Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Pas de résumés / No abstract

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

L’objectif de cette thèse a été de comprendre deux caractéristiques majeures des divisions méiotiques chez la femelle: le blocage en prophase de 1ère division méiotique qui permet à l’ovocyte d’accumuler des réserves énergétiques et des déterminants nécessaires au développement embryonnaire ; et l’absence de phase-S entre les deux divisions méiotiques ce qui permet de former des cellules haploïdes aptes à la fécondation. Pour cela, j’ai choisi comme modèle d’étude l’ovocyte de Xénope qui permet de suivre ces processus in vitro en réponse à la progestérone. L’ovocyte subit les deux divisions méiotiques grâce à l’activation du facteur universel de la division cellulaire, le MPF, et se bloque en métaphase de 2ème division méiotique dans l’attente d’être fécondé. Chez tous les vertébrés, le 1er arrêt en prophase dépend de l’activité de la protéine kinase dépendante de l’AMPc, PKA, dont l’inactivation est nécessaire pour la reprise de la méiose. Le substrat de PKA dans l’ovocyte était resté inconnu. Nous avons découvert que la protéine Arpp19, jusqu’alors connue pour son rôle positif dans l’activation du MPF, est phosphorylée par PKA de cette phosphorylation bloque l’activation du MPF nécessaire pour la levée du blocage en prophase. ARPP19 possède donc un double rôle, le 1er exercé comme substrat de PKA et responsable de l’arrêt en prophase, le second dans l’activation du MPF suite à un changement dans sa phosphorylation. Dans un second temps, nous avons étudié la protéine Cdc6, un acteur majeur de la réplication de l’ADN. Absente en prophase, Cdc6 s’accumule entre les deux divisions méiotiques ce qui permet à l’ovocyte d’acquérir la compétence à répliquer l’ADN. Cette compétence ne s’exprime pas ce qui permet de réduire de moitié la ploïdie. Nous avons montré que Cdc6 est un inhibiteur puissant du MPF capable de bloquer les divisions méiotiques et d’induire la réplication de l’ADN. Pour éviter ces effets délétères l’accumulation de Cdc6 est strictement régulée lors des deux divisions méiotiques, ce qui est absolument requis pour assurer l’enchainement des deux divisions cellulaires sans phase-S intercalaire. / The goal of my PhD project was to understand two main features of the female meiotic division: the arrest in prophase of the 1st meiotic division that allows the accumulation of nutrients and determinants necessary for the embryonic cell cycles; and the absence of S-phase between the two meiotic divisions in order to produce haploid gametes. For this purpose, I studied Xenopus oocytes, a powerful model system that allows the biochemical analysis of these two processes in vitro. In ovary, oocytes are arrested in prophase I and resume meiosis in response to progesterone. The oocytes then proceed through the 1st and the 2nd meiotic divisions and halt at metaphase II, awaiting for fertilization. These two consecutive divisions are controlled by two waves of Cdk1 activation, the universal factor responsible for the entry into mitosis. I analysed the mechanisms responsible for arresting the oocyte in prophase I. In all vertebrates, this arrest depends on a high activity of the cAMP-dependent protein kinase, PKA, whose downregulation is required for the release of the prophase block. The substrate of PKA had never been identified up to date. I discovered that the small protein Arpp19, already known for positively regulating entry into M-phase, is phosphorylated by PKA in prophase I and is dephosphorylated upon progesterone addition, an event required for Cdk1 activation. Hence, Arpp19 has a dual function, responsible of the prophase arrest as a PKA substrate, and then converted into an activator of Cdk1 by changes of its phosphorylation pattern. The second part of my thesis has been dedicated to understanding the role and the regulation of the Cdc6 protein during meiotic divisions. This protein is essential for DNA replication in somatic cells. It is accumulated between the two oocyte meiotic divisions and restores the competence to replicate DNA in oocyte. However, this competence is repressed before fertilization, allowing formation of haploid cells. I found that the accumulation of Cdc6 is tightly controlled during meiotic maturation by the Cyclin B accumulation and the Mos/MAPK pathway. I further demonstrated that Cdc6 is a strong inhibitor of Cdk1 in Xenopus oocytes and that the timely accumulation of Cdc6 is required to coordinate the two meiotic divisions with no intercaling S-phase.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La production d'embryons bovins in vitro demeure aujourd'hui moitié moins efficace que le processus in vivo. La réserve de transcrits maternels accumulés par l'ovocyte semble déterminante dans sa capacité à se développer en un embryon viable. Quatre groupes d'ovocytes et de jeunes embryons ont été comparés afin d'isoler des marqueurs potentiels de compétence à partir de leur transcriptome. Chaque groupe a permis d'étudier l'influence d'une caractéristique associée au niveau de compétence : les conditions de la maturation finale, la composition du milieu de maturation, le délai de premier clivage et le diamètre folliculaire. L'utilisation de techniques modernes de biologie moléculaire telles que l'hybridation soustractive suppressive et l'hybridation de biopuces a permis de sélectionner treize candidats potentiels. Après vérification par PCR en temps réel, neuf candidats présentent un niveau d'ARNm associé à la compétence. Leur caractérisation pourrait contribuer à l'enrichissement de nos connaissances sur la qualité ovocytaire.

Les êtres humains et les animaux, principalement ceux habitant le Cercle Arctique, sont constamment exposés à un large éventail de composés chimiques présents dans leur environnement et leur nourriture. Parmi ces polluants, les composés organochlorés sont montrés du doigt depuis quelques décennies comme étant des composés toxiques qui perturbent plusieurs systèmes physiologiques, y compris le système reproducteur. Ces composés se présentent rarement individuellement dans le biote, on les retrouve plutôt sous forme de mixtures complexes, où chaque composé influence les systèmes physiologiques à sa façon, indépendamment ou conjointement avec d’autres composés. Les organochlorés sont présents dans le sang, le lait maternel, le tissu adipeux, les liquides amniotique et séminal, ainsi que dans les fluides ovarien et utérin. C’est dans cette optique que nous avons testé l’hypothèse qu’une mixture d’organochlorés, reconstituée pour imiter celle présente dans la graisse de phoque de l’Arctique que mangent les Inuits du Nunavik, nuit à la compétence à la maturation des gamètes, à la fécondation et au développement in vitro des embryons préimplantatoires, en utilisant l’espèce porcine comme modèle toxicologique pour l’humain. La mixture d’organochlorés a effectivement réduit la compétence à la maturation, fécondation et au développement des ovocytes exposés, ainsi que le développement préimplantatoire des embryons exposés. La fécondation et le développement subséquent ont diminué lors de l’exposition conjointe des gamètes à la mixture. Nous avons aussi utilisé un extrait métabolisé de cette mixture, provenant du sérum de truies préalablement exposées à la mixture originale d’organochlorés, pour vérifier ces mêmes paramètres. L’extrait métabolisé n’a pas eu d’effet sur la maturation des ovocytes, leur compétence à la fécondation et au développement, ou même sur le développement préimplantatoire des embryons exposés. L’extrait métabolisé a par contre réduit l’apoptose des cellules du cumulus. En conclusion, la mixture d’organochlorés, similaire à celle retrouvée dans l’environnement, perturbe les fonctions essentielles des gamètes et des embryons, dommages qui se répercutent sur leurs compétences à la fécondation et au développement. / Human beings and animals, especially those living in the Arctic Circle, are constantly exposed to a wide range of chemical compounds that are present in their environment and food. Among these pollutants, organochlorine compounds are considered as a major group of toxicants that disrupt numerous physiological systems, including the reproductive system. These compounds are rarely present one at a time in the biota; they are mainly present as complex mixtures of different organochlorines, where each compound influences physiological systems in its own way, independently or in concert with other compounds. Organochlorines are present in blood, breast milk, fat tissues, as well as in amniotic, seminal, uterine and ovarian fluids. Therefore, we tested the hypothesis that an organochlorine mixture, reconstituted to mimic that present in the Arctic seal blubber and ingested by the Inuits in Nunavik, disrupts the competence to in vitro maturation, fertilization and development of gametes and embryos, using the pig as a toxicological model for humans. The organochlorine mixture reduced maturation, fertilization and developmental competence of exposed oocytes. It also reduced fertilization and subsequent development of gametes exposed during fertilization, as well as preimplantory development of exposed embryos. We also used a metabolized extract of the same mixture, originating from the serum of sows preexposed to the original organochlorine mixture, to verify the same parameters. The metabolized extract did not reduce oocyte maturation or their competence to fertilization and development; neither did it alter preimplantory development of exposed embryos. Nevertheless, the metabolized extract reduced apoptosis in cumulus cells. In conclusion, the environmentally-relevant organochlorine mixture damages essential functions of gametes and embryos, therefore altering their fertilizing and developmental competence.

Mes travaux explorent, chez la vache, le transfert entre les cellules du cumulus et l’ovocyte des transcrits d’ARN et d’autres larges molécules qui, selon notre hypothèse, pourraient être exportées des cellules somatiques à l’ovocyte, ceci afin de soutenir sa maturation. L’étude des projections transzonales (PTZ) reliant les cellules du cumulus à l’ovocyte a révélé qu’elles sont de morphologie irrégulière, qu’elles peuvent contenir des organelles (mitochondries) et des structures cellulaires (ribosomes) et qu’elles se retractent au cours de la maturation ovocytaire. Des microvésicules pouvant transférer de larges molécules ont été identifiées à la jonction entre les cellules. Pour déterminer si l’ARN est empaqueté préalablement à son transfert entre les cellules, nous avons analysé les transcrits présents dans les PTZ et avons constaté qu’ils se déplacent vers l’ovocyte en maturation. Parmi les transcrits retrouvés dans les PTZ, certains étaient commun à ceux dont l’abondance augmente dans l’ovocyte en cours de maturation de même qu’à ceux retrouvés dans les polyribosomes de l’ovocyte en maturation, suggérant ainsi le transfert et l’utilisation des transcrits provenant des cellules du cumulus. Un transcrit synthétique ajouté aux cellules du cumulus avant qu’elles ne s’attachent à l’ovocyte a été transféré à ce dernier, confirmant ainsi le potentiel des cellules à transférer des ARNm et possiblement leurs protéins associées à l’ovocyte. Nouse avons observé, sur une échelle de temps, que les transcrits sont accumulés dans les PTZ au cours des heures suivant l’abattage de l’animal, mais préalablement à l’aspiration de l’ovocyte. Le retrait des cellules du cumulus et de cette période d’accumulation des transcrits se traduit par un faible taux de maturation des ovocytes. La nécessité d’avoir des vésicules d’ARN transférées à l’ovocyte a été testée grâce à des inhibiteurs de la synthèse d’ARN, de son transport et de la formation des vésicules. L’inhibition de chacune de ces étapes a compromis la maturation des ovocytes. En se penchant sur les mécanismes impliqués dans le transfert des transcrits, nous avons découvert un candidat potentiel jouant un rôle dans l’insuffisance ovarienne précoce. Cette protéine liant les ARNm, Fragile X mental retardation (FMRP), a été retrouvée dans les cellules folliculaires et dans l’ovocyte tout au long de la folliculogenèse et de l’ovogenèse. Nous avons constaté que FMRP s’associe à la machinerie traductionnelle et aux protéines des granules d’entreposage dans l’ovocyte. L’inhibition de la protéine a significativement réduit le taux de blastocyste. En démontrant que des transcrits exogènes contribuent au développement de l’ovocyte et influencent sa maturation, nos recherches ajoutent un niveau de compréhension additionnel aux mécanismes de communication intercellulaire menant à la production de gamètes de bonne qualité. De futures expériences axées la caractérisation du transfert des transcrits et des mécanismes spécifiques en jeu contribuera à accroître notre compréhension de la compétence ovocytaire. / The reports in this thesis explored the potential for large molecule communication between the cumulus cell and the oocyte hypothesizing that large molecules, including RNA, could be transferred to the oocyte for support during maturation. Exploration of the transzonal projections (TZPs) connecting the cumulus cells to the oocyte revealed that they are irregular in shape, can contain large organelles (mitochondria) and small cellular structures (ribosomes), and that these connections retract during oocyte maturation. Microvesicles were identified at the intercellular articulations capable of sharing large molecules between the cells. To determine if RNA is transferring as cargo between cells, nascent as well as total transcripts were evaluated in the TZPs and found moving towards the oocyte during maturation. Of the transcripts found in the TZPs during maturation, some were common to those increasing in abundance in the oocyte during maturation, and on the polyribosomes of the maturing oocyte, thus suggesting transfer and use of cumulus cell transcripts. A synthetic transcript provided to some cumulus cells for reconstruction with, and transfer to the oocyte, confirmed the potential to transfer mRNA and possibly proteins. Temporally, RNA transcripts were found to accumulate in TZPs during the hours post slaughter but prior to oocyte aspiration. Removal of the cumulus cells and this period of accumulation resulted in poor oocyte maturation. The requirement of vesicle mediated RNA transfer to the oocyte was tested. Inhibitors against RNA synthesis, transport, and vesicle formation were explored and found to reduced oocyte maturation. Focusing on mechanisms that could mediate transference, we assessed an RNA binding protein candidate with implications in premature ovarian insufficiency. Fragile X mental retardation protein (FMRP) was found in follicular cells and the oocyte throughout folliculogenesis and oogenesis. Based on known roles in translation control, FMRP was shown associated with translational machinery and storage granule proteins in the oocyte. Knockdown of this protein resulted in compromised rates of blastocyst formation. Knowing that exogenous transcripts contribute to oocyte development, and influence the molecular aspects of oocyte maturation adds another layer to our understanding of intercellular communication in the production of a healthy gamete. Future characterization of the transferred transcripts and the mechanisms in control of this process will improve our understanding of oocyte health and competence.

L'objectif de mon travail de doctorat consistait à explorer l'expression génique du cumulus au regard de la compétence au développement de l'ovocyte bovin. Cette exploration tire son intérêt des nombreuses démonstrations du rôle crucial du cumulus auprès de l'ovocyte mammalien. En premier lieu, nous avons appliqué à des vaches de race laitière, un protocole de stimulation ovarienne permettant la modulation de la compétence ovocytaire, en agissant sur la différenciation folliculaire, via l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Trois variantes de la compétence développementale de l'ovocyte ont ainsi pu être obtenues : acquisition de compétence en cours, compétence acquise et déclin de compétence. En dépit des différences modérées de compétence engendrées, le transcriptome des cellules du cumulus les reflète quand même. Ces variations bien que minimes, de l'expression génique du cumulus, appuient l'idée générale que la compétence ovocytaire serait le résultat non seulement de changements substantiels par l'environnement, mais aussi d'une régulation beaucoup plus fine des mécanismes folliculaires.Suite aux résultats de la première étude, nous avons voulu obtenir un portrait transcriptomique du cumulus plus contrasté. Pour ce faire, des biopsies de cumulus ont été réalisées sur des complexes ovocyte-cumulus (COC) d'abattoir suivis individuellement, de leur maturation à leur développement in vitro, et catégorisés selon que le développement ce soit arrêté à 2-8 cellules – i.e. avant l'activation du génome embryonnaire – ou qu'il se soit poursuivi jusqu'au stade de blastocyste. De cette manière, les cumuli associés à la formation d'un blastocyste, et donc à des ovocytes compétents, montrent une expression génique clairement différente de ceux dont le développement embryonnaire a échoué. Ces différences concernent des fonctions telles que : la modification post-traductionnelle, le repli des protéines, le métabolisme des acides aminés, la dégradation des protéines ou encore l'épuration des radicaux libres qui se trouvent surexprimées dans les cumuli compétents. Dans un troisième temps, c'est l'implication de l'hormone lutéinisante (LH) dans l'expression génique du cumulus qui a été évaluée. Le même protocole que celui de la première étude a été appliqué, en rajoutant cette fois des injections de Cétrorelix afin de supprimer la sécrétion de LH en fin de croissance folliculaire – i.e. lors de l'acquisition de la compétence au développement. Bien que l'absence de LH n'ait pas eu d'impact significatif sur la compétence ovocytaire, le transcriptome du cumulus a lui été significativement affecté. Ainsi, l'expression de fonctions comme la survie, la prolifération ou la croissance du follicule est inhibée par l'absence de LH. Par ailleurs, des fonctions de maintenance cellulaire telles que la transcription, le métabolisme des acides aminés et des protéines, ainsi que la production d'énergie semblent également pâtir de cette absence. Le soutien de la LH serait donc important pour les fonctions du cumulus lors de la maturation finale du follicule. Finalement, la présence du récepteur à la LH (R-LH) dans le cumulus bovin étant controversée dans la littérature, nous avons cherché à suivre l'expression génique de ce R-LH dans les cellules de COC en cours de maturation in vitro. Nous avons également examiné l'expression de la mévalonate kinase (MVK), dont le transcrit est reconnu en tant que régulateur de l'expression du R-LH ; et aussi surveillé l'expression de différentes enzymes stéroïdogènes ainsi que celle du récepteur à la progestérone (PGR). Le suivi d'expression génique a été réalisé à intervalles de trois heures, de 0 à 24 h de maturation, et n'a pour autant pas permis de détecter la présence de transcrits du R-LH dans le cumulus, tandis que l'expression génique de la MVK augmente au cours de la maturation. Les transcrits des enzymes stéroïdogènes STAR et HSD3β, bien que faiblement exprimés, ont été retrouvés ; et l'expression de CYP11A1 et PGR quant à elle augmente pendant la maturation. Ainsi, d'une part, la supplémentation en LH des milieux de maturation ne semble pas pertinente chez le bovin ; d'autre part, le cumulus pourrait être capable d'utiliser le cholestérol pour la stéroïdogenèse et de répondre à une stimulation par la progestérone puisqu'il en exprime le récepteur. Ces travaux participent ainsi à accroître la connaissance du transcriptome spécifique au cumulus bovin et son lien avec la compétence ovocytaire au développement. Enfin, les données acquises ici offrent de nouvelles pistes à explorer afin d'améliorer la qualité ovocytaire, tant in vitro qu'in vivo. / In this thesis report, the cumulus cell gene expression regarding oocyte developmental competence was explored in bovine. This interest is based on the proven crucial role in the differentiation of the cumulus to the mammalian oocyte. First, we applied an ovarian stimulation protocol to dairy cows which allows modulation of oocyte competence using FSH to influence follicular differentiation. Then, three oocyte competency states were obtained: increasing competence, competence acquired and decreasing competence. In spite of moderated competency fluctuations, cumulus cell transcriptome still reflects them. The small variations in cumulus gene expression reinforce the general idea that oocyte competence is the result not only of substantial changes due to the environment, but also of a much finer regulation of follicular mechanisms. Following the results of the first study, we wanted to obtain a more contrasted transcriptomic picture of the cumulus. To do so, cumulus biopsies were performed on slaughterhouse cumulus-oocyte complexes (COC) monitored individually, from their maturation to their in vitro development, and categorized according to whether the development was stopped at 2-8 cells – i.e. the embryonic genome activation – or continued until the blastocyst stage. In this way, the cumuli associated with a blastocyst formation, and therefore with competent oocytes, show a clearly different gene expression from those whose embryonic development has failed. These differences concern functions such as: posttranslational modification, protein folding, amino acid metabolism, protein degradation or free radical scavenging that are over-expressed in competent cumuli. Thirdly, we evaluated the involvement of luteinizing hormone (LH) in cumulus gene expression. The same protocol as that of the first study was applied, with the addition of Cetrorelix injections in order to suppress the LH secretion at the end of follicular growth – i.e. during developmental competence acquisition. Although the absence of LH did not impacted significantly on oocyte competence, the cumulus cell transcriptome was significantly affected. Thus, the expression of functions such as survival, proliferation or follicular growth is inhibited in the absence of LH. In addition, cell maintenance functions such as transcription, amino acid and protein metabolism, and energy production also seem to suffer from this absence. LH support would therefore be important for cumulus functions during the final maturation of the follicle. Finally, because of the controversy found in literature concerning the presence of the LH receptor (LH-R) in bovine cumulus, we sought to follow the gene expression of this LH-R in in vitro maturing COC cells. Also, we examined the expression of mevalonate kinase (MVK), whose transcript is recognized as a regulator of R-LH expression; and monitored the expression of various steroidogenic enzymes as well as that of the progesterone receptor (PGR). Gene expression observation was performed every 3 hours, from 0 to 24 h of maturation, and did not allow the detection of any R-LH transcripts in the cumulus, while MVK gene expression increases during maturation. The transcripts of the STAR and HSD3β steroidogenic enzymes were found, although weakly expressed; and the expression of CYP11A1 and PGR increases during maturation. Thus, on the one hand, LH supplementation of maturation media does not seem relevant in cattle; on the other hand, cumulus may be able to use cholesterol for steroidogenesis and to respond to a progesterone stimulation since it expresses its receptor. This work thus contributes to increase knowledge of the bovine cumulus transcriptome and its link with oocyte developmental competence. Finally, the data acquired here offer new avenues to explore in order to improve oocyte quality, both in vitro and in vivo.