a quite unique event with two asymmetric cleavages, the meiosis, but also characterized by the arrest of transcription and the storage of transcripts and proteins required for early embryonic development. As we know, the follicular fluid is part of the microenvironment surrounding the oocyte and influences the oocyte competence. However, the composition of follicular fluid may change under various nutrition statuses, such as obesity in humans and negative energy balance in cows and sows. These maternal metabolic conditions induce follicular fluid changes may affect oocyte quality, embryonic development, and subsequently cause metabolic problems and diseases in the next generations. In recent years, new studies focused on the effects of abnormal nutrition contexts, e.g., elevated levels of non-esterified fatty acids (NEFAs), on granulosa cells, cumulus cells, oocytes, and early embryo development in various species including humans, mice, and cattle. In this thesis, the pig was used as the experimental model. The pig is an excellent model to study the impacts of nutrition on human ovarian function since there are many similarities between pigs and humans, such as digestive physiology and approximate length of in vitro maturation (IVM). Besides, the nutrition-induced elevated levels of NEFA also exist during the lactation in pigs. Finally, porcine embryos can be generated in vitro and are not subjected to the same ethical limitations as human embryos. To better understand the effects of elevated levels of NEFAs during oocyte maturation in pigs, porcine oocytes were exposed to an in vitro maturation medium containing a combination of high level of NEFAs. Microarrays were used to draw global information of the transcriptomic and DNA methylation patterns of blastocysts originated from NEFAs' exposed oocytes. To better mimic a functional follicular environment during maturation, oocytes exposed to NEFAs were co-cultured or not with porcine granulosa cells from medium size follicles (diameter between 3 and 5 mm). To capture the response of granulosa cells to NEFAs, the transcriptomic information of the cocultured granulosa cells was also investigated. The work completed in this thesis allowed us to highlight and explain the impacts of elevated levels of follicular NEFAs on the blastocysts originated from NEFAs-exposed oocytes and the cocultured granulosa cells. NEFAs-exposed oocytes have less potential to develop into blastocysts, and the derived blastocysts showed inflammation, more apoptosis, and metabolic changes both in transcriptomic and DNA methylation patterns. The altered DNA methylation opens the possibility of transmitting the NEFAs-induced impacts to subsequent generations. When the affected pathways of blastocysts originated from oocytes cocultured with granulosa cells were compared to those without coculture, more anti-inflammatory pathways were observed in coculture condition, suggesting the protective role of granulosa cells in decreasing the detrimental effects of NEFAs on oocytes. Looking at the granulosa cell transcriptome with or without NEFAs, we observed that the granulosa cells were able to attenuate the adverse effects of NEFAs on oocytes through regulation of metabolism, anti-inflammatory factors, and inhibition of the epithelial-mesenchymal transition. The last chapter summarizes the metabolism of fatty acids in oocytes, follicular cells, and embryos, and also discusses the adverse impacts of exposure to NEFAs during IVM on oocytes, follicular cells, and embryos. The information derived from the results highlights the detrimental impacts of maternal nutrition-induced elevated NEFAs levels in follicular fluid with a global overview of the transcriptomic and DNA methylation patterns in pigs. Then the role of granulosa cells in protecting the oocytes from the adverse environment of excess fatty acids is proposed. The acquired knowledge provides the idea about the metabolism of the high level of fatty acids in follicles and suggests the importance of a suitable concentration of fatty acids during folliculogenesis and oocyte maturation.

Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux modulations du transcriptome de l’ovocyte bovin en lien avec son potentiel à produire un embryon. Nous avons tout d’abord utilisé un modèle où la qualité des ovocytes a pu être modulée in vivo dans un contexte de stimulation ovarienne. Nous avons pu observer que la qualité des ovocytes acquise au cours de cette période avait une durée limitée et qu’un possible mécanisme de dégradation des ARN messagers pouvait être impliqué dans cette diminution de la qualité. Afin de mieux définir l’importance de la LH pour l’ovocyte lors de sa croissance finale dans le follicule, un antagoniste de la GnRH a été utilisé durant la période cruciale où la qualité des ovocytes est acquise. La suppression dela sécrétion de LH n’a pas eu d’impact significatif sur le potentiel de l’ovocyte à produire un embryon, bien que des fonctions cellulaires importantes, telles que la régulation de la traduction semble avoir été affectéedans l’ovocyte par le traitement. Le transcriptome des ovocytes récupérés à partir de follicules de taille spécifique nous a permis de mieux définir les changements qui surviennent de façon séquentielle au cours de la croissance normale du follicule. Une modulation importante et graduelle de plusieurs transcrits impliqués dans le remodelage de la chromatine a d’ailleurs été observée, ce qui illustre l’importance de cette modification au cours de l’acquisition graduelle de la compétence au développement. Compte tenu de l’importante des changements qui surviennent au cours de la croissance finale de l’ovocyte au niveau de la configuration de la chromatine de la vésicule germinale, nous avons analysé le transcriptome des ovocytes au cours des différents stades de condensation de la chromatine. Malgré la diminution importante de la transcription qui se produit en parallèle à la compaction de la chromatine, nous avons pu observer une augmentation de plusieurs ARN messagers d’histones au cours de cette période, ce qui suggère uneaccumulation en vue d’assurer les premiers cycles cellulaires. Ce projet nous a donc permis de mieux définir les changements qui surviennent dans l’ovocyte au cours de sa croissance finale, au moment où la qualité ovocytaire est significativement modulée. Nous avons également proposé certaines hypothèses afin d’expliquer cette diminution de la qualité. / In this study, we specifically looked at the mRNA modulations observed in the bovine oocyte in regard of its potential to produce an embryo. We first used a model where the oocyte quality could be modulated in vivo, using ovarian stimulation. We were able to show that the oocyte quality acquired during that period will not last and we proposed a possible mechanism of RNA degradation that could be implicated in the decrease of oocyte quality. In order to better understand the importance of the LH support for the oocyte at the end of follicle growth, a GnRH antagonist was used during the period where the oocyte quality is gained. Although the suppression of the LH secretion did not have a significant impact on the potential of the oocyte to produce an embryo, important cellular functions such as translation regulation were affected in the oocyte by the treatment. The transcriptome analysis of the oocyte collected from follicles of gradually increasing sizes has allowed us to better understand the sequential changes undergoing in the oocyte during the follicular growth. An important and gradual modulation of several transcripts involved in chromatin remodeling was also identified, illustrating the importance of this process in the gradual developmental potential acquisition. Considering the major chromatin remodeling of the germinal vesicle that is known to occur towards the end of oocyte growth, we decided to analyse the transcriptome of these oocytes, grouped according to their degree of chromatin compaction. Although an important decrease of the transcriptional activity will occur in parallel with the chromatin condensation, we were able to observe the accumulation of several histone mRNA over this period, suggesting a potential storage to fulfill the first few cell cycles. This project has allowed us to better define the molecular changes undergoing in the oocyte during its growth, where the oocyte quality is significantly modulated. It was also possible to propose different hypothesis in order to explain the underlying biological causes of this decrease quality.

La croissance ovocytaire comprend l'établissement de projections transzonales formant un réseau de communication entre le gamète et les cellules somatiques entourant ce dernier. Une accumulation des ARNm dans le cytoplasme se produit lors des premiers stades de croissance de l'ovocyte afin de soutenir la maturation durant le silence transcriptionnel qui perdure jusqu'à l'activation du génome embryonnaire. Selon l'espèce, cette période peut durer des jours voir des semaines nécessitant une grande stabilité des ARNm maternels. Il est connu que la communication entre l'ovocyte et les cellules somatiques ainsi que l'utilisation des réserves d'ARNm sont essentielles pour l'acquisition des compétences de l'ovocyte afin de soutenir la fécondation et le développement embryonnaire précoce. Des modifications chimiques connues comme ayant un rôle stabilisateur, tel que la méthylation, ont également été détectées sur les ARNm. L'hypothèse est que des modifications chimiques de l'ARNm, soit l'ajout de groupements méthyles, sont impliquées dans la stabilisation des transcrits au sein de l'ovocyte durant le silence transcriptionnel. Le réseau de communication pourrait jouer un rôle en faisant le transfert de protéines permettant la méthylation de l'ARNm. Les objectifs sont de détecter les différentes modifications chimiques ayant lieu dans le transcriptome de l'ovocyte ainsi que localiser et caractériser les protéines ayant pour rôle de catalyser, détecter et inverser les modifications chimiques identifiées sur l'ARN. Différents types de modifications post-transcriptionnelles ont été détectées au sein de l'ovocyte et les résultats montrent que m⁶A et m⁵C sont les modifications les plus abondantes. La caractérisation des protéines impliquées dans ces modifications dans l'ovaire et l'ovocyte de la souris, du porc et du bovin montre une activité de méthylation différente selon l'espèce durant la folliculogenèse et l'ovogenèse. De plus amples recherches devront être réalisées afin de bonifier la compréhension des mécanismes impliqués dans la production d'un ovocyte de qualité. Les travaux présentés contribuent à l'avancement de ces connaissances. / Oogenesis, which occurs within the ovarian follicle, is a process closely link to folliculogenesis. The oocyte growth mainly involves the establishment of a communication network between the gamete and surrounding somatic cells. During the early stages of oocyte growth, the gamete accumulates mRNAs in its cytoplasm to support maturation and first cell division during transcriptional silencing until the embryonic genome activation. This period can last from days to weeks depending on the species requiring long stability from maternal mRNAs. It is known that communication between oocyte and somatic cells and use of mRNA reserves are essential for oocyte competence acquisition to sustain fertilization and early embryogenesis. Chemical modifications known to have stabilizing role, such as methylation, have also been detected on the mRNAs. The main hypothesis is the chemical modifications of mRNA, by the addition of methyl groups, that are involved in stabilizing and managing transcripts within oocyte during transcriptional silencing. The communication network could have a role in enabling proteins transfer from cumulus cells allowing mRNA methylation. Objectives are to detect various chemical modifications taking place in oocyte transcriptome and to locate and characterize proteins having role of managing the chemical modifications identified on RNA. Many post-transcriptional modifications have been detected within the oocyte and results have shown that m⁶A and m⁵C are modifications with higher abundant expression. Proteins characterization involved in these post-transcriptional modifications in ovary and oocyte of mouse, swine and bovine showed methylation activity during folliculogenesis and oogenesis. More research is needed to improve understanding of mechanisms involved in oocyte competences acquisition, but the present study has contributed to the advancement of this knowledge.

Les compétences uniques que possède l'ovocyte sont assurées par les facteurs maternels, synthétisés et stockés dans l'ovocyte au cours de sa croissance. Ces derniers sont nécessaires à la reprise de la méiose, au déclenchement des premières mitoses et à l'activation du génome embryonnaire. Ce projet de recherche vise à identifier les gènes spécifiques à l'ovocyte conservés au cours de l'évolution qui sont impliqués dans les mécanismes moléculaires responsables du potentiel de développement unique à l'ovocyte. La première étape de ce projet consiste en l'identification des gènes spécifiques à l'ovocyte chez la souris, le bovin et Xenopus laevis. Afin de répondre à cet objectif, la technique des librairies soustractives et la technologie des microarrays d'ADNc ont été utilisés. Par la suite, une analyse comparative du transcriptome ovocytaire du bovin, de la souris et de Xenopus laevis a permis d'identifier les gènes spécifiques à l'ovocyte et conservés au cours de l'évolution. En premier lieu, une lame de microarray d'ADNc multi-espèces spécifique à l'ovocyte a été construite à partir de transcrits dérivés de librairies soustractives enrichies de gènes spécifiques à l'ovocyte. Par la suite, une lame de microarray d'oligonucléotides contenant plus de 20 000 transcrits dérivés de librairies d'ovocytes, d'embryons et de cellules souches de souris a été utilisée afin d'effectuer des hybridations inter-espèces avec des ovocytes de bovin et de Xenopus laevis. Les résultats de ces expériences ont permis de démontrer qu'il existe un degré de conservation très élevé parmi les gènes exprimés dans les ovocytes des trois espèces. Finalement, l'analyse globale du profil d'expression des gènes exprimés au cours du développement embryonnaire in vivo chez le bovin a été effectuée. Cette étude a permis de comparer les gènes d'origine maternelle à ceux du génome embryonnaire afin de déterminer l'importance des ARNm présents à ces stades. Les résultats présentés dans le cadre de cette thèse démontrent que l'étude du transcriptome ovocytaire et embryonnaire ainsi que les analyses comparatives permettent l'identification de gènes spécifiques à l'ovocyte conservés au cours de l'évolution. La caractérisation éventuelle de ces gènes permettra ainsi l'avancement de nos connaissances concernant les mécanismes moléculaires uniques à l'ovocyte.