La membrane est aujourd'hui perçue comme une mosaïque de micro-domaines membranaires, ou « lipid rafts ». Ces domaines sont moins fluides que le reste de la membrane, car ils sont enrichis en cholestérol et en sphingolipides à longues chaînes saturées. Ils comportent peu de protéines, mais plusieurs de celles-ci sont impliquées dans la signalisation cellulaire. C'est pour cette raison que les « rafts » sont considérés comme des plates-formes de signalisation cellulaire. Les investigations réalisées sur les « rafts » au niveau des gamètes femelles ont essentiellement été pratiquées sur les œufs de Xenopus, mais chez les mammifères presque rien n'a encore été démontré quant à la présence et surtout à la fonctionnalité des « rafts » dans les ovocytes et autres cellules du follicule ovarien. Ce mémoire présente une étude des « lipid rafts » des ovocytes, des cellules de la granulosa et des complexes ovocyte-cumulus porcins. / Nowadays, plasma membrane is perceived as a mosaic of micro-domains called lipid rafts. Because of their enrichment in cholesterol and sphingolipids, these domains are less fluid than the bulk membrane. Only a few proteins partition into lipid rafts, but most of these are implicated in cell signalling. For this reason, lipid rafts are considered as platforms for cell signalling. Most of the investigations performed on female gametes were realised on Xenopus eggs, but not much as been done yet to assess the presence and especially the functionality of lipid rafts of the oocytes and other cell types of the mammalian ovarian follicle. The present study investigates the presence and the functionality of lipid rafts in porcine oocytes, granulosa cells and cumulus-oocyte complex.

Les compétences uniques que possède l'ovocyte sont assurées par les facteurs maternels, synthétisés et stockés dans l'ovocyte au cours de sa croissance. Ces derniers sont nécessaires à la reprise de la méiose, au déclenchement des premières mitoses et à l'activation du génome embryonnaire. Ce projet de recherche vise à identifier les gènes spécifiques à l'ovocyte conservés au cours de l'évolution qui sont impliqués dans les mécanismes moléculaires responsables du potentiel de développement unique à l'ovocyte. La première étape de ce projet consiste en l'identification des gènes spécifiques à l'ovocyte chez la souris, le bovin et Xenopus laevis. Afin de répondre à cet objectif, la technique des librairies soustractives et la technologie des microarrays d'ADNc ont été utilisés. Par la suite, une analyse comparative du transcriptome ovocytaire du bovin, de la souris et de Xenopus laevis a permis d'identifier les gènes spécifiques à l'ovocyte et conservés au cours de l'évolution. En premier lieu, une lame de microarray d'ADNc multi-espèces spécifique à l'ovocyte a été construite à partir de transcrits dérivés de librairies soustractives enrichies de gènes spécifiques à l'ovocyte. Par la suite, une lame de microarray d'oligonucléotides contenant plus de 20 000 transcrits dérivés de librairies d'ovocytes, d'embryons et de cellules souches de souris a été utilisée afin d'effectuer des hybridations inter-espèces avec des ovocytes de bovin et de Xenopus laevis. Les résultats de ces expériences ont permis de démontrer qu'il existe un degré de conservation très élevé parmi les gènes exprimés dans les ovocytes des trois espèces. Finalement, l'analyse globale du profil d'expression des gènes exprimés au cours du développement embryonnaire in vivo chez le bovin a été effectuée. Cette étude a permis de comparer les gènes d'origine maternelle à ceux du génome embryonnaire afin de déterminer l'importance des ARNm présents à ces stades. Les résultats présentés dans le cadre de cette thèse démontrent que l'étude du transcriptome ovocytaire et embryonnaire ainsi que les analyses comparatives permettent l'identification de gènes spécifiques à l'ovocyte conservés au cours de l'évolution. La caractérisation éventuelle de ces gènes permettra ainsi l'avancement de nos connaissances concernant les mécanismes moléculaires uniques à l'ovocyte.

L’amélioration des performances de reproduction des poissons d’élevage nécessite de déterminer les facteurs intrinsèques et extrinsèques influençant la qualité des gamètes d’une part, et de définir des paramètres fiables permettant de prédire les performances de reproduction d’autre part. Notre objectif est donc de comprendre le déterminisme multifactoriel de la reproduction chez la perche commune, Perca fluviatilis. Quatre facteurs nutritionnels (type d’aliment et taux de rationnement distribués lors des phases d’induction et de vernalisation) et 3 facteurs populationnels (poids initial, origine géographique, niveau de domestication) ont été testés. Une différence de réponse entre les sexes a été observée. Le type d’aliment distribué en vernalisation et le poids initial ont modifié l’état général des femelles. Les mâles ont plutôt été sensibles aux taux de rationnement et à l’origine géographique. L’étude des performances de reproduction a montré que le taux de ponte était sous l’influence de l’interaction entre le type d’aliment distribué en induction et en vernalisation, tandis que l’origine géographique a modulé la date de ponte. La régulation des performances de reproduction est donc un mécanisme complexe sous l’influence simultanée de plusieurs facteurs. La seconde partie de ce travail concerne la recherche de marqueurs prédictifs de la qualité des ovules. Nous avons d’abord montré que peu de paramètres morpho-anatomiques des pontes ou ovules sont des prédicateurs fiables. Cependant, l’analyse protéomique a permis de mettre en évidence plusieurs protéines exprimées différemment selon la qualité des pontes, pouvant jouer le rôle de biomarqueurs de qualité des ovules / Improving fish reproduction in breeding conditions implies to understand intrinsic and extrinsic factors influencing gametes quality on the one hand and to define relevant parameters allowing the prediction of fish reproductive performance on the other hand. Our goal was thus to understand the multifactorial determinism of the common perch (Perca fluviatilis) reproduction. Four nutritional factors (type of food and rate of rationing used either during the induction or vernalization phases) and 3 populational factors (initial weight, geographic origin and domestication level of breeders) have been tested. Data show different responses between females and males. type of food during wintering phase and initial broodstock weigh modified female condition. Males have been sensitive to rationing during wintering phase as well as geographical origin. Data show also that spawning rate was under the influence of interaction between kind of food during wintering phase and induction whereas geographical origin modulated the spawning date. The regulation of the performance reproduction is also a complex mechanism influenced by several factors. The second part of this work consisted on the research of parameters potentially predictive of ova quality. Firstly, our work shows that morphometric parameters measured before the fertilization are poorly relevant to predict reproductive performance. However, the proteomic analysis of several spawn allowed us to highlight proteins differently expressed according to the spawn quality, such proteins could be ova quality biomarkers

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Pas de résumés / No abstract

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

L’objectif de cette thèse a été de comprendre deux caractéristiques majeures des divisions méiotiques chez la femelle: le blocage en prophase de 1ère division méiotique qui permet à l’ovocyte d’accumuler des réserves énergétiques et des déterminants nécessaires au développement embryonnaire ; et l’absence de phase-S entre les deux divisions méiotiques ce qui permet de former des cellules haploïdes aptes à la fécondation. Pour cela, j’ai choisi comme modèle d’étude l’ovocyte de Xénope qui permet de suivre ces processus in vitro en réponse à la progestérone. L’ovocyte subit les deux divisions méiotiques grâce à l’activation du facteur universel de la division cellulaire, le MPF, et se bloque en métaphase de 2ème division méiotique dans l’attente d’être fécondé. Chez tous les vertébrés, le 1er arrêt en prophase dépend de l’activité de la protéine kinase dépendante de l’AMPc, PKA, dont l’inactivation est nécessaire pour la reprise de la méiose. Le substrat de PKA dans l’ovocyte était resté inconnu. Nous avons découvert que la protéine Arpp19, jusqu’alors connue pour son rôle positif dans l’activation du MPF, est phosphorylée par PKA de cette phosphorylation bloque l’activation du MPF nécessaire pour la levée du blocage en prophase. ARPP19 possède donc un double rôle, le 1er exercé comme substrat de PKA et responsable de l’arrêt en prophase, le second dans l’activation du MPF suite à un changement dans sa phosphorylation. Dans un second temps, nous avons étudié la protéine Cdc6, un acteur majeur de la réplication de l’ADN. Absente en prophase, Cdc6 s’accumule entre les deux divisions méiotiques ce qui permet à l’ovocyte d’acquérir la compétence à répliquer l’ADN. Cette compétence ne s’exprime pas ce qui permet de réduire de moitié la ploïdie. Nous avons montré que Cdc6 est un inhibiteur puissant du MPF capable de bloquer les divisions méiotiques et d’induire la réplication de l’ADN. Pour éviter ces effets délétères l’accumulation de Cdc6 est strictement régulée lors des deux divisions méiotiques, ce qui est absolument requis pour assurer l’enchainement des deux divisions cellulaires sans phase-S intercalaire. / The goal of my PhD project was to understand two main features of the female meiotic division: the arrest in prophase of the 1st meiotic division that allows the accumulation of nutrients and determinants necessary for the embryonic cell cycles; and the absence of S-phase between the two meiotic divisions in order to produce haploid gametes. For this purpose, I studied Xenopus oocytes, a powerful model system that allows the biochemical analysis of these two processes in vitro. In ovary, oocytes are arrested in prophase I and resume meiosis in response to progesterone. The oocytes then proceed through the 1st and the 2nd meiotic divisions and halt at metaphase II, awaiting for fertilization. These two consecutive divisions are controlled by two waves of Cdk1 activation, the universal factor responsible for the entry into mitosis. I analysed the mechanisms responsible for arresting the oocyte in prophase I. In all vertebrates, this arrest depends on a high activity of the cAMP-dependent protein kinase, PKA, whose downregulation is required for the release of the prophase block. The substrate of PKA had never been identified up to date. I discovered that the small protein Arpp19, already known for positively regulating entry into M-phase, is phosphorylated by PKA in prophase I and is dephosphorylated upon progesterone addition, an event required for Cdk1 activation. Hence, Arpp19 has a dual function, responsible of the prophase arrest as a PKA substrate, and then converted into an activator of Cdk1 by changes of its phosphorylation pattern. The second part of my thesis has been dedicated to understanding the role and the regulation of the Cdc6 protein during meiotic divisions. This protein is essential for DNA replication in somatic cells. It is accumulated between the two oocyte meiotic divisions and restores the competence to replicate DNA in oocyte. However, this competence is repressed before fertilization, allowing formation of haploid cells. I found that the accumulation of Cdc6 is tightly controlled during meiotic maturation by the Cyclin B accumulation and the Mos/MAPK pathway. I further demonstrated that Cdc6 is a strong inhibitor of Cdk1 in Xenopus oocytes and that the timely accumulation of Cdc6 is required to coordinate the two meiotic divisions with no intercaling S-phase.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Durant sa croissance, l’ovule entrepose des organelles, des protéines et des ARNm dits maternels qui permettront de supporter les premières étapes du développement embryonnaire dans le but primordial d’activer le génome embryonnaire. Un ovocyte capable de supporter cette étape est dit compétent au développement embryonnaire. Le premier objectif avait pour but de déterminer des populations d’embryons ayant différents niveaux de compétence au développement. Le développement d’une nouvelle approche, la triple sélection consiste à utiliser en même temps deux caractères reliés à l’ovule tels que la taille d’origine de son follicule et la morphologie de son complexe cumulus-ovocyte, et un caractère relié à l’embryon, soit le temps du premier clivage. Les différentes populations générées par la sélection permettront ainsi la recherche des facteurs de compétence au développement. Le deuxième objectif avait pour but de connaître le protéome traduit de la traduction des ARNm maternels lors du développement embryonnaire, ainsi que de connaître les besoins constants en protéines de l’embryon, mais également de l’ovocyte, soit les protéines "housekeeping" maternels. Cette expérience a démontré clairement que suite à la reprise de la méiose (Coenen et al., 2004) et ensuite de la fécondation, la traduction des ARNm maternels présente un continuum d’évènements qui mène à l’activation du génome embryonnaire. Malgré un réservoir commun d’ARNm, les besoins lors de la maturation de l’ovocyte et lors du développement de l’embryon sont loin d’être les mêmes. Seulement une cinquantaine de protéines sont communément traduites lors de ces deux évènements cellulaires. Onze de ces protéines ont été identifiées : les protéines de choc thermique 71 et 70, la cyclophiline A (2 fois), la glutathione-S-transférase mu 5, la protéine épithéliale liant les acides gras, la 2,3-biphosglycérate mutase, la sous-unité epsilon TCP-1 de la chaperonine, l’ubiquitine carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1, l’enzyme conjuguant l’ubiquitine E2D3 et l’isoforme alpha et gamma de l’actine. Le troisième objectif avait pour but de déterminer des facteurs de compétence au niveau de l’embryon à 2-cellules basé sur les populations observées lors de la triple sélection. Nous ii avons compris la traduction des ARNm maternels dans les embryons incompétents au développement. Ces derniers présentent une traduction basale des ARNm maternels, tandis que les plus compétents présentent bon nombre de protéines exclusives qui représentent des facteurs de compétence potentiels. Afin d’identifier ces facteurs de compétence, nous avons pu observer que les protéines traduites lors du développement embryonnaire ne sont que transitoires, observation supportée également par la seconde expérience. Les protéines ne s’accumulent pas dans le cytoplasme rendant ainsi leur identification très difficile. Malgré tout, six protéines ont été identifiées: la thiolase cytosolique, l’isocitrate déshydrogénase, la peroxiredoxine 6, la sous-unité alpha du proteasome-6 et la thiamine triphosphatase. Deux protéines « housekeeping » d’origine maternelle découvertes durant l’expérience précédente sont également moins présentes dans les embryons non compétents. De ces expériences de protéomique a découlé une nouvelle méthode de confirmation de l’identification des protéines, la confirmation in silico. Le génome et le protéome de Bos taurus étant limité, l’identification de nos protéines a souvent été faite soit chez d’autres espèces ou uniquement à partir de fragments d’ADN des banques de EST de Bos taurus. Cette méthode permet donc de reconstruire le messager bovin, d’en traduire la protéine bovine, d’identifier le patron peptidique théorique et de le comparer à nos résultats de séquençage, augmentant ainsi le recouvrement de notre protéine. En conclusion, la protéomique de la compétence au développement de l’ovocyte bovin a permis l’identification de candidats qui comparativement à la génomique sont plus restreints. Une nouvelle méthode a découlé de ces expériences. La confirmation in silico permet maintenant la confirmation des protéines identifiées sans utilisation de matériel supplémentaire. / During the growth and the maturation of the oocyte, organelles, proteins and mRNA known as maternal are stockpiled in order to prepare and supply material to the developing embryo in the main goal to activate the embryonic genome. An oocyte that is able to supply to this step is called developmental competent. The objective of the first experiment was to determine an embryos population with different level of developmental competence. The triple selection lies in two characters related to the oocyte, which are the follicular size and the morphology of the COC and one is related to the embryo, which is the time of first cleavage post insemination. The different population generated by this selection has provided a population highly competent to development and a population lacking developmental competence that will be useful for the study of developmental competence. The objective of the second experiment was the study of the proteomic of the translated maternal mRNA during the early embryo development. We wanted to know which proteins play the role of maternal housekeeping proteins during oocyte maturation and early embryo development. This experiment has clearly demonstrated that when the oocyte resume meiosis (Coenen et al., 2004) and after fertilization, the translated protein pattern follows a continuum events which conducts embryo to his activation. Although they are supply by the same reservoir of mRNA, the needs of the oocyte and the embryo are different. Only about fifty proteins are commonly translated during oocyte maturation and early development. Eleven of them have been identified: HSC71; HSP70; CypA (2 times); UCHL1; GSTM5; Cct5; E-FABP; 2,3-BPGM, ubiquitin-conjugating enzyme E2D3; and β- actin/γ-actin. The third experiment consists of the discovery of factors related to developmental competence. Three populations from the triple selection with high, low and developmental competence was compared by a proteomic study. This study has shown that developmental incompetent embryos translate a minimum of maternal mRNA, which the majority is the embryo housekeeping found in the previous study. Whereas high and low developmental iv competent embryos present shared and exclusive translated proteins, these proteins represent potential factors related to developmental competence. By trying to identify these proteins, we have found that most translated proteins are transient and are not accumulated in the cytoplasm. In spite of this observation, we have identified six proteins: cytosolic thiolase, isocitrate dehydrogenase 1, peroxiredoxin 6, proteasome-α6, hypothetical protein My027 and thiamine triphosphatase. Two maternal housekeeping proteins were also missing for the incompetent 2-cell embryos: UCH-L1 and CypA. From these experiments, a new method of protein identification confirmation, called in silico confirmation, was developed. As the genome and the proteome of Bos taurus is limited, the protein identification was made in foreign species or from Bos taurus EST databases. This method as made possible to rebuilt the bos taurus messager, to translate the bovine protein, find his theoretical peptide mass fingerprint and compare it to the experimental spectrum and thus increase the number of matched peptides. In conclusion, the proteomic study on the developmental competence of the bovine oocyte has identified of a reduce number of candidates compared to genomic studies. A new method has been developed during this work. The in silico confirmation allowed the confirmation of protein identification without additional material.